婴幼儿轮状病毒感染性腹泻病原学快速诊断

【摘要】轮状病毒（rotavirus，RV）是引起全球范围内婴幼儿急性腹泻的主要病原之一，根据其VP6的抗原性，目前将RV分为A~G 7个组：其中A组RV是秋冬季婴幼儿腹泻的最重要病原；B组RV由我国洪涛等发现，主要感染青壮年；C组RV主要感染青少年。本文对轮状病毒感染性腹泻的病原学诊断技术，包括电镜、免疫电镜、免疫血清型检测，以及现代分子生物学基因扩增和基因测序鉴定等新技术作一简要概述。

【关键词】婴幼儿腹泻；轮状病毒；病原学快速诊断

小儿腹泻病是儿科常见的一组由多病原微生物引起的胃肠道感染性疾病，是5岁以下儿童死亡的一个常见原因。据WHO统计，上世纪80年代，5岁以下小儿每年有10亿患腹泻，导致500万小儿死亡[1]；自2005~2015年，因腹泻死亡的人数估计下降了20.8%，每年仍有49.9万例死亡。轮状病毒是腹泻死亡的主要原因（199,000例，95% UI 165,000-241,000例），其次是志贺氏菌（164,300例）和沙门氏菌（90,300例）[2, 3]。腹泻在第三世界许多国家是小儿死亡的第一位原因，在我国小儿多发病中居第二位[4]。

小儿腹泻的病原十分复杂, 有细菌、病毒和寄生原虫等多种病原微生物。据我国腹泻病协作组对5岁以下小儿急性腹泻的病原流行病学调查, 引起小儿腹泻的主要病原是致病大肠埃希菌（Diarrheogenic Escherichia Coli，DEC）和轮状病毒（Rotavirus，RV）[5]，其次为志贺氏菌（Shigella）、空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）、沙门氏菌（Salmonella）和小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）。此外, 一些条件致病菌如变形杆菌（Proteus）、气单胞菌（Aeromonas）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和真菌（Fungus）等亦可引起小儿腹泻[6, 7]。关于小儿腹泻的病原学诊断，已由传统的细菌培养，发展到如今广泛应用的酶联免疫、荧光免疫、放射免疫、乳胶凝集、单克隆抗体技术、基因探针杂交和PCR技术等，用于临床和病原流行病学调查[8, 9, 10]。

轮状病毒（rotavirus，RV）是一种双链核糖核酸病毒，属于呼肠孤病毒科（Reoviridae），轮状病毒属（Rotavirus），根据VP6的抗原性，目前将其分为A、B、C、D、E、F、G 7个组。是世界范围内人和动物急性腹泻的主要病原之一。其中，A组是秋冬季婴幼儿腹泻的最重要病原，在发展中国家, 每年约有87万儿童死于轮状病毒感染；B组RV由我国洪涛等发现, 主要感染青壮年，在我国曾造成大规模暴发性腹泻流行[11, 12]；C组RV主要感染青少年,引起散发流行。（1）轮状病毒致病性：RV经粪-口途径传播，感染小肠连结的肠黏膜细胞（enterocyte）并且产生肠毒素（enterotoxin），引起肠胃炎，导致严重的腹泻[13, 14]。RV每年在秋冬季流行，临床表现为急性胃肠炎，呈渗透性腹泻病，病程一般为6~7d，发热持续1~2d，呕吐2~3d，腹泻5d，严重的出现脱水症状，有时甚至会因脱水而导致死亡，特别是在发展中国家更是如此。（2）轮状病毒形态特征：轮状病毒为球形、无囊膜、有宽壳盖、短幅和薄边的双股RNA病毒，病毒颗粒直径70~75nm，由双层壳膜构成。病毒体中心是直径为36-45nm的致密核心，含病毒核酸，排列不规则，呈蜂窝状。外面双层多肽衣壳呈轮缘状围绕着内层，内衣壳的壳微粒沿着病毒体边缘呈放射状排列，形同车轮辐条，使病毒外观酷似车轮[15]。轮状病毒有两种形态，即双壳颗粒和单壳颗粒：前者是成熟病毒颗粒或完整病毒颗粒，具有完整的核衣壳，有感染性，又称L毒粒；后者因在自然条件下失去其外壳，形成粗糙的单壳颗粒，直径只有50~60nm，无感染性，称D颗粒。轮状病毒在电镜下还可看到晶格状的病毒亚单位结构，病毒外面两层核衣壳为20面立体对称，每面由13个壳粒组成。完整病毒颗粒外层光滑，表面上有60个12nm的穗状突起，系VP4的二聚体。3层衣壳从外到内依次为VP7、VP6和VP4。核心内还有VP3、VP1和一些非结构蛋白[16, 17]。（3）轮状病毒基因组：RV为双股RNA，由11个片段组成，位于病毒核衣壳内。基因序列中富含A和T，A+T比值达58%~67%，与大多数真核细胞和病毒不同。5’和3’端序列高度保守，可能涉及病毒基因转录、复制或装配。11个基因片段分别编码11种蛋白质，6种结构蛋白，5种非结构蛋白[18, 19]。VP1~3是病毒核心的结构蛋白，VP4、VP6和VP7是核衣壳上的结构蛋白。VP6含有血凝素，是病毒吸附到宿主细胞受体的结合蛋白，决定病毒的毒力；VP7是病毒的主要中和性抗原。轮状病毒在体外难以培养，在一般组织培养中不适应，需选用特殊的细胞株培养（如恒河猴胚肾细胞MA104株）。

