Xpert Carba-R检测技术在肠杆菌科细菌碳青霉烯酶基
郭旭光，医学博士，副教授，副主任技师，博士研究生导师，博士后合作导师，广州市高层次卫生人才，医学骨干人才，广医三院启航计划培养对象、精英人才第二、三层次培养对象。全国细菌耐药监测网学术委员会青年委员会委员、中华医学会结核病学分会临床检验专业委员会委员。主持国家自然科学基金等各级各类科研项目15项；发表SCI论文50余篇，申请专利12项，国际PCT专利1项。获Asian Pacific Society of Respirology Travel Award一次、广东医学科技奖三等奖一项。
蓝淇文，广州医科大学临床医学影像学专业学生，师从郭旭光副教授。研究方向为基于生物信息学对微生物感染相关标志物筛选的研究。以课题负责人主持生物信息学等课题3项；参与有关循证医学课题1项。目前已成功申请实用新型专利一项。
【摘要】抗生素的滥用是细菌耐药日趋严峻的重要因素，已成为全球重大的公共卫生问题。碳青霉烯类抗生素多用于治疗多重耐药菌的感染，随着碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌
（Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE）的检测率逐年上升，快速准确检测CRE耐药基因对诊断CRE感染及治疗具有积极的作用。Xpert Carba-R基于荧光PCR技术对碳青霉烯酶类基因家族KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48进行快速检测，优于传统的鉴定技术，具有较高的检测效率。本文通过回顾和归纳Xpert Carba-R方法应用于CRE诊断的相关研究，为指导CRE的检测和防治提供参考。
【关键词】碳青霉烯耐药；肠杆菌科细菌；Xpert Carba-R；细菌耐药
肠杆菌科细菌是院内常见病原菌, 可导致人体多组织脏器的感染及并发症，如菌血症、肺炎、肾炎和腹膜炎等[1]。近年来，随着碳青霉烯酶类抗生素的广泛和不合理使用，造成耐碳青霉烯类细菌的产生，其中包括肠杆菌科细菌。产碳青霉烯酶肠杆菌（CRE）具有高易感性和传染性的特点，可引起免疫力低下患者的严重感染，波及医院内其他易感染高危人群，造成感染人群的扩大化[2]。由于大多CRE感染者预后不佳，常规抗生素难以控制，因此及时并对感染患者进行治疗显得十分重要。随着CRE的广泛流行及细菌耐药率上升，对临床的治疗带来极大的挑战，因此本文对Xper Carbo-R检测CRE的现状及诊断效率作简要综述。
一、Xpert Carba-R检测CRE的现状及进展
Xpert Carba-R多重耐药检测技术是基于实时荧光PCR的原理，能够快速准确检测CRE，操作简单、时间短，准确率高，为临床提供可靠的检验报告，并及时指导临床的用药，防止由于细菌的扩散造成的医疗事故。该技术最早由美国Cepheid提出，起初只能检测样本中的KPC或VIM基因，随着PCR技术的不断发展，该技术已经能够检测多个基因，并在世界各地普及和推广[3, 4]。Xpert Carba-R多重耐药技术对检测CRE的特异性和敏感性均优于传统的肉汤富集培养法[5]。随着肠杆菌等耐药基因的发现及耐药菌株的检出率的增加，Xpert Carba-R也适用对新型耐药株上衍生的新耐药基因的检测，其检测方式融合了新算法或者组合检测法，这赋予Xpert Carba-R更具优势的检测性能。
