新型冠状病毒核酸检测的分子POCT检测技术应用

作者:马学军
作者单位:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 2021-12-16

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马学军,博士、研究员、博士研究生导师,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所中心实验室主任;中国疾病预防控制中心分子诊断学领军人才;中国医促会分子诊断学分会主任委员;中非新发再发传染病病原体分子诊断国际培训班(CCDC   ModPad)首席讲师;中华实验和临床病毒学杂志执行主编;多个中英文杂志的编委;获3项省部级科技进步奖;发表英文SCI期刊和中文核心期刊论文200余篇,授权国家发明专利10余项,软件著作权1项;主译“精编分子生物学实验指南”  第4版。

自2019年底以来,新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的出现给全球公共卫生界带来了新传染病的挑战。根据世界卫生组织(World  Health  Organization,WHO)截止2021年10月13日报道,新冠肺炎确诊病例数为237655302例,确诊死亡人数为4846981例(https://www.who.int/publications/m/item/weekly-operational-update-on-covid-19---12-october-2021)。在此次疫情中,新冠病毒RNA检测已被证明对COVID-19的早期诊断起着非常重要的作用,相对其它检测方法,基于核酸的检测方法具有更高灵敏度和特异性的优势[1],这将有利于控制传染源,从而有效防控疫情。

现场即时检测(Point  of Care  Testing,POCT)主要是指在实验室以外的现场(包括患者床旁、急诊科室、医生诊所,甚至家庭内)实施快速检测。传统的病毒核酸检测技术包括三个步骤:核酸提取、核酸扩增、产物检测,其中核酸提取是样品制备的第一步,也是实验室分子检测转化为分子POCT检测的主要挑战之一[2]。由此可见,传统的核酸检测步骤需要精密、昂贵的分析仪器,需要专业的操作人员在设备齐全符合防疫要求的实验室中进行。而随着诊断需求的不断增加和核酸扩增技术的发展,分子POCT技术以低成本、易操作、快速和即时检测的优势越来越受到人们的关注。

本文主要从分子POCT技术和检测产品方面总结目前已有的新冠病毒核酸快速检测方法及原理,以期为分担标准实验室的压力,在检测能力不足或资源匮乏地区合理应用分子POCT技术,实现新冠病毒核酸的快速检测或筛查,从而提高各级医疗卫生防疫机构及时应对新冠疫情的处置能力。

一、核酸快速扩增技术

1. 快速荧光RT-PCR:在核酸检测中,荧光RT-PCR是最广泛用于检测SARS-CoV-2的方法,其原理是利用逆转录酶将RNA逆转录为其互补的cDNA,随后cDNA的特定区域经过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增,在体系中添加化学发光物质或荧光探针从而在扩增过程中实时读取荧光信号以实现检测。荧光RT-PCR的工作流程包括样本采集、样本运送至实验室、样本裂解、通过核酸提取纯化病毒RNA,以及实时RT-PCR扩增、检测和分析。在PCR扩增之前,对样本进行裂解以提取和纯化SARS-CoV-2  RNA,去除可能妨碍目标基因扩增的潜在抑制剂。为发展基于荧光RT-PCR的快速诊断测试(Rapid Diagnostic  Tests,RDT),需要通过简易的操作步骤在短时间内获取检测结果。

通过将荧光RT-PCR与快速技术相结合,如数字微流体、可视化检测和便携式仪器,可以实现快速和简单的RT-PCR反应(5-30分钟),但容易受到诸如低灵敏度、样品通量低等限制[3]。对于缺乏仪器的发展中国家或其他资源有限的环境,节省成本和快速的荧光RT-PCR方法将有利于全球新冠疫情防控。如Arumugam等人使用薄壁PCR管和包括真空低温浸泡加热器/循环器的设置实现了快速荧光RT-PCR,该方法可以在12min内获得检测结果[4]。

2.等温扩增:等温扩增(Isothermal  Amplification  Technology,IAT)是一种很有前途的替代RT-PCR的方法,它在恒温下进行,不需要热循环,也不需要昂贵的设备,如热循环仪。IAT是依赖于核酸的热(恒温)变性或酶促变性和核酸扩增的反应。用于快速诊断新冠病毒核酸的三种常见的等温扩增技术是逆转录环介导等温扩增(Reverse  Trancriptase Loop-mediated Isothermal  Amplication,RT-LAMP),逆转录重组酶聚合酶扩增(reverse trancriptase Recombinase  Polymerase Amplification,RT-RPA)和逆转录重组酶介导的等温扩增(reverse trancriptase  recombinase aided amplification,RT-RAA)。