一、轮状病毒实验室诊断常用技术方法

1. 电子显微镜（electron microscope）：是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器，电子显微镜的分辨能力以它所能分辨相邻两点的最小间距来表示。20世纪70年代，透射式电镜的分辨率约为0.3nm（人眼的分辨本领约为0.1mm）。现在电镜最大放大倍率超过300万倍，而光学显微镜的最大放大倍率约为2000倍，所以通过电镜能直接观察到病毒形态学的显微结构。电镜的分辨本领虽已远胜于光学显微镜，但电镜需在真空条件下工作，所以很难观察活的生物。

2. 电镜在轮状病毒快速检测中应用：RV感染性腹泻急性期患儿的粪便中含有大量RV，因此，用电镜检查急性期粪便是诊断RV胃肠炎的常用方法[20]，采集急性期患儿粪便标本于无菌容器中送检。（1）低速离心粗提电镜检测法：取患儿粪便5ml，4000r/min离心30min，取上清液10000r/min 30min，除菌、去渣，取上清加等量三氯甲烷，振摇20min，4000rpm离心30min，去脂，重复一次，取上清液滴网，负染，电镜观察，此法简便易行，但检出阳性率较低。（2）低速离心氯仿脱脂法：粪便经低速离心后，取上清液并按10%浓度加入聚乙二醇-6000，使之溶解，4℃过夜，再行低速离心，去上清液，将沉淀溶解于0.05mol/L，pH7.4 Tris-HCl buffer中，加氯仿振摇脱脂，再离心后取上层水溶液，加聚乙二醇-6000。离心后，将沉淀重悬于1~2mL上述缓冲液中，滴膜、负染，作电镜检查。黑龙江省CDC用此法使轮状病毒检出率达66.7%，但操作繁琐。（3）分级离心沉淀法：粪便经低速离心除去粪渣和细菌后，取上清液再以30000~50000rpm离心1.5h，将沉淀重悬于蒸馏水中，滴膜、负染并作电镜观察，此法能浓集粪便中的轮状病毒，故阳性率高。在轮状病毒胃肠炎流行季节，约50%腹泻患儿的粪便中可检出轮状病毒。超速离心法，将上述电镜轮状病毒阳性标本经32000rpm离心60min，加适量PBS悬浮沉淀物，作免疫电镜抗原。（4）粪便沉淀包埋切片法：粪便经低速离心后，取沉淀加1%戊二醛固定，用palada缓冲液浸洗并用1%锇酸固定，再经脱水，进行包埋、超薄切片及电镜观察。中国医学科学院病毒研究所用此法将轮状病毒检出率提高到84.9%。（5）免疫电镜：用粪检阳性患儿的恢复期血清1:50稀释，经低速离心后，取上清液0.1ml加抗原0.1ml混合，37℃ 1h，于4℃冰箱过夜，取出经34000rpm离心90min，加适量双蒸水悬浮沉淀物，滴膜、负染、电镜观察。（6）形态特征：在电镜下观察轮状病毒呈球形，直径65~75nm，根据其不同形态可分为粗糙形大颗粒，有完整衣壳的空心颗粒，实心颗粒，以及小颗粒等。双层衣壳中央有电子致密的呈六角形核心，周围环绕一层电子透明层，子粒由此向外呈辐射状排列构成内核壳，为轮辐，外核壳为辋，构成车轮状特征（图1）。

