乙型肝炎病毒准种多样性 与检测的临床意义

作者:李懿 徐英春
2021-12-16

【摘要】慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染可导致肝衰竭、肝硬化和肝细胞肝癌,是全球公共卫生领域面临的重要挑战之一。由于HBV的逆转录酶缺乏矫正活性,其复制过程易发生变异,慢性HBV感染者体内HBV以准种的形式存在,其准种的多样性与HBV母婴阻断的效果、疾病进展以及抗病毒治疗的效果密切相关。深度测序技术的高速发展为准种的检测提供了极大便利,准种多样性的临床应用也会在慢乙肝的诊治和预防方面发挥优势。


【关键词】乙型肝炎病毒;病毒准种;母婴传播;抗病毒治疗


一、HBV的准种本质

病毒准种是指宿主体内的一群高度相似却各有不同的基因组所构成的病毒群[1]。病毒生物学上的重大事件,例如细胞嗜性或宿主范围的改变或对于内外部的选择压力(免疫应答,抗病毒药物等)的克服能力,均与病毒准种中相关变异有关。HBV在其复制过程中存在前基因组RNA(Pre-genome RNA,pgRNA)的逆转录过程且逆转录聚合酶缺乏矫正活性,导致HBV复制过程中易发生变异,因此,慢性HBV感染者体内HBV以准种的形式存在。但HBV的准种本质不仅仅源于其复制酶的保真性,其突变谱的构成可能还与宿主的天然免疫有关。由宿主的APOBEC3胞苷脱氨酶家族介导的先天性抗病毒防御机制导致HBV负链DNA中的大量胞嘧啶核苷(C)脱氨变为尿嘧啶核苷(U)[2],继而导致HBV正链鸟嘌呤核苷(G)到腺嘌呤核苷(A)高频突变。实际上,研究发现一些临床相关的HBV突变确实是由G到A突变引起的,例如与耐药相关的rtA181T(从GCN到ACN)和rtM204I(从ATG到ATA),以及与HBeAg状态相关的G1896A和G1899A。


二、HBV准种与HBV母婴传播机制

病毒的母婴传播是一种宿主间传播的瓶颈事件,不同的病毒其母婴传播瓶颈也可能不同。对于乙肝疫苗免疫后的HBV母婴传播瓶颈,目前仅有1篇研究报道。该研究仅纳入4对7月龄婴儿及其HBsAg和HBeAg双阳性且HBV DNA>8log10IU/mL的母亲,所有婴儿均采用3针次20微克HepB结合100IU HBIG免疫。该研究通过对RT区的深度测序分析推测HBV疫苗免疫后母婴传播瓶颈为50-200个病毒颗粒[3]。但该研究结果可能受到样本量以及母亲的高病毒滴度影响,需要更多基于HBV全基因组且大样本量的分析研究加以验证。


