多粘菌素耐药机制研究与耐药流行防控措施

郭旭光，医学博士，副教授，副主任技师，博士研究生导师，博士后合作导师，广州市高层次卫生人才，医学骨干人才，广医三院启航计划培养对象、精英人才第二、三层次培养对象。全国细菌耐药监测网学术委员会青年委员会委员、中华医学会结核病学分会临床检验专业委员会委员。主持国家自然科学基金等各级各类科研项目15项；发表SCI论文50余篇，申请专利12项，国际PCT专利1项。获Asian Pacific Society of Respirology Travel Award一次、广东医学科技奖三等奖一项。

马芙蓉，医学硕士，广州医科大学附属第三医院检验科技师。主要从事临床微生物的耐药机制研究，先后在Antimicrob Agents Chemother, The Lancet Microbe, Gut Pathog等本领域主流期刊发表论文共7篇。获2020年广州市医学会医学优秀论文三等奖，参与国家自然科学基金面上项目一项，主持院内青年科研项目一项。

文丨马芙蓉 郭旭光

细菌的耐药性和流行性的日益增长已成为全球卫生的重大问题，给人类、动物健康带来巨大威胁。多重耐药菌感染的治疗一直是临床一大难题，由于耐药现状严重且缺乏有效抗生素，多粘菌素重新应用于临床，被视为临床抗多重耐药革兰氏阴性菌，特别是耐碳青霉烯类的超级耐药菌感染治疗的 “最后一线”药物。近年来，随着临床上多粘菌素使用量的增加以及畜牧业中多粘菌素作为促生长剂的大量使用，不可避免地导致世界范围内多粘菌素耐药菌的出现，给多粘菌素的临床应用带来了新的挑战。本文对多粘菌素及其耐药机制等研究进展进行综述，以期为多粘菌素耐药菌传播的防控措施以及多粘菌素的安全使用提供可参考的依据。

一、多粘菌素概况

多粘菌素是一种由多粘类芽孢杆菌产生的阳离子多肽类抗生素，包含A、B、C、D和E五种不同的家族。多粘菌素1947年在日本被发现，从1959年开始在美国、欧洲、中国等国家广泛应用于临床抗感染治疗。由于多粘菌素具有一定的肾毒性和神经毒性以及新型有效的低毒性抗生素问世，多粘菌素于1970年被临床弃用[1, 2]。随着多重耐药（multidrug-resistant，MDR）和泛耐药（Pan-drug-resistant，PDR）菌的检出率持续上升，特别是碳青霉烯类耐药的肠杆菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）的出现，给临床抗感染治疗提出新的挑战。在缺乏新抗生素的情况下，多粘菌素被重新使用，再次被临床使用作为“最后一线”药物治疗多重耐药的革兰氏阴性菌感染[3, 4]。目前临床上使用最多的是多粘菌素B（Polymyxin B，PMB）和多粘菌素E（colistin，CST）。PMB和CST对临床常见的革兰氏阴性菌具有抗菌活性，其主要杀菌机制是作用于革兰氏阴性菌细胞外膜的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），多粘菌素与细菌细胞外膜的脂质A（Lipid A）发生静电相互作用，使得多粘菌素穿透细胞外膜，改变膜的通透性与完整性，导致细胞内膜损伤，细胞胞质外流，最终导致细菌死亡[1, 4]。此外，多粘菌素还可以通过囊泡接触途径[5]、羟自由基死亡途径[6]、呼吸酶抑制作用[7]、抗内毒素作用等杀伤细菌[8]。

二、多粘菌素耐药机制

虽然多粘菌素对临床常见的革兰氏阴性菌具有抗菌活性，如铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌以及其它肠杆菌科细菌，但值得注意的是，部分细菌对多粘菌素固有耐药，如：粘质沙雷菌、变形杆菌、普罗维登菌、摩根摩根菌、霍乱弧菌、布鲁氏菌、弯曲杆菌、军团菌、色杆菌、奈瑟菌等[3, 4]。近年来多粘菌素耐药菌的检出率呈上升趋势，可能与全世界范围内多粘菌素的广泛使用与不合理使用有关，部分国家在畜牧业中大量使用多粘菌素作为动物促生长剂以及临床上用药时间的延长和用药剂量的加大。革兰氏阴性菌对多粘菌素耐药机制多种多样，可以通过固有耐药、基因突变、适应性改变和基因水平转移等多种方式介导，目前尚未完全解析[9-11]。目前常见的耐药机制有以下几种：（1）细菌LPS上的Lipid A被修饰，无法与多粘菌素结合而介导耐药；（2）孔道蛋白的突变与外排泵的过表达；（3）异质性耐药。