(1)逆转录环介导等温扩增:环介导等温扩增是2000年由Notomi开发出的一种新型的核酸扩增技术。其原理是利用特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,在等温条件下进行基因高效扩增,其具有操作简单、成本低、快速高效等优点,应用于许多人类疾病的检测和诊断。Poon等人[5]报道了一种用于SARS诊断的简单RT-LAMP检测方法,并论证了该技术用于SARS-CoV-2检测的可行性。该方法选择SARS-CoV-2的ORF   1b区域进行诊断,在6种引物的存在下进行LAMP扩增,扩增产物进行凝胶电泳分析。LAMP法检测SARS-CoV-2的检出率和灵敏度与传统基于PCR的方法相似[6]。LAMP扩增产物也可用焦磷酸镁沉淀或荧光染料进行检测,这使得该方法能够通过实时检测焦磷酸盐的浊度或荧光,有效地克服了端点检测的局限性。Shirato等人[7]利用这种方法开发了一种用于诊断和检测MERS-CoV的RT-LAMP检测方法,该方法能够检测到3.4个拷贝的MERS-CoV RNA,且具有很高的特异性,与其他呼吸道病毒没有交叉反应。Thai等人[8]开发了一种单管加速实时定量RT-LAMP分析方法,通过浊度仪实时检测浊度,用于SARS-CoV-2的早期和快速诊断,该方法的灵敏度是RT-PCR的100倍,检测限为0.01pfu。

(2)重组酶聚合酶扩增(RT-RPA):逆转录重组酶聚合酶扩增是一种新型的等温扩增检测技术,由Armes及其同事开发于2006年,其特异性和灵敏度可与PCR相媲美。逆转录重组酶聚合酶扩增反应的有效性取决于许多因素:温度、反应时间、引物、探针设计以及扩增子的大小等。逆转录重组酶聚合酶扩增反应的最佳温度是37-42℃,反应时间大约20min。逆转录重组酶聚合酶扩增的优势在于它仅需要两个引物,而环介导等温扩增则需要至少四个引物。与PCR相比,逆转录重组酶聚合酶扩增的引物相对较长,通常在32-35bp之间。大多数逆转录重组酶聚合酶扩增使用扩增子的长度为100-250bp。Wahed等[9]基于逆转录重组酶聚合酶扩增技术,建立了一种快速检测SARS-CoV-2 RNA的方法,仅需15min出结果,与RT-PCR相比,其灵敏度和特异性分别为94%和100%。Lau等[10]开发并优化了一种基于逆转录重组酶聚合酶扩增的检测方法,用于使用侧流免疫层析快速检测SARS-CoV-2,与传统RT-PCR相比,该方法对SARS-CoV-2   RNA检测限为7.659拷贝/ml,与其他病毒无交叉反应,灵敏度和特异性分别为98%和100%。综上所述,逆转录重组酶聚合酶扩增是RT-PCR检测SARS-CoV-2的可行性替代方案,尤其在基础设施有限的偏远地区。

(3)逆转录重组酶介导的等温扩增(RT-RAA):RAA是一种具有中国知识产权的新型的恒温核酸快速扩增技术,在较低的温度(一般为37℃)条件下,就可以实现DNA或者RNA的快速扩增。RAA的反应速度很快,可以在20min内得到扩增产物。重组酶、单联链结合蛋白和DNA聚合酶是该技术的三大核心物质,利用这三大核心物质可以取代普通PCR的热循环解链过程。此外,该技术还可以和其他新型检测技术相结合,如侧向流动试纸,从而实现更方便快捷的可视化检测。王等建立了基于荧光探针的RT-RAA方法,用于检测SARS-CoV-2,实现了核酸提取后,8-15分钟快速检测出结果,该方法具有高度特异性,不会与其他重要病毒发生交叉反应,灵敏度与RT-PCR相当,适合在县级乡镇发热门诊和口岸检测机构为疑似新型冠状病毒感染者、密切接触者、入境人员进行快速筛查。该试剂盒和配套仪器获得国家药品监督管理局第三类医疗器械注册证。由此可见,RAA是一种有潜力的替代传统PCR的技术[11]。

二、整体化分子POCT检测技术产品

商业化POCT检测方法通常通过开发配套仪器设备来实现样品提取、核酸扩增和检测这一过程,将所有试剂装在一个盒子里,并通过使用机械化操作或微流控技术以实现自动化,从而最大限度减少人工操作,缩短总检测时间,提高检测速度。

