临床分子诊断技术在疾病诊疗中的应用价值与相关问题
陈瑜，医学博士，教授/主任医师，博士研究生导师。现任浙江大学医学院附属第一医院检验医学中心主任，浙江省临床体外诊断技术研究重点实验室主任，浙江大学检验医学研究所所长，传染病诊治国家重点实验室副主任。国家“万人计划”科技创新领军人才。中国医师协会检验医师分会常委兼人工智能与检验医学专业委员会（学组）主任委员，中华医学会检验分会委员，浙江省检验学会主任委员。主要研究方向：感染性疾病发病机制研究及新型实验诊断技术研发。主持国家重大专项、国家973计划项目、国家863计划项目和国家自然科学基金项目等课题23项，获国家科技进步一等奖、中华医学科技奖一等奖、浙江省自然科学奖一等奖、教育部技术发明二等奖等8项。在国际顶级期刊《柳叶刀》等发表SCI论文150余篇，获国家发明专利16项，主编参编专著23部。
分子诊断技术是指以DNA或RNA为诊断材料，利用核酸扩增等分子生物学手段，检测靶标基因的存在、缺陷或表达异常，从而对疾病作出诊断的技术。目前分子诊断技术正处于高速发展时期，各类创新技术不断取得突破，除实时荧光PCR技术外，近年来分子诊断领域不断发展新的技术方法，应用范围也在不断拓展。尤其是新冠疫情以来，在感染性疾病病原分子诊断细分领域，国内外的体外诊断技术研发机构和企业各显神通，各种新型核酸检测技术不断涌现。以新型冠状病毒核酸检测试剂的临床应用为例，目前获得国家食品药品监督管理局第三类医疗器械注册证的核酸检测试剂共计30余种，除了经典的实时荧光PCR法，还包括等温扩增技术等多种新型核酸检测技术。相比疫情前的分子诊断产品，我们切实感受到技术进步和工艺优化带来的新变化。本文主要对分子诊断技术，重点是在感染性疾病诊断的应用发展及存在的问题进行讨论。
一、实时荧光PCR技术
实时荧光PCR（Real-time PCR）核酸检测技术仍然是当前分子诊断领域应用最广的技术，逐渐成为病原诊断的主要手段之一。通过引物设计、反应条件优化等，研发能同时覆盖多个病原的多重PCR技术是主要趋势，如罗氏Cobas 4800 HPV检测系统通过单管反应可以得到HPV 16型、18型和其他12种高风险亚型的筛查结果。同时，如何实现实时荧光PCR快速扩增与检测也是当前研究热点，例如研发新型热循环仪，针对性提高升降温速率，目前接触式热循环仪（如连续流、振荡流等）和非接触式热循环仪（如等离子体、激光等）的研究均取得一定进展[1]。此外还可以通过改进PCR反应管的光传导和热传导效率，如Cepheid采用扁平结构的反应管，以实现快速实时荧光PCR扩增与检测[2]。还有研究者利用新型薄膜硅基微加热器，升温速率达到30℃/s[3]。另外，通过采用极速反应酶和一步法提取试剂也能极大的缩短检测时间，如2020年上市的圣湘生物、卡尤迪和达安基因的新冠病毒快速核酸检测系统。自动化也是实时荧光PCR分子诊断发展的一个重要方向，尤其在新冠疫情常态化防控工作中，临床实验室的需求更加迫切，以罗氏COBAS 6800/8000全自动分子诊断系统为例，这类系统大大减少了手工操作，降低了环境和人员影响，更保证了实验室人员的生物安全。近年来，国内品牌如厦门安普利、上海仁度和安图生物的全自动核酸检测分析系统陆续获准上市。
二、等温核酸扩增技术
核酸等温扩增技术是指在某一恒定温度、由特定酶作用完成靶标核酸扩增和相关信号检测的技术。相比于PCR核酸扩增技术，等温核酸扩增不需要热循环仪，基于该技术开发的分子诊断系统具有操作简便、检测过程快速高效、仪器易小型化和易普及等多重优点，因此，基于该技术研发的分子诊断产品特别适用于对检测速度要求较高的海关口岸，以及检测技术力量和基础薄弱的基层医疗单位。经过十多年的发展，目前已有多种等温扩增技术用于分子诊断领域，其中目前常见的核酸恒温扩增技术有环介导恒温扩增技术（LAMP)、依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）、切口和延伸扩增反应技术（NEAR）、重组酶聚合酶扩增技术（RPA）等。在本期专家论坛中，我们特别邀请马学军教授回顾和评论了目前国内外主要的核酸等温扩增技术及其在新型冠状病毒核酸检测中的应用现状，并分析核酸等温扩增技术应用存在的不足，展望和思考核酸等温扩增技术未来发展前景，供同行参考。
