血栓与止血实验室检测技术发展及临床应用研究重点

作者:王兆钺
作者单位:苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所 2022-01-26



王兆钺教授、主任医师、博士生导师。现任职于苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所。多年从事血液学(血栓与止血)的基础研究与临床研究。获江苏省医学一等奖,江苏省科学技术一等奖,教育部科技二等奖,国防科工委科技二等奖,并为四川省科学技术一等奖与国家科学技术二等奖主要成员。发表论文200篇,主要研究成果被《Williams Hematolgy》收录,并纳入美国血液学会相关诊疗指南。现为江苏省免疫学会血液免疫分会名誉主任委员,血栓与止血学杂志副主编,中国实验血液学杂志编委;曾任中华血液学杂志、临床血液学杂志和国际输血与血液学杂志编委。


在对止血机制的认识上,除经典的凝血系统外,细胞成分如血小板释放多磷酸盐与中性粒细胞释放胞外网也参与了止血过程。新的研究技术与方法,如荧光测定、化学发光和分子诊断等,都具有检测灵敏度高、特异性强和/或实际有效时间长、自动化程度高等优点。本文重点介绍血管性血友病、抗磷脂综合症与基因组套诊断的发展;实验室检测技术的发展在临床诊断、疾病的预防、疗效判定、药物监测、健康状态的评价以及遗传性疾病的预测等领域发挥着越来越大的作用。本文还介绍了我国血栓与止血实验室检测的发展与需解决的问题,开展创新的探索是未来血栓与止血实验研究的重要任务。


止血异常(血栓与出血)是常见的临床现象,也是人口死亡的重要原因。血栓与出血病因与病理机制复杂,但往往缺乏特异的临床特征,必需结合相应的实验室检测才能做出准确的诊断,以利于指导临床治疗。


一、对凝血机制新的认识与发展


目前对凝血机制的认识已从瀑布学说发展为以细胞为基础的凝血反馈放大过程(启动—放大—扩增),但最终的阶段都是凝血酶生成,并将纤维蛋白原转变成纤维蛋白。血栓与止血实验室已普遍能对总的凝血过程以及对血小板与各个凝血因子进行检测,对大多数止血异常做出准确的判断。近年来新的发现使我们对凝血的复杂性有了更深入的认识,其代表性的进展有:(1)在炎症等病理反应中除凝血系统活化外,血小板释放多磷酸盐与中性粒细胞释放胞外网,分别由富含多阴离子分子DNA/组蛋白网或富含Ca2+形成的不溶性颗粒组成,通过激活因子XII驱动的促凝剂和促炎症接触途径触发血栓形成[1]。(2)一些看似无关凝血-抗凝成分可能在某些病理情况下参与凝血过程。因子V是一个重要的凝血辅因子, 但也具有抗凝活性。在有因子V基因A2440G突变的家系中,杂合子患者有出血倾向,APTT与PT延长,但因子V活性与含量正常。经十多年的研究才发现该突变导致aa756-1458缺失,形成“短的”因子V片断,后者能与组织因子途径抑制物(TFPI)紧密结合,使血浆中TFPI不易灭活,其血浆含量与抗凝活性增强10倍,引起出血[2]。(3)个别与凝血无关的蛋白基因突变也会引起出血。血液中存在多种丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpins)。在serpins超家族中,抗凝血酶的反应中心为精氨酸393-丝氨酸,灭活凝血酶、因子Ⅹa、FⅨa与FⅪa。而α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)的反应中心为甲硫氨酸358-丝氨酸,能抑制弹性蛋白酶、胰蛋白酶等活性。α1-AT与抗凝血酶具有serpin的共同的结构,但作用底物及功能不同。当α1-AT活性中心358位上的甲硫氨酸被精氨酸替代后,使α1-AT原本的抗蛋白酶活性丧失,而表现为强烈的抗凝血酶活性, 造成出血倾向,此称为α1-抗胰蛋白酶Pittsburg突变。本病极为罕见,国际上仅发现五个家系的6例患者;我们报道了一个家系的两例α1-AT Pitssburg突变患者[3]。(4)新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是当前全球性危害最大的流行病。患者往往处于高凝状态与血小板减少,易出现各种止血与血栓性并发症。有关COVID-19出凝血异常国内外已有大量的研究[4, 5],本文不再做具体介绍。最新的大规模随访资料发现,患者经强化治疗好转后很少发生血栓栓塞,弥散性血管内凝血(DIC)也很罕见,通常不会出现典型的消耗性凝血病的血小板减少。这表明COVID-19相关凝血病随病情与治疗而改变,应根据患者具体情况决定是否需要进行个体化血栓预防[6]