图1. A组：婴幼儿腹泻轮状病毒电镜观察形态特征

图2. B组：成人腹泻轮状病毒（ADRV）电镜图

尽管制备电镜检查标本比较容易，但粪便中必须有足够量的轮状病毒才能用电镜检出。在粪液中病毒颗粒小于106/mL时，用电镜不易检出；若粪液标本含病毒颗粒达108/mL，则可迅速作出诊断。电镜检查需要昂贵仪器，费时，使应用受到一定限制。但若用电镜检查腹泻粪便，除能检出轮状病毒外，还能检查其它病毒[21]。故电镜检查仍有一定实用价值。

二、RV-RNA聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

标本采集与婴幼儿急性腹泻粪便标本送检

1. 试验方法：（1）RNA提取：粪便标本用0.5mol/L pH7.2 PBS配制成50%悬液，取0.5mL于塑料离心沉淀管中，加10%SDS（十二烷基硫酸钠）30µL，于56℃水浴30min，加TSE饱和酚0.3mL，氯仿-异丙醇（21:1）0.2mL混合振荡2min，离心沉淀4000rpm 10min，取上层清液于另一离心管中56℃加热2min，即可作RNA电泳样品。（2）PAGE板制配：垂直板式电泳槽（北京六一仪器厂），玻璃板2块，塑料夹条和梳子等器具洗净擦干，将玻板嵌入夹条内，两玻板上限高度差1.5cm，夹层厚度1mm，装上前后电泳槽，螺丝固定。用1%琼脂糖（加热熔化）封固夹层3边，待凝固后于两层玻板间加下层胶（分离胶）至距上端2cm处，上加少许蒸馏水以隔绝空气，平置室温30min左右，待分离胶凝固后倒去水，用滤纸吸干，再加上层胶（浓缩胶），立即插入梳子，置室温1h，待凝固后拔出梳，即可作电泳。凝胶配制见附表。

附表. 凝胶的配制

注：*30%~0.8% 凝胶液：丙烯酰胺30g、N·N-甲叉双丙烯酰胺0.8g加H2O至100mL。

（3）电泳：于前后电泳槽中加入电泳缓冲液（0.025mol/L Tris/0.192mol/L甘氨酸，pH8.5），用微量加样器吸取RNA样品20µL，加入样品凹槽中，接通电源，前槽接负极，后槽接正极。开动电泳仪，调节电流强度至20mA，稳定10min，然后调至30mA恒定电流，随电泳时间延长，电压由40V逐渐上升至50V，中止电泳，时间约2~3h。（4）银染色法：取出电泳凝胶板，切除浓缩胶部分，置一大平皿中，加0.01mol/L AgNO3溶液，于37℃水浴染色30min，水洗3次，加显色剂（NaOH 3.0g，35%甲醛0.5mL，H2O加至100mL），显色6~10min，病毒阳性者显出棕褐色RNA区带，水洗1次，加停显液（6%冰醋酸）约30min，中止反应，取出浸泡在固定液中（10%乙醇-0.5%冰醋酸溶液）保存。（5）观察结果：PAGE电泳可将RV进行分型检测：① A组轮状病毒：RNA-PAGE电泳图可见11条RNA基因区带，分4组，其排列顺序为：I组4条，2组2条，3组3条，4组2条。不同型别的RV第1、2、3组RNA区带基本一致，唯第4组2条RNA区带按电泳迁移速率不同，把RV分为2个亚群：亚群I（S型：短电泳型）第10、11段泳动较近；亚群II型：长电泳型）第10、11片段泳动较远[22, 23]。② B组轮状病毒（成人腹泻轮状病毒）：大便标本中分离的新轮状病毒基因组电泳分析，同样含有11个RNA片段，其分子量分布范围与典型轮状病毒基本相同，但RNA带分布模式与前描述过的轮状病毒基因组明显不同，第一簇4个片段中除保持1、4分得较开外，不是2、3比较靠近，而是3、4两个片段大小相差很小，只有在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳图上才可分开，第二簇2个片段彼此亦不能较好分开，第三簇7、8、9三个片段彼此分得很开，以至7靠近6，9靠近10，使第三、四簇的区分几乎毫无意义，这与典型轮状病毒7、8、9靠得很近相比是明显不同。第四簇2个片段分得较开，跑得较快，属电泳型II（长型）[24]，RV电泳分型见图2。

