新型冠状病毒抗原快速检测

作者:邓巧玲,李一荣
2021-12-16

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李一荣,医学博士,主任技师、副教授、博士生导师,武汉大学中南医院检验科主任。兼任中华检验医学杂志编委、中国医疗保健国际交流促进会基层检验技术标准化分会副主任委员、湖北省医学会检验分会副主任委员。先后主持国家重点研发计划课题、国家自然科学基金、湖北省自然科学基金课题多项。以第一作者或通讯作者发表论文40余篇,其中SCI收录30余篇。

新冠肺炎疫情在全球蔓延,引发全球公共卫生危机。迄今感染人数超过2.4亿人,死亡人数近500万,肺炎大流行期间凸显出诊断检测的局限性,具有较高的敏感性和特异性反转录荧光定量聚合酶链反应(Reverse  Transcription Quantitative Polymerase Chain  Reaction,RT-qPCR)一直是新型冠状病毒肺炎诊断的金标准,但随着疫情变化,核酸检测应用的增加,表现出一些问题,首先对实验室环境、仪器设备、操作人员技术等具有较高要求,此外,RT-PCR方法对于由于引物-靶标-基质相互作用的随机效应,RNA负载较低的样本提供了可变的结果,一些患者在最初感染后数周内仍然产生阳性RT-PCR结果,尽管缺乏SARS-CoV-2病毒复制的证据。因此感染个体产生的与感染期联系更紧密的病毒蛋白成为潜在理想的筛查目标。随着检测技术的不断改良优化,抗原检测具有不依赖实验室、快速、有效、可大规模检测特点。

到目前为止,国家药监局(National  Medical Products  Administration,NMPA)已批准4个关于快速抗原检测试剂,美国食品药品管理局FDA发布各类应急使用授权中包含34种快速抗原检测试剂  ,这些试剂盒中最常用的方法是胶体金免疫层析(Colloidal  Gold-Immunochromatographic Assay,CG-ICA),其次是免疫荧光(Immunofluorescence  Assay,FIA)和化学发光免疫分析(Chemiluminescence  Immunoassay,CLEIA),几乎所有的试剂盒设计都是用来检测核蛋白抗原(Nucleocapsid  protein,NP),少数用于检测刺突蛋白(Spike protein,SP)和受体结合区(Receptor Binding  Domains,RBD),产品检测时间在20分钟左右。在急性感染期病毒载量较高时能够快速检出阳性病例,可以用于对疑似人群进行早期分流和快速管理。本文拟对现有的新型冠状病毒抗原快速检测技术进行归纳和比较,为临床实验室根据实际需求选择合适的检测方法提供参考。

1. 胶体金免疫层析法:胶体金免疫层析法是一种快速、定性地测定包括鼻咽拭子标本在内的人呼吸道标本中SARS-CoV-2  N蛋白抗原的方法。一般采用夹层技术检测N蛋白抗原。简而言之,将抗SARS-CoV-2  N蛋白的单克隆/多克隆抗体固定在测试条的检测线上,并用胶体金标记,当侧流样品含有N蛋白时,胶体金标记的抗N蛋白抗体与样品中的N蛋白结合,形成抗原-抗体复合物,但受前带、后带影响,反应可能不够充分。该复合物随后被固定在测试线上的抗N蛋白捕获,在膜上出现一条可见的线。阳性或阴性结果由测试区域上的彩色线表示,结果判读简单,但具有一定的主观性,胶体金免疫层析法检测病原体、相关抗体,特异性好,操作简单,在临床上被广泛应用。

2. 免疫荧光层析:侧流免疫荧光法的原理与侧流胶体金免疫层析法相似,不同的是抗N蛋白抗体用荧光素而不是胶体金标记。根据测试结果是用荧光强度分析仪而不是肉眼来确定的。改进的免疫层析方法,如微流控免疫荧光分析,可实现通道内的定时定量免疫反应。采用生物芯片作为反应通道,可以精确控制微流体均匀有序流动,保证免疫反应过程的规律、有序、彻底。阳性或阴性结果由测试区域上的荧光信号表示。多种试剂盒具有专用的仪器对检测线荧光信号进行判读,减少人员判读的主观性。

3. 磁微粒(电)化学发光:CLIA是一种高通量和自动化的方法,用于对采集和处理的样本中SARS-CoV-2的N蛋白进行定量或定性测定。针对N蛋白的特异性多克隆/单克隆抗体用于包覆磁性颗粒(固相),用于捕获和富集样本中的N蛋白抗原,洗脱未参与反应杂质后加入标记吖啶酯或其他化学发光物质的二抗,反应形成N蛋白抗原-特异抗体包裹的磁珠-二抗-吖啶酯复合物,二次洗脱杂质后的复合物在预激发液作用下脱离磁珠,随后在激发液作用下发生化学发光反应,光信号由光电倍增管以相对光单位测量,在检测范围内,光强度与抗原水平正相关。电化学发光在化学发光的基础上,采用电化学发光物三联吡啶钌标记特异性抗体,在电极作用下发生化学发光反应,因此保留了化学发光较好的灵敏度、宽线性范围、易自动化等优点,还具有重复性好、试剂稳定等优点,但成本较高。