二、新的研究技术与方法


随着现代生物学技术的不断发展,凝血与血栓诊断试剂的技术含量不断提高,品种不断增多。除常规的生化诊断试剂外,酶联免疫、荧光测定、化学发光与分子诊断等新方法也在逐渐开展。这些技术具有检测灵敏度高、特异性强和/或实际有效时间长、自动化程度高等优点,将在凝血与血栓实验诊断中越来越多得到应用。一些代表性的进展有:(1)比浊法血小板聚集试验已在临床上应用了半个世纪,但靠人工操作,费时费力,重复性差。近年来已有全自动操作系统,国外已发表了三个指南以达到方法的标准化,并对聚集试验光通透性结果进行了合理的解释。此外,不同的检测方法,如电极法、荧光法与血小板功能分析仪(PFA-100与PFA-200)也在临床上得到了较广泛的应用,其中荧光法血小板聚集仪还可测定血小板颗粒成分的释放。近年来还发展出一种总血栓形成分析系统(the Total Thrombus-formation Analysis System,T-TAS 01®)。这是一个具有血栓形成表面的平流微芯片室,生成图像模拟了血管壁损伤,用于血栓覆盖区域的二维分析。该仪器的双监测系统显示了实时视频成像用以观察血小板堵塞阻塞芯片的血流压力波形。T-TAS 01®除反映了血小板聚集功能外,也成功用于血管性血友病的诊断和表型鉴别,血小板存储池病的筛查,监测抗血小板治疗,以及预测冠状动脉搭桥术患者的围手术期出血[7]。(2)血管性血友病(von Willebrand disease,VWD)是一种由于血管性血友病因子(von Willebrand factor,VWF)质或量异常所引起的最常见的遗传性出血性疾病。由于vWD的类型不同,临床症状轻重不等。1型VWD为血浆VWF量的减少(<30%),出血较轻,或在家系调查时才被发现。3型为血浆VWF量的缺乏(≤1%),患者出血明显。通过测定血浆VWF量并参考遗传方式和血浆因子Ⅷ水平,一般不难做出诊断。2型为VWF质的异常,而量可能变化不大。按VWF分子结构与功能不同,又可进一步分为4个不同的亚型:2A型(缺乏高-中分子量vWF多聚体,导致血小板依赖性的功能减弱),2B型(对血小板膜GPIb亲和性增加,使高分子量vWF多聚体缺乏),2M型(vWF依赖性血小板黏附能力降低,vWF多聚体分析正常)与2N型(vWF对因子Ⅷ亲和力明显降低,导致血浆因子Ⅷ寿命缩短与水平降低)。实验室鉴别诊断方法极为复杂与烦琐,包括瑞斯托霉素诱导的血小板聚集(RIPA,瑞斯托霉素的终浓度应选用0.5与1.25mg/ml两种浓度)、瑞斯托霉素辅因子试验(vWF:RCo)与vWF胶原结合试验以及vWF多聚体分析。这些试验需专业人员操作,并且变异系数很大,实际上一般医院很难开展。近年来改用重组血小板GPIb功能获得(gain-of-function)突变片断,不需瑞斯托霉素活化VWF就可在仪器上直接测定VWF-血小板结合功能。VWF-血小板结合能力/VWF:Ag比值<0.6是诊断2型VWD的重要指标。此外,对怀疑有2N型VWD患者还需做VWF-因子Ⅷ结合试验证实[8]。最近国际上4个主要有关的组织,包括美国血液学学会(ASH)、国际血栓和止血学会(ISTH)、国家血友病基金会(NHF)和世界血友病联合会(WFH)共同发表了VWD诊断指南,对各型VWD诊断与鉴别诊断列出了细致的标准,同样推荐了用重组血小板GPIb功能获得突变片断在仪器上直接测定VWF-血小板结合功能作为2A、2B与2M型VWD的主要指标,但将判断VWF-血小板结合能力/VWF:Ag比值的标准改为<0.7。诊断指南提出,基因检测可代替低剂量瑞斯托霉素诱导的血小板聚集鉴定2B型VWD(VWF基因A1区),鉴别2A型(A2区与D2区)与2B型VWD以代替VWF多聚体分析。2N型VWD也可做基因检测(D' D3区)而不必做VWF-FⅧ结合实验。基因检测具有重要的意义,但对1型VWD不强调。随着检测技术的发展及其认识的提高,过去常用的血小板功能分析仪、出血时间测定已不再是VWD必要的检测方法[8, 9]