1. Xpert Carba-R检测碳青霉烯类耐药基因的基本原理：Xpert Carba-R是对肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶、新德里金属β-内酰胺酶、维罗纳整合子编码金属β-内酰胺酶、亚胺培南酶、金属β-内酰胺酶和OXA-48等的碳青霉烯类耐药基因进行体外定性鉴定的一种方法[6]。其原理源于对目的基因的扩增反应产物与荧光探针（如SYBR Green或TaqMan）的结合效应。Xpert Carba-R能够精准识别扩增过程中序列变化所反映的微小温度变化，因此能够精准区分碳青霉烯耐药基因间的微小差异，这使Xpert Carba-R具有更高的灵敏度和特异度。由于Xpert Carba-R避免了耗时步骤，如运行凝胶的制备，这也极大缩短了检测时间，为临床提供及时准确的诊断依据。
2. Xpert Carba-R检测样本的类型：随着碳青霉烯类耐药的肠杆菌株的爆发，这引起了检验机构针对采用Xpert Carba-R诊断CRE的策略及优势进行验证。研究者收集来自各地的病患进行检验，以证明该种高效方法的普适性。同时，采用随机效应模型对Xpert Carba-R的诊断效果进行荟萃分析，结果显示，Xpert Carba-R在高危人群中的诊断特异性和灵敏度分别为0.98和0.99，而在低风险人群中则为0.99和0.96，这证明了Xpert Carba-R在诊断产生碳青霉烯酶的生物具有良好准确性[7]。Xpert Carba-R广泛应用于多种类型样本的检测中，如应用于直肠拭子、痰样本、尿液、人工支气管抽吸物等样本的检测，均取得较好的诊断效果[8-10]。然而，随着抗生素的使用，碳青霉烯类耐药细菌演变出耐药性更强的品种和更复杂的基因谱。Aljohani S、Kaase M的会议报告中使用Xpert Carba-R试剂盒评估了各常见品种的碳青霉烯酶，但由于机制未纳入更新的原因，该法尚未能完成对多重耐药和罕见基因型检测的检测（如OXA-181、OXA-232等）。虽然某些基因型暂时无法完成精准的识别，但是其对于碳青霉烯耐药基因“五大家族”的检测是可靠甚至优于金标准的[11]。
3. Xpert Carba-R诊断碳青霉烯类耐药情况的准确性：随着Xpert Carba-R的不断完善与发展，其在CRE诊断中的优势也日渐突出。Kim等人将收集到的40份粪便样本等分后，分别接种于Xpert Carba-R试剂盒和常规培养板中，结果显示Xpert Carba-R法筛选碳青霉烯类耐药菌仅需小于1小时，而常规培养需3天以上[12]；Shaikh等人采用Xpert Carba-R法对CRE感染者的拭子样本培养分离后的菌株进行检测，发现Xpert Carba-R检测的灵敏度、特异度、真阳性率和假阳性率分别为93.5%、100%、100%和86.7%，表明该方法优于传统方法鉴定[2]；Smith, M等人的结果显示Xpert Carba-R的敏感性及特异性均为100%，而检测时间仅需55分钟，每次分离的操作时间仅为1分钟[13]；Tato, M等人运用Xpert Carba-R法参考培养和测序结果相比的敏感性、特异性、阳性和阴性预测值分别为96.6%（95%CI：0.922-0.989），98.6%（95%CI：0.971-0.994）、95.3%和99.0%[14]。
Xpert Carba-R已经广泛应用于CRE的检测中，2015年至今有多项研究将该技术应用于碳青霉烯类耐药基因的检测中（见表1），或者运用Xpert Carba-R同时对多个基因进行检测，表现出较高的检测效率[15-18]。
大多研究针对OXA-48耐药基因进行检测，灵敏度基本为94%-100%之间，特异度为100%，鉴定能力高[5, 19-24]。Xpert Carba-R对ICU来源的产新德里金属β-内酰胺酶耐药基因的诊断的灵敏度和特异度分别均为100%[25]。以上结果充分说明Xpert Carba-R在CRE的诊断中具有良好的诊断功效，有助于碳青霉烯肠杆菌科早期患者的发现和治疗。
二、Xpert Carba-R的延伸种类
随着CRE在全球的传播，原有的Xpert Carba-R检验已经无法完全匹配所有CRE基因型的检测判定，这也促进对原有检验技术的探索与改良，主要围绕以下三点进行阐述。