免疫阻断失败后母亲和婴儿间HBV经过母婴传播瓶颈后的变化,以及发生慢性HBV感染婴儿体内HBV病毒群体的进化和演变尚缺乏研究。母体的HBV准种表型如免疫逃逸或者对核苷(酸)类(NAs)抗病毒药物的耐药性能否传播给婴儿值得关注。目前针对免疫阻断失败的母婴配对的直接测序(优势序列)研究显示,母亲和婴儿的病毒序列存在个别位点的差异,提示准种的主序列在传播后发生了变化,这些位点可能是影响免疫阻断失败的病毒学因素。Yin等[4]对10对免疫阻断失败母婴S区、BCP区和PreC/C区进行直接测序,其中4对(40.00%,4/10)母婴S区突变情况不一致,2对(20.00%,2/10)母婴BCP/PreC/C区突变情况不一致。在S区突变sT123A和sV14A仅在母亲中出现,突变sG10R、sQ129H和sF134Y仅在婴儿中出现,在BCP/PreC/C区A1762T/G1764A、C1913A、T2012C、G1896A、C1914A和T2003A仅在母亲中出现。Yin等[5]的研究发现60.00%(9/15)母婴在PreS/S区有不同的突变位点。Lu等[6]对18对免疫阻断失败母婴中3对(16.67%,3/18)母婴S区直接测序序列不一致,突变sG10R、sV14G、sG145R和sW165S仅在婴儿中出现。Roznovsky等[7]对1对母婴阻断失败母婴S区进行测序,婴儿在137和139氨基酸位点突变,母亲在120和121氨基酸位点突变。Sa-nguanmoo等[8]对14对母婴阻断失败母婴进行S区直接测序,发现2例(14.29%,2/14)母婴阻断失败婴儿存在sD144G和sG145K突变而其母亲中并未发现,在BCP区有2例母婴阻断失败婴儿有A1762T/G1764A双突变而母亲中并未发现。Ghaziasadi等[9]对6对免疫阻断失败母婴进行HBV全基因组直接测序,其中仅1对(16.67%,1/6)母婴突变完全一致。上述结果虽然提示了准种的主序列在传播后发生变化的可能性并且提供了可能影响母婴传播免疫阻断的突变位点,但其基于直接测序,获得的病毒序列为优势株,可能会忽视一些在准种内占比较小的突变株以及准种相互作用对HBV母婴传播的影响。


通过克隆测序或深度测序的技术对于免疫阻断失败的母婴配对样本的HBV准种的研究可以更好的分析HBV准种的构成,以及通过母婴传播瓶颈前后病毒群体多样性和复杂度的变化。Cheng等[10]对8对发生宫内感染母婴的HBV CP区进行克隆测序,发现核苷酸突变G1719T仅在母亲中出现。Wang等[11]对6对宫内感染母婴HBV PreS区进行克隆测序,发现G2763A、A2988C、C2990T和T3120C仅在婴儿中出现,而G2976A、A3096G和C3165A仅在母亲中出现。Su等[12]对4对发生宫内感染的母婴进行HBV克隆测序发现新生儿PreS/S区核苷酸变异率显著低于母亲。Li等[13]发现不携带HCC风险突变的HBV株更易造成母婴传播,通过对1-15岁的儿童体内HBV的横断面分析发现HCC相关突变是在婴儿体内建立感染之后慢慢发生的,而并非从母亲体内的HBV株中获得。Wu等[14]在10对免疫阻断失败的母亲及其婴儿体内HBV全基因组水平的准种分析发现,4对C基因型母亲体内HBV准种的PreC/C区和P区的氨基酸水平及PreS1区的核苷酸水平的复杂度高于婴儿体内HBV准种,其他区域有同样的趋势但可能由于样本量小而没有统计学差异,而B基因型感染的婴儿体内则在P区核苷酸水平的准种复杂度高于母亲。


随着深度测序的发展,二代测序在通量上相比克隆测序有着巨大的优势。Yang等[15]对37对免疫阻断失败的母亲及婴儿(14-62月龄)体内HBV PreC/C区二代测序分析显示,婴儿体内HBV准种多样性低于母亲,对其中7名ALT水平升高的婴儿的观察显示HBV种群产生了新的变异成为主序列且几乎所有频率>1%的突变均位于B细胞或者T细胞表位内。Wang等[16]在对85对免疫阻断失败的母亲及婴儿体内的优势株测序中,发现65.00%的母亲及其婴儿体内HBV无“a”决定簇氨基酸取代,对其中4对母婴体内的HBV“a”决定簇的二代测序分析显示氨基酸替换相对较低(<10%)且母婴之间无显著性差异,否定了疫苗免疫逃逸突变对免疫阻断失败的影响。上述研究提示免疫预防后的HBV母婴传播存在遗传瓶颈,且在新生儿体内整个病毒种群的多样性和复杂度要低于母亲,对于HIV的母婴传播的研究也得到了相似的结论[17]。除此之外,对于免疫阻断失败婴儿母亲和免疫阻断成功婴儿母亲体内的HBV[18]和HCV[19]准种研究都提示母亲体内病毒准种多样性更低更易于发生母婴传播。综上,多样性更低的病毒准种似乎更容易通过母婴传播瓶颈而建立感染,对于能够通过主被动联合免疫而在新生儿体内建立感染的病毒株的具体特征还尚未明确,需要基于全基因组的更大样本量的母婴配对研究。