三、抗磷脂综合症


抗磷脂综合症(APS)是一种由抗磷脂结合蛋白自身抗体引起的自身免疫性疾病,临床特点为反复静脉或动脉血栓和/或习惯性流产或死胎。国际上普遍采用国际血栓与止血协会的1999年札幌诊断标准与2006年悉尼修改的诊断标准。其主要内容为:


1. 临床标准:(1)血管栓塞:在任何组织或器官中有一次或多次的动脉、静脉或小血管栓塞。(2)异常妊娠:一次或多次妊娠10周以上超声或大体检查形态正常的胎儿不明原因死亡;一次或多次妊娠34周以前因重度妊高征、子痫或严重胎盘功能不良所导致的早产;连续三次或三次以上妊娠10周以前的不明原因自然流产,排除母体解剖学、激素异常和夫妇染色体异常。


2. 实验室标准:(1)用标准ELISA方法检测抗心磷脂抗体与抗β2糖蛋白I抗体,至少在6周内连续2次或2次以上血液中出现中或高滴定度的抗磷脂抗体IgG和/或IgM。(2)至少在6周内连续2次或2次以上血浆中出现狼疮抗凝物。患者至少有一项临床标准并有一项实验室标准,才可以考虑APS的诊断[10]


血栓和/或流产都有原发性或继发性因素,包括组织学异常以及感染、炎症与肿瘤等的影响。但临床上有半数的患者无任何原因可寻[11]。对这部分具有典型的APS临床特征,但不存在aPL患者,有人称之为血清学阴性APS(Seronegative APS,SN-APS)。SN-APS与经典的APS比较,产科表型多见,而静脉血栓形成较为少见[12]


对血清阴性APS的机制尚不完全清楚。可能主要与下列两个因素有关:(1)常规的狼疮抗凝物检测为凝血法,抗心磷脂抗体(aCL)与抗β2糖蛋白I抗体用标准ELISA方法检测,两种方法的敏感性都不够高,如改为薄层色谱(TLC)免疫染色法可以提高检出率,发现经典方法测定的阴性标本实际上为阳性结果。(2)患者可能存在一种或多种非常规的aPL,包括IgA亚型aCL和aβ2GP1、抗磷脂酰丝氨酸抗体(aPS)、抗磷脂酰乙醇胺抗体(aPE)、抗凝血酶原抗体(aPT)、抗磷脂酰丝氨酸-凝血酶原复合物抗体(aPS/PT)、抗膜联蛋白A5抗体(aAnnA5)、抗β2GP1域1抗体(aDI)、抗磷脂酰丝氨酸-凝血酶原复合物抗体((aAnnA2)、抗蛋白C和蛋白S以及aCL/波形蛋白(Vimentin)抗体[11]。这些抗体虽然也可在存在于典型的APS患者,但也普遍存在于SN-APS标本中。在美国/英国的一项合作研究中,1/3的“血清阴性”患者在使用一组全面的“非标准”抗体进行的一项或多项检测中得出了阳性结果[11]。可以预见,未来APS实验检测将会列入更多的指标,从而提高APS诊断的效果与准确性。