1. 染色体突变：染色体突变介导的多粘菌素耐药机制是由于LPS中Lipid A的修饰。通过修饰细菌Lipid A以降低细胞膜的负电荷，导致与带正电荷的多粘菌素结合减少，从而使得细菌逃避多粘菌素的杀菌作用。这种位于染色体上的基因介导修饰方式，通常不利于耐药机制的传播，也被称之为多粘菌素的固有耐药方式。其耐药机制主要通过双组份调控系统（Two-Component Systems，TCSs）进行调控，将带正电荷的L-4-阿拉伯糖（4-amino-4-deoxy-Larabinose，L-Ara4N）或者磷酸乙醇胺（Phosphoethanolamine，pEtN）取代Lipid A上的磷酸基团，导致Lipid A负电荷降低。当TCSs发生突变，TCSs的表达量上调，可以激活arnBCADTEF操纵子和pmrC操纵子的表达。arnBCADTEF操纵子能从尿苷二磷酸葡萄糖醛酸合成L-Ara4N随后转移到Lipid A导致Lipid A的共价修饰，从而降低细胞外面负电荷，阻止LPS与多粘菌素的结合而产生耐药[12]。在许多革兰氏阴性菌的基因组上存在引起脂质A磷酸基团共价修饰的基因eptA. EptA被注释为脂质A磷酸乙醇胺转移酶，在肠杆菌中称为pmrC[13]。

TCSs主要包括PhoPQ和PmrAB，当细菌位于宿主巨噬细胞中时，阳离子抗菌肽或者低浓度Mg2+作用下时，PhoPQ双组份调控系统被激活，从而使调控因子pmrD被激活，pmrD可进一步激活PmrAB，PmrAB上调arnBCADTEF操纵子和pmrC操纵子的表达，因此，该调控基因发生突变会引起细菌对多粘菌素耐药的发生[12]。在铜绿假单胞菌中，双组份调控系统中调控因子pmrA的信号接收区发生突变，常导致多粘菌素耐药[4]。而霍乱弧菌的EI Tor生物型具有较强的多粘菌素抗性，主要是因为almEFG三元组份系统介导的霍乱弧菌中LPS-Lipid A的甘氨酸或双甘氨酸修饰，这种独特的修饰方式显著提高了霍乱弧菌对多粘菌素的耐药性[14]。

2. 质粒介导：在革兰氏阴性菌中，通过ArnT和EptA等介导的LPS-Lipid A的修饰都是位于细菌的染色体上，介导的多粘菌素耐药性为克隆传播，不利于在不同的细菌进行耐药基因的传播与转移，因此其传播流行速度十分有限，临床上多粘菌素耐药性一直保持较低水平[4]。然而，2015年12月，Yiyun Liu等首次报道了在动物源的大肠埃希菌中发现了一种新型的可移动多粘菌素耐药基因mcr-1（Mobile colistin resistance），并证明质粒介导的mcr-1可在不同菌株之间进行水平传播。mcr-1位于质粒pHNSNP45上，编码具有磷酸乙醇胺转移酶（PEA）活性的MCR-1，能够从磷酸脂酰乙醇胺上将带正电荷的PEA转移至Lipid A上降低其负电荷，引起多粘菌素耐药[15]。mcr-1一经报道，便引起了全球的广泛关注，陆续有研究报道了包括mcr-1在内的10种mcr基因家族成员（mcr-1~mcr-10）及约100种突变体的检出[15-24]。mcr-1基因在多种质粒上被发现，包括IncX4、IncI2、IncHI2、IncF等。虽然这些质粒来源于不同的宿主菌株，甚至来自全世界不同地理位置和不同的物种，但是通过基因组序列比对发现，它们的基因组高度相似，说明已经在世界范围内的肠杆菌科细菌中广泛传播。染色体介导的多粘菌素耐药仅能通过克隆传播进行耐药性的传递，而质粒介导的多粘菌素耐药不仅可以垂直传播，还可以水平传播至不同的菌株，导致耐药性传播速度更快、范围更广，是目前造成临床危害最严重的耐药传播方式。目前为止，在全世界范围内超过70个国家和地区在不同来源样本中检出mcr-1基因的，包括动物、人类、环境、食物等。此外，从菌种来源看，临床上常见的革兰氏阴性杆菌，如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌等均有mcr-1基因检出的报道[4, 25]。

mcr-1阳性的菌株主要在食源性动物包括家禽与家畜中检出，这与多粘菌素在农业中过度使用有关，间接诱导加速了多粘菌素耐药菌的出现，而持续的选择压力促进了mcr-1基因的广泛传播，这必然给世界公共卫生和临床医疗带来巨大的挑战[25, 26]。有研究表明，包括中国在内的一些国家实施了禁止在农业中使用多粘菌素作为动物饲料添加剂的措施后，在不同来源样本中的mcr-1基因的检出率均有显著下降，提示减少抗生素不合理使用的干预手段能积极有效地影响整个生态环境中mcr-1基因的流行性[27]。同时，在部分研究中发现mcr-1基因已经进化到某些细菌的染色体上，也表明mcr-1基因引起的多粘菌素耐药还在不断的进化之中[28]。随着临床上多粘菌素使用量的增加，选择压力的持续存在有助于菌株的进化，MCR家族新成员的不断出现也拓展了我们对于多粘菌素获得性耐药的复杂性和多样性的认知，因此还需持续监测多粘菌素的耐药性及其分子流行病学变化，防止多粘菌素耐药菌株的广泛流行与暴发。