LAMP技术是日本学者Notomi在2000年提出的，是目前分子诊断领域应用最为广泛的恒温扩增技术[4]，目前已开发有多种分子诊断产品及配套系统，如博奥生物公司晶芯®RTisochipTM-A，Meridian Bioscience的Alethia系列产品等。依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）是Compton在1991年提出的一种核酸恒温扩增技术[5]，之后美国Gen-Probe公司以及上海仁度公司以M-MLV逆转录酶替代NASBA中AMV逆转录酶功能和RNase H酶水解活性，分别构建了转录介导扩增（TMA）和RNA恒温扩增实时荧光检测技术（SAT）[6]。本期王雅杰教授详细介绍了RNA实时荧光恒温扩增技术（SAT）技术原理，重点讲述了SAT在生殖道、呼吸道感染病原，肠道病毒、乙型肝炎病毒RNA检测等领域的临床应用，并评价了其优缺点。
切口和延伸扩增反应（NEAR）主要由逆转录酶、切口酶和恒温扩增DNA聚合酶驱动[7]，并利用分子信标产生荧光信号用于结果分析。该技术开发的分子诊断产品以雅培公司的ID NOW COVID-19 assay为典型代表产品。重组酶聚合酶扩增（RPA）是Niall A. Armes在2006年创建的一种等温扩增技术[8]。之后江苏奇天基因公司利用细菌或真菌的重组酶替代RPA技术中T4噬菌体来源的重组酶，构建了重组酶介导的扩增技术（RAA）技术，并利用该技术开发了系列分子诊断产品，目前研发的新型冠状病毒核酸检测试剂盒（荧光RT-RAA法）已获得国家药品监督管理局第三类医疗器械注册证。
三、数字PCR技术
数字PCR（Digital PCR，dPCR）是近年来迅速发展起来的一种高灵敏核酸定量分析技术，最早是在1999年由Vogelstein和Kinzler提出[9]。基于有限分割原理，dPCR技术可以根据反应体系中的泊松分布和阳性比例，以“数字式”计量方式对样品进行绝对定量分析。根据液体分散方式，目前dPCR主要有微反应室芯片式、集成流路式和微滴式三种主流方式[10-12]，代表性应用平台分别为ThermoFisher QuantStudio™ 3D芯片dPCR系统，Illumina Ventures的Naica crystal微滴dPCR系统，Bio-Rad公司QX100、QX200和RainDrop系列。
dPCR技术突破了荧光定量PCR技术中以检测荧光信号实时变化进行结果分析的方式，在检测过程中无需标准曲线或者参照基因即可对靶标核酸进行测定和比较。因此在检测过程中，dPCR技术结果定量不依赖于扩增曲线循环Ct值，且不受扩增效率的影响，特别在量化差异微小的样品区分中性能优异，目前在病原微生物检测、基因突变相关疾病检测、拷贝数变异检测、食品安全检测、基因表达分析等方面均得到广泛的应用。本期，魏凤香教授介绍了dPCR在产前诊断领域中的应用，文章详细介绍了dPCR技术原理、分类，重点对dPCR在产前诊断，包括无创产前基因诊断、胎儿非整倍体疾病、单基因疾病、X连锁遗传疾病等领域中的应用及其前景进行分析。此外，余皓博士分别以儿童耐甲氧西林金黄色葡萄球菌血流感染和新生儿重症监护室侵袭性真菌感染为例，介绍了dPCR技术在血流感染病原菌鉴定中的应用。谢国良建立了一套可用于检测临床甲型H1N1流感病毒样本H275Y突变的微滴式dPCR（dd-PCR）检测方法，有望用于流感病毒感染后的耐奥司他韦用药管理。
四、分子床旁即时检验
分子床旁即时检验（Molecular Point-of-Care Testing），一般是指基于不同的核酸扩增原理，通过整合仪器、检测试剂和软件等多种技术原理设计的检测系统，易于小型化或微型化、操作便捷，适合在床旁、病房或中心实验室之外的其他特定场景（如社区医院、家庭检测等）开展即时检测，是目前分子诊断一个重要的发展方向。本期专家论述中，我们特别邀请了欧启水教授、余方友教授和刘佳博士等分别从不同角度介绍了当前分子POCT诊断系统的研究进展，他们以国内外已上市或计划上市多种系统为例，分别从检测原理、应用场景、检测性能和质量控制等方面进行了阐述，同时对分子POCT未来挑战和发展趋势都给出了自己的见解，值得同行研习。
核酸扩增和检测同样是分子POCT诊断过程中的核心步骤。目前用于分子POCT中核酸扩增的技术主要有PCR技术和恒温核酸扩增技术两大类。其中，基于PCR技术研发的分子POCT诊断系统是目前主流类别，如Cepheid公司的GeneXpert全自动分子诊断平台，生物梅里埃公司的FilmArray™多重PCR全自动分子诊断平台，罗氏诊断的Roche Cobas Liat检测系统以及博晖创新的GenPlex微流控全自动核酸检测系统等。除此之外，一些恒温扩增技术在分子POCT诊断平台中也有应用，例如上文中提到的以NEAR为基础研发的IDNOW分子诊断平台，以LAMP技术为基础研发的博奥生物晶芯RTisochipTM-A核酸分析系统等。