三、HBV准种与慢性乙型肝炎的疾病进展

慢性HBV感染的自然史根据自然病程一般可划分为4个阶段,即免疫耐受期(慢性HBV携带状态)、免疫清除期(HBeAg阳性)、免疫控制期(非活动HBsAg携带状态)和再活动期(HBeAg阴性)[20]。HBV准种在宿主体内的进化是病毒准种与宿主的免疫系统相互作用的结果。宿主的免疫压力是驱动病毒准种进化的主要动力,因此,病毒准种的动态变化也可以作为反应宿主免疫压力的一种指标,从而对疾病的进展做出预判,相较于已存在的临床指标如血清学标志物,生化指标以及核酸定量,已有研究提示准种特征能够更早的提示疾病阶段的变化[21, 22],为病毒准种的临床应用提供可能。


Lim等[21]通过对HBeAg血清学转换(自发性转换组和IFN诱导转换组)与无HBeAg血清学转换(对照组和IFN无应答组)4个感染B基因型HBV的队列平均60个月的随访研究结合对preC/C区克隆测序分析显示,HBeAg血清学转换前转换者体内的准种多样性显著高于非转换者,而且转换后准种多样性显著增加,最重要的是准种多样性的增加在时间上优先于HBV DNA水平的下降和HBeAg血清学转换,提示HBV准种特征对于HBeAg血清学转换的预测价值。为了更详细的探究HBeAg血清学转换前准种的变化,该组后续对HBeAg血清学转换和无HBeAg血清学转换的感染B基因型HBV的患者进行了长达10年的病例对照研究[22],发现两组在10年前的病毒准种多样性基线不存在差异,但在发生HBeAg血清学转换前7年开始增加,preC区的终止突变也开始出现,HBeAg血清学转换前5年HBV DNA水平和HBeAg水平开始下降,发生HBeAg血清学转换者在转换前体内HBV准种多样性是未转换者的2.9倍。Wang等[23]对7个慢性乙肝患者长达17年的随访研究,揭示了从免疫耐受期到免疫活动期的HBV准种进化,发现全长水平准种多样性随ALT水平的增加(或免疫活动期的启动)而增加,该研究也证实了在慢性HBV感染阶段宿主体内免疫压力对HBV准种进化的主导作用。


综上所述,病毒准种的进化反映着病毒群体与宿主免疫系统的相互作用,因而对于疾病进展与宿主免疫密切相关的慢性乙肝,病毒准种的特征以及相关突变在群体所占的比例相较于已有的血清学和生化指标可能是更好更有预测价值的生物指标。

四、HBV准种与抗病毒治疗


对于未进行抗病毒治疗的慢性乙肝患者,抗病毒药物如IFN或NAs的干预会打破体内病毒准种和宿主免疫系统已建立的平衡,从而在一定程度上驱动病毒进化形成新的平衡,启动对耐药突变株的选择抑或是和宿主免疫共同作用使病毒群体走向灭亡。因此,在这个过程中,不同患者对药物的不同反应可以通过患者体内的病毒准种特征来体现,甚至可以通过病毒准种特征对抗病毒疗效做出预测,发挥临床价值。


IFN可以增加对病毒种群的免疫压力而驱动含有许多免疫表位的C区多样性增加。在Lim等[21]的研究中,IFN诱导的HBeAg血清学转换者与IFN无应答者相比,转换者体内病毒准种在preC/C区的多样性显著高于无应答者且在HBeAg血清学转换前逐步增加。对于HCV准种与抗病毒疗效来说,多篇研究已证实了HVR-1区的基线准种多样性与IFN的治疗效果有关[27-30]