图2. A组轮状病毒（婴幼儿腹泻）电泳图 B组（成人轮状病毒）电泳图

三、RV-RNA琼脂糖凝胶电泳（改良新法）

1. 标本采集：采取婴幼儿腹泻患儿粪便标本于无菌容器中，送检。

2. RNA提取：同上RV-PAGE所述，现有商售现成RNA提取试剂盒，使用更为方便。

3. 琼脂糖凝胶配制：琼脂糖1.5g，加TAE缓冲液100mL，用玻璃棒搅拌均匀后放入沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖熔化，用合适的样品梳形成加样孔，梳齿的位置应在托盘底面上0.5~1.0mm。待凝胶稍微冷却后，缓慢倒入已用胶带封好的模具中，胶厚度以3~5mm为宜，让凝胶溶液完全凝结，室温下30～45min，再放入4℃冰箱可大大缩短凝结时间。小心拔出梳子，将凝胶安放到电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极，向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm。然后用移液枪将样品加入样品孔内，左右两侧加相应的DNA或RNA分子量标准物。

4. 电泳：RNA向阳极侧泳动，电压1~5V/cm，电泳时间取决于胶的长度、电压和RNA片段大小。凝胶越长，电压越低，RNA片段越大，所需时间就越长。使用高压时，大RNA片段的分辨率低，电泳出的条带不清晰。当RNA样品在凝胶中电泳迁移足够距离时，关闭电源，取出样品胶，放入EB染液中5~7min（EB见光分解，应置暗室中），在紫外分析仪上观察并可用数码相机进行拍摄。此法可将B组RV同样分为两个亚群：亚群Ⅰ型和亚群Ⅱ型，同时可鉴别新轮状病毒（B组）。 此外，还可检出腹泻患儿粪便中的其它病毒病原，如呼肠孤病毒和腺病毒等，在小儿腹泻病毒病原的分子流行病学调查中具有重要意义。

四、免疫血清学方法

目前在RV检测技术中，可靠性和实用性符合要求的依然是WHO推荐的免疫血清学技术[25]。大部分免疫学检测法是针对病人粪便标本中的RV抗原[26, 27]，常用的有乳胶凝集试验（LA）、酶免疫测定（EIA）、放射免疫测定（RIA）、免疫金标法（IGS）。随着新标记物的应用以及固相载体技术和抗体制备技术的发展, 免疫定量技术, 如时间分辨荧光免疫测定（time-resolved fluoro-immunoassay，TrFIA）和定量乳胶凝集试验（quantitative latex agglutination technique，QLAT）等，全过程仅需20min，适合用作临床RV感染的快速筛查，不仅简化了检测步骤，而且提高了检测RV的特异性和灵敏度[28]。ELISA法由于操作简便，价格低廉，灵敏度和特异性高，无放射性污染，无需特殊仪器、设备等诸多优点，被WHO推荐作为RV 的检测手段。总之，RV免疫学检测方法日益成熟、稳定，具有很高的灵敏度和特异性，基本能够对RV做出快速、准确的早期诊断。