自SARS-CoV-2基因组测序完成后,用于检测SARS-CoV-2的实验室开发的测试(Laboratory-Developed   Tests,LDTs)很快被开发出来,其中许多商业试剂盒已经上市,并通过美国食品和药物管理局(FDA)、欧盟的紧急使用授权(EUA)和中国国家食品药品监督管理局(CFDA)批准。国内外市场主流分子POCT产品如表1所示。

表1. 国内外市场主流分子POCT产品


商品名

注册公司

检测时间

国外

Xpert Xpress SARS-CoV-2

Cepheid

45min

Accula

Mesa Biotech

30min

CobasLiat医用PCR检测系统

罗氏

15min

ID NOW快速检测系统

雅培

阳性结果: 5min

阴性结果: 13min

BioFireFilmArray

bioMérieux

45min

国内

iPonatic移动分子诊断系统

圣湘生物

15~45min

EasyNAT®系统

优思达

30min

Mini8PCR检测系统

卡尤迪

30~90min

Galaxy Nano全自动荧光PCR一体机

奥然生物

1~2h

LifeReady 1000全自动核酸检测系统

杭州隧真

1~1.5h

1. 基于RT-PCR的POCT检测产品:目前获得临床实验室改进修正案的质量标准(CLIA)豁免的基于RT-PCR原理进行SARS-CoV-2测试的分子POCT检测有Cepheid公司的Xpert Xpress SARS-CoV-2和Mesa Biotech公司Accula SARS-CoV-2[12],Xpert  Xpress  SARS-CoV-2是通过RT-PCR检测E基因和N2基因两个靶标,在大约45min内即可获得检测结果,且手动样本处理时间<5min,整个过程自动化,不需要使用者进行特殊培训。有研究表明,与传统RT-PCR相比,Xpert  Xpress  SARS-CoV-2检测深喉唾液样本和下呼吸道样本中的阳性一致性分别为98.86%和100%,阴性一致性均为100%,对于低病毒载量的样本检测结果也较为可靠[13]。Mesa  Biotech公司的Accula  SARS-CoV-2使用简单,体积仅手掌大小,可以用于实验室以外的任何其他地方,进行“近患”检测。利用RT-PCR分子诊断技术,检测咽喉和鼻腔拭子样本新型冠状病毒,在30分钟内可获得实验室质量的定性、可视检测结果。有研究通过采集100个鼻咽拭子评估Accula   SARS-CoV-2的性能,发现其总体一致性、阳性一致性分别为84%和68%。对于病毒载量较低的样本,阳性一致性较低,出现假阴性,这表明Accula  SARS-CoV-2的检测灵敏度不高[14]。国内基于RT-PCR原理的商业化核酸分子POCT检测方法有圣湘生物科技股份有限公司的iPonatic移动分子诊断系统和上海透景生命科技股份有限公司2019新型冠状病毒核酸检测试剂盒(卡式荧光PCR法)等。圣湘生物的核酸检测技术匹配自动化提取仪器,将手工提取核酸步骤(96样本)从原来的3-4个小时缩减到30分钟以内,提高了大规模核酸检测效率。利用iPonatic核酸检测分析仪,可实现受检人群的快速筛查,最快只需8分钟。透景生命的2019新型冠状病毒核酸检测试剂盒采用磁珠法进行核酸提取,实现了提取扩增全程自动化,该方法需要手动装载磁珠和样本,需要在标准实验室环境下进行。从加样到出结果需要约75min。