NAs主要通过影响病毒复制而达到抗病毒的作用,目前已有许多研究显示NAs的抗病毒效果与病毒准种RT区的复杂度和多样性有关。Chen等[31]研究接受LAM治疗48周的慢性乙肝患者,对基线和启动治疗后4周的患者血清进行HBV RT区克隆测序分析,结果显示LAM应答者和无应答者基线的准种特征无明显差异,但两组HBV准种有不同的进化模式,无应答组体内准种缓慢地进化为结构复杂、变异增多的病毒准种,而应答组体内病毒准种快速地进化为结构简单、变异少的病毒准种,治疗第4周应答组的RT区准种复杂度和多样性显著低于无应答组,这提示治疗前四周的HBV RT区准种变化与LAM治疗效果有关。Liu等[32]研究ETV抗病毒治疗过程中17例应答者与14例部分应答者HBV RT区的准种动态变化,发现应答者第4周病毒准种复杂度显著低于部分应答者,最重要的是作者利用前四周的进化模式建立的模型可以预测94.12%(16/17)应答者与92.86%(13/14)部分应答者的第48周的病毒学应答以及长期结果,为病毒准种的临床应用提供了可能。Tong等[33]通过对6例接受ETV治疗的慢性乙肝患者体内HBV RT区准种的动态变化分析显示准种多样性和复杂度的下降与持续病毒学应答有关。Peveliing-Oberhag等[34]通过分析接受LAM或LdT的患者体内HBV RT区准种动态变化,也发现治疗第4周应答者的准种复杂度和多样性更低。以上结果表明,NAs治疗前4周患者体内的HBV RT区准种进化模式对治疗结果具有预测价值,对NAs不敏感的患者体内的HBV RT区准种复杂度和多样性更高,可能是因为RT区更高的复杂度和多样性为病毒群体提供了更广的序列空间和更强的适应能力来应对药物的选择压力。


因此,更高的准种多样性可能意味着在用药前就已经因为随机突变产生了相关的耐药突变并在群体中以低拷贝的形式存在,随后在药物的选择压力下由于适应能力最强而逐渐变为病毒准种的主表型。Zhang等[35]对5例LAM治疗48周但血清HBV DNA仍为阳性的慢性乙肝患者体内HBV RT区准种进行克隆测序分析,发现治疗前有3例患者血清中已存在耐药突变,突变株所占的比例为9.50%、4.50%和5.60%。Wang等[36]也在1例核苷(酸)类似物序贯治疗患者治疗前血清中也发现了LAM耐药突变株(rtM204V/L),在准种中占比为4.40%,在LAM治疗后第18周耐药突变株占据优势(79.55%,35/44)。Rodriguez等[37]应用深度测序研究了阿德福韦酯单独治疗失败患者治疗过程中各个时间点耐药株在准种内占比的变化,结果发现在治疗前就存在低比例的不同类型耐药准种,治疗过程中含有阿德福韦酯耐药突变株占比不断提高,进而出现耐药。然而病毒准种实时与生存环境维持着动态平衡,在药物压力消失之后耐药突变株失去选择优势而被野生型占据主导,在每个时间点总以在当前环境下最能适应的病毒株占据主表型而在宿主体内持续存在。Cane等[38]的研究显示在中断LAM治疗的患者中,仅在几个月后就观察到部分或全部病毒群体转化为野生型。Lau等[39]也发现了耐药突变在停止LAM治疗后减少以及复用LAM治疗后更快的重现。


因此,准种理论及其分析方式是分析病毒群体在宿主间传播和宿主体内进化的有效方法。在高通量测序的帮助下,从群体进化的角度探索病原体和宿主间的相互作用,通过建立病原体基因组多样性和临床事件的联系如病原体的传播、疾病进展和治疗效果,可以为传染病的预防和诊治提供新的思路。



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作者单位:北京,中国医学科学院北京协和医院检验科