五、分子生物学检测法（PCR）

RV感染性腹泻快速诊断中常用的PCR试验，有常规-PCR，实时荧光定量PCR（FQ-PCR），多重-PCR（M-PCR），巢式-PCR（Nest-PCR），以及LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）环介导等温扩增等技术[29, 30]。

1. 实时荧光定量PCR（FQ-PCR）：Mousavi-Nasab等报告，建立了两种FQ-PCR试验方法，自行设计了6对引物和探针，采用多重PCR（M-PCR）和半巢式PCR（Nested-PCR）检测RV-G1~G4和G9、P4、P8和内控（RNase P）[31]。引物、探针和荧光团/淬灭剂合成见表1。为了方便使用RT-PCR和增强敏感性分析，制定了3个RT-PCR面板：第一组G1和G2基因型的检测，第二小组G9型核糖核酸酶P（RNase P）作为内控试验，第3组用于P4和P8基因型鉴定。6对引物和6个标记不同荧光团的探针用于扩增和检测基因型G1、G2、G9、P4、P8和内控（RNase P）。RT-PCR基因分型在LightCycler™96系统（Roche，basel，Switzerland）中进行。按照Kottaridi等报道，采用不同的退火温度[55~65℃]，引物和探针的终浓度范围为200~600nmol/L。RT-PCR总容量为25µL，包含2µL cDNA模板，每个引物400nmol/L，探针200nmol/L，然后确定Ct值。扩增程序：95℃变性5min → [95℃ 15s → 60℃ 30s → 72℃ 30s]×40cycles → 72℃ 5min。按照Ct值，确定最佳条件。

表1. RV-rt-PCR基因分型使用的引物和探针

注：F（forward）正向引物；R（revers）反向引物

Andersson报告采用FQ-PCR检测RV-VP4和VP7基因[32]，回顾性地对2010-2014年在瑞典西部儿童和成人临床样本中分离的775株轮状病毒中，97%毒株检出基因型，其中G1P[8]为最常见的基因型（34.9%），其次是G2P[4]（28.3%）、G9P[8]（11.5%）、G3P[8]（8.1%）和G4P[8]（7.9%）。基因型分布随时间变化和年龄组存在差异，2岁以下儿童以G1P[8]基因型最多47.6%，70岁以上以G2P[4]基因型最多46.1%。

2. 多重-PCR（M-PCR）：Carossino等报告建立了一步法RT-PCR检测患儿粪便中RV-G3和G14基因型[33]。（1）粪便样本：177份粪便样品采自ERVA（Equine rotavirus A）马驹轮状病毒A感染的腹泻马驹，制备10%无血清EMEM粪便悬浮液，在4℃ 2500×g离心15min，然后通过0.45μm注射器过滤器过滤，储存在-80℃。（2）核酸分离：采用TACO™微型核酸提取系统（Gene Reach USA，Lexington，MA，USA）进行核酸分离。取200μL 10%粪便悬液或组织培养上清，作为样品输入，用200μL洗脱缓冲液洗脱，置-80℃保存备用。（3）试验方法：ERVA-VP7基因鉴定，使用Qiagen一步RT-PCR试剂盒（Qiagen，Valencia，CA，USA），建立了一种VP7特异性（基因片段9）标准RT-PCR检测方法。预先制备ERVA检测的粪便标本。（4）PCR程序：在25μL反应混合物中含5μL 5×RT-PCR Buffer（一步法）、1μL dNTP混合液、1μL VP7特异性正、反引物（20μmol/L，终浓度0.8μmol/L)、1μL RT-PCR酶化合物、11μL H2O（无RNase酶）和5μL模板，于95℃ 5min变性。反转录步骤：95℃ 15min → [94℃ 1min → 47℃ 1min → 72℃ 2min]×35cycles。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，可见1062bp条带。