3. 外排泵机制：部分革兰氏阴性菌对多粘菌素耐药与外膜蛋白的表达有关，其中包含外排泵。外排泵是细菌生物膜上的一种孔道蛋白，因其可介导药物等物质向细胞外排放，在细菌耐药性的形成中起重要作用。AcrAB-TolC复合体、KpnEF蛋白等外排泵蛋白被认为在多粘菌素耐药中发挥重要作用。AcrAB-TolC能源驱动的外排泵与大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的多粘菌素耐药性有关，AcrAB-TolC的突变可使大肠杆菌和肺炎克雷伯菌对多粘菌素的敏感性增加[12]。肺炎克雷伯菌的KpnEF蛋白参与调节菌株荚膜的合成，可导致对多粘菌素等多种抗生素产生耐药性。鲍曼不动杆菌的外排转运体蛋白家族的AdeABC和HlyD可介导多粘菌素耐药。Muller等报道了ParR和ParS突变造成了MexXY/OprM外排泵系统的表达量增加，引起了铜绿假单胞菌对多粘菌素的中低水平耐药。变形杆菌的Sap蛋白突变也可增加菌株对多粘菌素的敏感性[3, 9, 12, 29]。

4. 异质性耐药：异质性耐药是一种抗生素耐药形式，菌株由一个小的耐药亚群和一个大的易感亚群组成。长期使用某一种药物的生物体内容易出现异质性耐药，细菌的基因或染色体在长期的药物选择压力作用下可能会发生变异，从而改变细菌的表型，表现出一部分的耐药亚群[30]。异质性耐药无法通过传统的MIC方法进行检测，而在微量稀释药敏试验中，试验结果显示为“跳孔”现象。在多粘菌素异质性耐药菌株中，可能仅有一部分群体多粘菌素耐药，在体外药敏试验中呈现敏感的表型，但当处于高浓度多粘菌素环境中时，敏感群体被多粘菌素杀死或者抑制，而小部分的耐药群体得以生存并繁殖，导致了多粘菌素异质性耐药的形成[4]。Band VI等收集了2012-2015年的408株CRE菌株，结果发现，其中异质性耐药的菌株占10.1%（41/408），通过标准临床诊断试验发现，其中38株菌株表现出对多粘菌素敏感[30]。异质性耐药一直未被重视，它可能是临床上某些无法解释的治疗失败的原因。目前已知的多粘菌素异质性耐药主要与Lipid A合成相关基因产生突变或L-Ara4N修饰影响调节器PhoP有关，这可能导致多粘菌素的高水平耐药并且具有较强的稳定性[31]。

三、小结

多粘菌素作为抗革兰氏阴性菌感染治疗的药物已有几十年历史，因其毒副作用一度被临床弃用。近年来多重耐药和泛耐药的革兰氏阴性菌感染率增加，多粘菌素再次被临床作为治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的“最后一线药物”。多粘菌素最主要的耐药机制是细菌的LPS被修饰后减少其所带的负电荷，降低与多粘菌素的亲和力，从而导致耐药[2]。此外，多粘菌素的异质性耐药，给临床检验带来了新的挑战，进一步完善临床检测的流程和手段非常有必要。当下，随着可移动多粘菌素耐药基因mcr-1的发现与广泛传播，给多粘菌素的临床应用构成了威胁。更重要的是，已从动物和临床患者中发现同时携带mcr-1以及NDM耐药基因的菌株，携带该两种耐药基因的质粒可以在不同的病原菌之间转移和传播，这种双重超级耐药菌无疑会给全球公共卫生带来巨大危害[22, 32, 33]。因此，需要进一步探究多粘菌素的耐药分子机制以及传播规律，以填补对多粘菌素认识的不足。

为遏制多粘菌素耐药的发展，建立合理有效的防控措施非常必要。在动物方面，我国已于2017年禁止使用多粘菌素作为动物饲料添加剂，该政策实施后，多粘菌素耐药基因mcr-1在动物、人群、环境中的流行性均显著下降[27]。在临床用药方面，虽然多粘菌素是体外为数不多对MDR和PDR具有抗菌活性的药物，但其药动学、药效学以及临床应用尚存许多问题，在临床用药上还需更加谨慎，优化多粘菌素的临床使用，减少细菌耐药性的发生[10]。对于住院患者，研究表明，多部门联合管理模式在医院感染防控工作中有显著效果，医护人员加强手卫生管理，确保为患者提供无菌操作，做好健康宣教，避免交叉感染等措施能有效降低耐药菌的感染率[34-36]。

本文对已报道的多粘菌素耐药机制进行了综述，目前仍有很多未知的耐药机制需要进一步深入探究，这表明我们应该建立合理的耐药防控措施，以避免多粘菌素耐药性的广泛传播。同时，面对日益严峻的耐药现状，进一步研发高抗菌活性和低毒副作用的多粘菌素衍生物也十分重要。

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基金项目：广州医科大学附属第三医院2020年度青年项目（No. 2020Q02）

作者单位：510150 广州医科大学附属第三医院检验科

通讯作者：郭旭光