四、基因诊断


随着人类基因组计划的完成与各种新技术的应用,全基因组测序与全基因组外显子测序在各种疾病诊断与寻找新的致病基因研究中得到了广泛的应用。在血栓与止血检测中应用最多的是将有关的基因组合形成一个组套(panel),对有关疾病同时进行检测与分析。在ISTH科学与标准化委员会提出的基因组套中包括了91个致病基因,其中21个导致凝血因子缺乏和出血,9个导致血栓性疾病,61个导致血小板数量和/或功能紊乱。这不仅有助于遗传缺陷的诊断,还广泛用于家族咨询、调整治疗与预后判断[13]


Downes等[14]对2396例出血、血栓形成或血小板紊乱患者进行了临床表型分析,总诊断率为49.2%,以止血检查结果正常为特征的不明原因出血障碍患者的总诊断率为3.2%。基因测序发现745个独特的变异,包括拷贝数变异和内含子变异,分为致病型、可能致病型和意义不确定的变异。新发现的变异占一半(50.9%),包括在最近发现的与出血、血栓形成或血小板紊乱有关的7个基因中41个独特的变异。我们采用了包含89个基因的出血性血栓性疾病基因测序平台,利用高通量技术对43例具有遗传特征的出血患者进行基因检测。确定15例(34.9%)为遗传性血小板减少,共有19个致病变异,包括8个新的变异[15]


基因检测除用于遗传性疾病的诊断外,还可能促进基因治疗的发展。当前基因治疗已成为精准治疗的一个重要方向,其中CRISPR/Cas9是一种由RNA指导利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术,可方便快捷的进行任意基因的编辑改造,这将对生命科学研究产生突破性影响,有助于研发新的癌症与艾滋病疗法,并可能使治愈遗传性疾病成为现实。对致病基因DNA序列的精确定位也有助于确定血栓与止血领域的基因编辑技术与目的基因靶点,目前已在纠正小鼠血友病B因子Ⅸ缺乏与治疗人血小板Wiskott-Aldrich综合征取得了成功[16, 17]


 

五、血栓与止血发展的未来


随着现代生物学技术的不断发展,诊断试剂的技术含量不断提高,品种不断增多,应用范围也越来越广,已远远超过单纯作为临床诊断的辅助工具,在疾病的预防、疗效判定、药物监测、健康状态的评价以及遗传性疾病的预测等领域,正发挥着越来越大的作用。血栓与止血各种实验室检测新的技术也正在得到开发与应用,最具代表性的方法包括化学发光技术与发光氧通道免疫分析法技术(luminescent oxygen channeling immunoassay),进一步提高了检测的敏感性与准确性[18]。近年来我国血栓与止血各种实验室检测得到了快速的发展,各种研究与生产机构大量涌现,学术交流的规模与水平有了迅速提高,各大医院都建立了专业实验室,检测仪器与试剂从主要依赖进口逐步转向国产化。国外预计检测数每年为3%-10%[18];而我国的增长率达15%以上。但另一方面也应正视国内外的差距,特别是(1)应建立更多国家标准,以控制诊断试剂的质量;(2)保持参考品的稳定性;以及(3)提高试剂盒的灵敏度和特异性。


此外,血栓与止血还有很多问题尚未得到解决,血管是生理与病理止血重要的组成部分,但对血管检测的手段和方法还很不足。在处理患者同时发生出血与血栓这一矛盾的现象时实验室还缺乏有用的指标。此外,对已有的各种检测指标还需进一步组合,以期一次检测就能确定不同的异常。对各种问题深入不懈地开展创新的探索将是未来血栓与止血实验研究的重要任务。


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2022年1月:血栓与止血实验室检测