表2. ERVA-VP7基因RT-PCR扩增和测序引物

注：a核苷酸位置根据GenBank统一编号KM454508.1

3. LAMP-PCR（环介导等温扩增-PCR）：（1）引物设计：对于RT-LAMP测定的特异性引物设计，采用PrimerExplorer V4软件（Fujitsu Limited，Tokyo，Japan），设计了6条引物，包括2条外引物（F3、B3）、2条内引物（FIP、BIP）和2条环引物（F、B），见表3。（2）试验方法：采用LAMP® RNA扩增试剂盒（Eiken Chemical Co., Ltd., Tokyo，Japan）制备反应混合物。在25μL反应混合物液中，2×反应混合缓冲（40mmol/L Tris-HCl（pH值8.8）12.5μL，20mmol/L氯化钾，16mmol/L MgSO4，20mmol/L（NH4）2SO4，Tween-20 0.2%，甜菜碱（betaine）1.6mol/L，2.8mmol/L 4×dNTP，0.2μmol/L 2个外部引物，1.6μmol/L 2个内部引物，0.8μmol/L 2个循环引物，混合酶1μL（Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合物）和5μL（95℃加热5min）RNA样品。（3）LAMP反应程序：60℃ 60min，然后在80℃ 5min。LAMP产物检测使用实时浊度计（LA-320C，Eiken Chemical Co., Ltd.）。浊度≥0.1被认为是RT-LAMP阳性。当RT-LAMP产物肉眼检测时，在RT-LAMP反应前，在反应混合物中加入1μL钙黄素[荧光检测试剂（Eiken Chemical Co., Ltd.）]。当LAMP反应为阳性时，混合物在钙黄素存在时呈绿色，当LAMP检测结果为阴性时混合物保持橙色。

表3. 马轮状病毒RT-LAMP和半巢式RT-PCR检测引物序列

Nemoto等报告以马轮状病毒（equine rotavirus）P基因序列为靶点，建立的RT-LAMP-PCR法[34]，检测马轮状病毒特异性P基因型并且与半巢式RT-PCR作比较。结果，在96例腹泻粪便中，用RT-LAMP法检出马轮状病毒58份（60.42%），而半巢式RT-PCR只检出25（26.04%），RNA的检出限为103拷贝。结果表明RT-LAMP检测轮状病毒具有良好的灵敏度和特异性。

4. RT-LAMP-PCR检测诺如病毒（noroviruses，NV）：Yoda等报告，建立了一步法反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测诺如病毒（noroviruses，NVs），设计了3组引物[35]：基因组I（GI）、流行型GII和次要GII；每组引物设计3套，用于对NVs、A组轮状病毒、C组轮状病毒以及sapapovirus等肠道RNA病毒感染患者的临床标本。在NV感染患者的临床标本中检测到不同基因型的NV，未发现与其他肠道RNA病毒的假阳性反应。采用RT-LAMP分析88例急性肠胃炎暴发病例，并与常规RT-PCR结果进行比较。RT-LAMP检测结果与RT-PCR检测结果一致。

5. 基于核酸序列扩增技术（NASBA）：是一种依赖核酸序列扩增RNA的新技术：由一对引物介导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。反应在42℃进行，在2h左右可将模板RNA扩增约109×2倍，不需特殊的仪器。该技术不仅省时, 而且由于扩增温度始终恒定在42℃左右, 污染的双链DNA不能解链，从而解决RT-PCR遇到的双链DNA污染问题，具有更高的特异性。另外，由于RNA以10的指数形式扩增，远高于以2n扩增的DNA-PCR，从而具有更高的灵敏度。当今，NASBA已广泛应用于细菌、病毒等多种病原微生物的检测。Jean等设计使用了NASBA-ELISA检测系统，用于RV快速检测[36]。根据特异性抗原VP7基因序列设计引物，扩增RV-RNA，扩增产物与固定在微量滴定板上的特异的寡核苷酸探针杂交（DNA-RNA），经过氧化物酶显色底物检测。可在6h内，不会产生非特异性信号，该系统具有快速、简便、高特异性和灵敏度。Mo等建立了反转录实时NASBA（RT-NASBA）检测法[37]，并与商业TaqMan RT-PCR方法进行了比较。结果表明，在20份临床粪便标本中，两种方法均能检测并区分轮状病毒和其他腹泻病毒，符合率为100%。然而，RT-NASBA比其他两种方法要快得多。更重要的是RT-NASBA每次反应的检测限可达7个拷贝，比传统RT-PCR和TaqMan RT-PCR低1~2个对数。表明本方法具有较高的敏感性，可作为一种有效的轮状病毒诊断工具。