4. 蛋白芯片:对新冠病毒入侵过程中病毒蛋白质和宿主免疫系统之间的互相作用机制进行研究,是新冠肺炎诊断和防治的核心。蛋白芯片技术是将固相载体如硅、云母及各种膜片进行特殊的化学处理,用于冠状病毒检测的蛋白芯片是将病毒蛋白抗体如抗N蛋白抗体、抗S蛋白抗体等固定于载体上,用于捕获样本中的靶蛋白,经洗涤、纯化后检测待测样本中靶蛋白。新冠病毒蛋白质组芯片能够展现宿主免疫系统对不同病毒蛋白产生抗体的全景发展过程,作为诊断工具,提高新冠病毒检测灵敏度,对病程和病情严重程度进行预测,在临床上蛋白芯片常用于检测血浆中的特异性抗体,由于芯片制备过程复杂,成本较高,但可作为宿主免疫研究工具、疫苗评估工具和药物研制工具[1]。

5. 质谱检测技术:以基质辅助激光解吸电离(Matrix  Assisted Laser Desorption  Ionization,MALDI)为基础的SARS-CoV-2病毒抗原免疫检测方法为病毒检测提供了高灵敏度和特异性。当样本经过蛋白提取和酶解后,被抗体包被的磁珠捕获富集,经过多孔格硅橡胶垫片介导,磁珠在载玻片上呈微阵列分布。通过基质喷雾仪对磁珠阵列喷涂,磁珠阵列暴露在含有MALDI基质的气溶胶里,其上结合的抗原蛋白被洗脱到各自的微孔中,待溶剂蒸发后,洗脱得到的蛋白片段与MALDI基质在载玻片上形成共结晶的斑点,通过飞行时间质谱分析载玻片上的每个独立的阵列斑点,可以得到相应斑点中存在的质谱信息,从而实现新冠病毒抗原的快速检测[2, 3]。由于新冠病毒蛋白组学复杂多样,关于质谱检测蛋白抗原仍处于研究测试阶段。Karel Bezstarosti1[4]等研究者监测追踪病毒感染Vero细胞后的几种SARS-CoV-2蛋白的肽段变化,选择核衣壳蛋白即N蛋白作为候选测试分子,灵敏度水平应足以检测理论上与约10000个SARS-CoV-2颗粒相对应的蛋白量。

6. 基于体声波(BAW)生物传感器的免疫分析:一种基于自动化体声波(BAW)生物传感器检测新冠抗原的产品是一种仪器和试剂盒集成系统,使用免疫分析原理对直接前鼻拭子样本中的SARS-CoV-2核衣壳病毒抗原进行定性检测    。首先使用裂解缓冲液对样本进行处理,以破坏病毒并暴露病毒内部核衣壳蛋白,然后将处理过的样本加到墨盒中,从墨盒传送带中穿过包含在墨盒内的生物传感器,在生物传感器的表面发生酶增强的免疫反应,共振器表面的核衣壳蛋白抗体捕获SARS-CoV-2的N蛋白抗原,酶结合的抗核衣壳抗体与固定的SARS-CoV-2抗原结合,反应引起共振频率的变化,仪器可以检测到这种变化,应用生物传感器将酶活性表达的信号放大,从而提高检测灵敏度。

虽然我国新冠肺炎疫情整体控制良好,但新冠病毒变异率高,传染性强,而我国人口流动量大,境外输入控制难度较大,因此仍迫切需要最大限度地提高检测能力以早发现、早诊断、早隔离控制疫情蔓延,基于免疫技术的抗原检测是快速识别新冠肺炎感染者的即时和大规模监测检测的良好选择。免疫层析技术操作方便、分析时间短、成本低、耗样量少、多种分析物联合检测以及不需要专业技术人员等优势;(电)化学发光易于自动化、具有高通量、可用于定量检测的特点;蛋白芯片、质谱分析具有较高的检测敏感性等,各检测平台可根据自身实际情况选择应用合适的检测技术。

参考文献

[1]Jiang  H-w, Li Y, Zhang H-n, Wang W, Yang X, Qi H, et al. SARS-CoV-2 proteome  microarray for global profiling of COVID-19 specific IgG and IgM  responses. Nature communications (2020) 11(1):3581. doi:  10.1038/s41467-020-17488-8.

[2]Armengaud  J. Unleashing immuno-mass spectrometry superpowers to detect  SARS-CoV-2. EBioMedicine (2021) 69:103480. Epub 2021/07/13. doi:  10.1016/j.ebiom.2021.103480. PubMed PMID: 34252697; PubMed Central  PMCID: PMCPMC8270654.

[3]Renuse  S, Vanderboom PM, Maus AD, Kemp JV, Gurtner KM, Madugundu AK, et al. A  mass spectrometry-based targeted assay for detection of SARS-CoV-2  antigen from clinical specimens. EBioMedicine (2021) 69:103465. doi:  https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2021.103465.

[4]Bezstarosti  K, Lamers MM, Haagmans BL, Demmers JAA. Targeted Proteomics for the  Detection of SARS-CoV-2 Proteins. bioRxiv (2020):2020.04.23.057810. doi:  10.1101/2020.04.23.057810.





作者单位:武汉市,武汉大学中南医院检