2. 基于CRISPR-Cas技术的可视化检测产品:CRISPR-Cas技术是一种高度灵活的基于RNA引导内切酶的核酸编辑工具,已经在基因组学、基因编辑、基因治疗和基因组成像领域发挥作用。CRISPR和Cas蛋白是对抗古生菌和细菌中入侵病毒的自然适应免疫系统的一部分。细菌基因组上的CRISPR-Cas位点由多达数百个回文重复序列(35-45个碱基)组成,并由独特的间隔序列(30-40个碱基)分隔。在CRISPR阵列的邻近区域,存在一个或多个操纵子,这些操纵子具有编码该系统效应酶的Cas基因。CRISPR-Cas系统已显示出其作为核酸检测新技术的潜力[15-16]。基于CRISPR-Cas的诊断工具的特点是其灵敏度和特异性可与传统PCR媲美,由于不需要复杂的、昂贵的设备,因此检测成本很低。CRISPR-Cas系统中使用的Cas蛋白根据目标核酸(DNA或RNA)和所需应用而有所不同[17]。目前开发的CRISPR-cas9介导的横向侧流层析(CASLFA)已用于病原体检测[18]。Cas12a/Cas13核酸酶是CRISPR工具的一个组成部分,在crRNA靶向切割后被激活,一旦被激活,它就非特异性地切割所有附近的ssDNA/RNA分子,这一特征被称为侧切或反式切割。研究人员[19]利用这一特性创建了荧光标记的ssDNA/RNA目标探针,靶向病毒RNA的crRNA可以激活Cas蛋白,导致目标探针侧切,随后在纸条上出现阳性带,实现了试纸横向侧流层析可视化检测。Zhang等人[20]报道了基于CRISPR-cas13的SHERLOCK系统检测SARS-CoV-2。该系统可在一小时内使用试纸条提供可视化读数。最近,Sherlock  Biosciences公司基于SHERLOCK技术的SARS-CoV-2特异性诊断试剂盒获得了美国FDA的紧急使用授权(EUA)。

3. 其他分子POCT多重检测产品:多重PCR可实现在同一反应管中同时扩增多个不同的片段。多重PCR不仅意味着节约时间、试剂和样本,同时使得多个扩增子(多个病原)检测成为可能。基于多重PCR的商业平台有QIAGEN公司的QIAstat-Dx、bioMérieux公司的BioFire® FILMARRAY® Respiratory Panel 2.1 plus检测试剂盒等。QIAstat-Dx支持液体运输介质,具有独特的干拭子直接上样程序,手动操作少于1min,并可在1h内出结果。通过美国FDA紧急认证和欧盟CE认证的BioFire® FILMARRAY®  Respiratory Panel 2.1  plus检测试剂盒,是利用巢式多重PCR结合微流控芯片的技术,可以在45分钟内同时检测包含新型冠状病毒等23项呼吸道病原体,整合的一站式快速核酸检测系统提升了检测灵敏度,全封闭的反应体系提升了实验室的生物安全性,避免了不必要的医疗风险。与RT-PCR相比,该检测试剂盒的阳性一致性和阴性一致性分别为98%和100%[21]。国内万孚BoxArray全自动多重核酸检测分析平台将核酸提取、扩增、检测等检测流程全部集中在全封闭的检测卡内,相当于为每一个样本提供一套全新的一次性PCR实验室,将可能的交叉污染和病原传播风险,都控制在检测卡内,提高了检测的精准度,保护了检测人员的安全,降低了病毒传播风险。

三、面临的挑战与展望

目前检测SARS-CoV-2核酸的主要的挑战依然是对特定设备的要求高,新冠肺炎诊断耗时过程长,诊断中心/机构有限,因此迫切需要低成本,便携,快速,易于使用的分子POCT技术,可适用于资源有限、传播SARS-CoV-2风险较高的偏远地区,低收入至中等收入国家的机场和当地社区医院等。由于SARS-CoV-2感染会导致类似流感的症状,对呼吸道感染的鉴别诊断对于控制新冠病毒在人群内的传播至关重要。此外,SARS-CoV-2会导致有症状和无症状感染,而无症状感染者具有传染性,可感染其他人群。价格低廉的便携式诊断系统可有助于对高风险人群(如密接人群)进行大规模筛查,以及时阻断传播链。

RT-PCR被广泛应用于新冠病毒检测,具有较高的敏感性和特异性,但其分析需要各种设备和受过培训的分析人员,只有在成熟的实验室才能完成。LAMP是一种超灵敏的核酸扩增方法,通常可以在大约一个小时内检测到少量的DNA或RNA模板,但高温的要求仍然限制了它的适用性,易导致假阳性。基于CRISPR的核酸检测方法可以在37℃的恒温下工作,但SHERLOCK系统受到目标基因指数预放大的限制,影响检测灵敏度,同时准确定量较困难[22]。分子POCT技术产品操作简单,检测相对快速,但通量不高。因此,开发更有效、更实用的方法来克服现有方法的不足是非常必要的。

选择合适的检测方法是非常重要,在实际应用中,通常将几种方法结合起来,尽量避免单一方法的缺点,只有根据实际场景需要和具体目的平衡各种检测方法的优缺点,才能获得最经济、最优的选择。随着基于交叉学科的新技术、新方法的快速发展,我们相信未来会开发出更适用和更高效的检测技术,为临床实验室提供更多的选择。

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