寇晓霞等报告[38]采用NASBA-RT-PCR检测轮状病毒，其引物和探针设计以轮状病毒VP7基因的高保守区段为靶序列，设计各血清型通用的引物：正向引物P1:5'-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG-3'；反向引物P2:5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGATCCTGTTGGCCATCC-3'，杂交探针5'-GTATGGTATTGAATATACCAC-3'，所对应的碱基位置分别为1-28、376-392、51-71。NASBA反应体系总量为25µL，在1.5mL Ep管中依次加入RV-RNA模板2µL，40mmol/L Tris-HCl（pH8.5），50mmol/L KCl，12mmol/L MgCl2，1mmol/L dNTP，2mmol/L NTP，引物各5pmol。在68℃水浴中5min，破坏病毒的二级结构，42℃ 5min使引物与模板退火；迅速加入40U T7RNase，8U AMV，0.2U RNaseH，20U RNasin，小心混匀，置42℃水浴中2h。将反应管置于-20℃下终止反应。变性琼脂糖凝胶电泳和杂交验证：配制1.2%的变性凝胶，取10µL稀释10倍后的NASBA产物和5µL RNA Marker，用20×MOPS（丙磺酸）-甲醛-甲酰胺以1:2:10的比例配置上样缓冲液，它与样品以2:1的比例混合，在65℃水浴中20min，冰浴5min，加入溴酚蓝5µL和0.5µLEB。先在120V下预电泳5min，然后加入经处理的样品和RNA Marker，在75V电压下电泳1h，在紫外凝胶成像系统中观察结果，再转膜，进行Northern杂交和斑点杂交。杂交所用探针浓度为50nmol/L，抗体浓度为1:10000。NASBA检测的最高灵敏度为50pg，RT-PCR为100pg，半套式RT-PCR为10pg。RT-PCR检测法还可用于其它胃肠炎病毒、临床病原体的检测具有广阔的应用前景。

朱晓娟等报告[39]采用NASBA检测诺如病毒：引物设计采用诺如病毒（NV）rRdRp基因的高保守区段为靶序列，设计GⅠ型和GⅡ型通用引物：JV12-F：5'-AGCCAGTGGGCGATGGAATTC-3'；JV13-；5'-AATTCTAATACGACTCACTATA GGGAATCATCATCACCATAGAAAGAG-3'；扩增程序：在25μL反应体系中含AMV反转录酶Buffer（5×）5μL，T7RNA聚合酶Buffer（5×）5μL，RNaseH Buffer（10×）2.5μL，RNasin（RNA酶抑制剂40U/μL）0.5μL，上、下游引物（10μmol/L）各1.5μL，RNA模板2μL；置65℃ 5min，使RNA解链；然后立即置42℃ 5min，迅速加入T7，RNase（20U/μL）2μL，AMV逆转录酶（20U/μL）0.4μL，RNaseH（5U/μL）0.05μL，DEPC水补足至25μL：混匀并轻微离心，置42℃孵育90min; 反应完成后立即将反应管置-20℃终止反应，备用。电泳及结果记录将冷却的NASBA产物点样于2.0%琼脂糖凝胶，置1×TAE缓冲液中，电压5V/cm，电泳25min，溴化乙锭（EB）染色10min，在凝胶成像系统下观察并记录结果。采用NASBA法分别对9株相关病毒核酸进行检测，只有诺如病毒扩增产物出现327bp区带，其余7种相关病毒（星状病毒、脊髓灰质炎病毒、新肠道病毒68、艾柯30、柯萨奇A1、柯萨奇B5病毒株等）均未出现RNA扩增信号，其灵敏度可检出106稀释度的NV-RNA，最低检出限为20pg/μL，表明其具有良好的敏感性和特异性。

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