1. 算法更新：由于Xpert Carba-R在检测准确性方面的优势，因此更多的研究致力于其作为金标准的验证。研究表明，对Xpert Carba-R的Hodge检验方法进行改良后，降低OXA-48酶的误判率，并以此作为算法结果的评价参考[26]；另外通过对碳青霉烯类耐药基因的各项新式检验方式（改良CIM检测、CARBA-5等）的有机结合，以弥补其在某一项基因型检测的不足，最后得到的新算法比原有方法更为简便快捷和经济[27]。
2. Xpert Carba-R方法的创新：Xpert Carba-R v2是Cepheid提出的第二代Xpert Carba-R检测技术，该法突破原有Xpert Carba-R对于罕见基因型的检测的局限性，可有效检测blaOXA-181和blaOXA-232基因[28]。Byun JH等人评估Xpert Carba-R v2试纸盒的诊断检测效能。连续收集5479份临床拭子，通过检测有疑问的分离株进行该法培养，结果通过该试剂盒检测的样本中碳青霉烯酶基因型高达206种，并具有较高的检测灵敏性和特异性[29]。然而，由于真阳性率仅为49.0%，想要使检验更准确，必须基于富集培养的PCR，这无疑亦增加了检测的时间，降低检验的便利性。但是Hoyos-Mallecot Y指出，Xpert Carba-R v2在低流行地区高危人群中常见碳青霉烯酶的筛查具有100%的敏感性、99.13%的特异性、85.71%的阳性预测值和100%的阴性预测值[24]。
3. 新型Xpert Carba-R：Xpert Carba-R NxG为新型Xpert Carba-R检测方法。有着比Xpert Carba-R技术更高的检测准确率，灵敏性和特异性均为100%，实现更高的突破。Xpert Carba-R NxG在保留原有灵敏度和特异性的基础上，将原来的检测基因谱扩大，其中也包括SPM，GES，NMC/IMI和IMP等，这是改良Xpert Carba-R的一大成果[18]。
三、讨论与展望
随着碳青霉烯类抗菌药物在临床上的广泛使用，出现了耐碳青霉烯类肠道细菌（CRE），CRE可分为产生碳青霉烯酶类的CRE和不产生碳青霉烯酶类的CRE，前者也被称为“超级细菌”[30]。CRE感染导致了严重的公共问题，缩短CRE的检测时间并及时发现早期CRE患者，对于合理用药治疗具有重大意义[31]。近年来，对现有检测方式的改良取得较快的进展，并应用于各类病人的临床诊断，而且检测对象也不再受限于拭子样本[25, 32]。在采用传统技术检测CRE时容易出现假阳性的情况，因为没有可信的分析法来鉴别碳青霉烯酶的产生，因此将分离株转移到实验室取决于使用的碳青霉烯最低抑制浓度筛选断点[26]。Xpert Carba-R不仅为碳青霉烯酶耐药基因的检测提供了分析方法，而且缩短了处理时间。在某碳青霉烯类耐药临床检测方法的比较实验中，Xpert Carba-R，虽然没有准确检出96种CRE，但对检测中的各个耐药基因（KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48）表现良好，对GES、IMI、非IMP-1和产生SME的分离株的检测效果最佳[20]。值得注意的是，与Eazyplex SuperBug CRE相比，Xpert Carba-R的操作更简便，但是Xpert Carba-R的检测时间比Eazyplex SuperBug CRE长[33]。
总而言之，简化Xpert Carba-R操作步骤，缩短检测时间，并更新对CRE罕见基因型的检测方法，仍然是十分重要的。Xpert Carba-R能够继续为人类解决“超级细菌”问题做出新一步的进展，制止CRE的全球性感染，也为更多CRE高危人群带来福音。
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