样本前处理和核酸纯化提取一直是分子POCT检测中的难点，其解决方法一般是通过利用微流控技术结合特定物理或化学方式，将核酸提取纯化与扩增、检测集成到一起。目前一些商业化POCT平台，如GeneXpert利用小型超声破碎方式，FilmArray采用玻璃珠研磨等方式，都可以有效地实现核酸释放与进一步纯化。但是这些方式对于POCT检测平台的系统复杂性、可制造性与可重复性等方面带来相应的挑战。为此一些POCT检测平台则采用免核酸提取方式，将样本利用裂解液直接处理后即用于下一步核酸扩增与检测，如雅培的IDNOW检测平台和卡尤迪公司的闪测™Flash20平台等。但是同时要注意到，相比于常规核酸提取纯化及浓缩后进行的扩增检测方式，这种免提取直接扩增的方式是以降低检测性能来换取更短检测时间与更少操作步骤，对于病原体核酸载量低的样本存在更多的漏检可能[13, 14]。
五、病原体宏基因组高通量测序技术
宏基因组高通量测序技术（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是一种不依赖微生物培养的核酸检测技术，其依靠高通量测序平台和生物信息学分析流程，可以在短时间内通过一次测试完成批量样本中全部微生物核酸数据的解读[15]。随着检测流程的逐渐完善和测序成本的快速下降，近年来，该技术已被广泛应用在包括中枢神经系统感染、血流感染、呼吸系统感染在内的各种感染性疾病相关标本的检测中，为疑难及危急重症病人的感染诊断提供了病原学证据，尤其在鉴定罕见、新发和混合感染病原体及排除感染方面体现出了较大优势[15-16]。尽管目前还缺乏通用指南和建议以帮助mNGS在诊断实验室常规开展，但是来自于急诊、重症、感染及检验医学领域的国内外专家已经组织撰写并公布了多个mNGS临床应用的专家共识[17-20]，从实验室环境和人员要求、临床适用症、标本处理、核酸提取、文库构建和测序、生物信息学分析和结果报告、性能确认方法、质量控制要求等均进行了阐释并提出了推荐建议，这有利于mNGS本地化检测平台的的建立及规范化实施。
本期特邀请了刘东来教授、许四宏教授以及李永军博士分别就mNGS技术在血流感染领域中的临床作用现状及mNGS技术的临床转化与平台建设等内容进行了详细的阐述。刘东来和许四宏教授肯定了mNGS技术在血流感染的病原学诊断中已经能够充分发挥其自身技术特点和优势，并实现较为稳定的分析性能和可靠的临床性能，但强调目前仍需要技术开发者、使用者及监管者等相关方面共同努力，把患者的利益放在首位，在保证科学的前提下稳步推动mNGS技术在血流感染领域中的临床作用。李永军博士等则详细介绍了mNGS的技术原理及与主要流程、临床转化和应用进展、关键的数据库和生信系统构建要点以及mNGS检测本地化实验室平台建设等内容，客观的展现了近5年来mNGS检测的发展现状。杨斌博士等详细解读了2021年中华医学会检验医学分会发表的《宏基因组测序病原微生物检测生物信息学分析规范化管理专家共识》中涉及到的生物信息学概念和生物信息分析流程，以期协助临床和检验工作者更好地理解和应用mNGS技术。此外，韩东升博士对mNGS临床应用中面临的识别背景微生物和人源DNA干扰、建立结果解读与报告标准、开展性能确认活动、开展室内质控和参加室间质量评价等关键问题进行讨论和思考，有利于研究人员及临床医生客观了解和规范使用该项技术。
六、分子诊断技术在其他热点诊断领域中的应用
近年来，随着人类基因组计划的顺利实施，许多与人类健康相关的基因功能得到了诠释，除了在病原诊断领域之外，分子诊断技术在肿瘤诊断、遗传病诊断以及产前诊断中也得到广泛应用。
长链非编码RNA、肿瘤循环DNA、外泌体等新型肿瘤标志物的发现，赋予了肿瘤实验诊断全新的内涵，肿瘤分子诊断已经成为分子诊断的重要组成和研究热点。多种高精度分子生物学技术正在被用于肿瘤相关诊断，在肿瘤分子分型、个体化治疗方案制定、预后评估中发挥着日益重要的作用。近期，研究人员结合微流控芯片通量高与数字PCR灵敏度高的优势，建立一种基于微流控芯片和数字PCR的乳腺癌基因HER2的突变检测技术，实现了对HER2突变高通量精准检测[21]。针对高通量测序技术在痕量肿瘤ctDNA检测灵敏度低的难题，有研究人员研发了一种基于深度测序肿瘤个体化建档法（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）的集成数字误差抑制增强平台的新方法，该方法实现了液体活检的EGFR分析，检测非小细胞肺癌患者ctDNA水平低至0.004%[22]。在本期中，金洁教授等系统阐述了PCR、测序技术、FISH技术等在急性白血病诊断及治疗中的应用进展，分析了分子诊断的技术优势和巨大潜能，将在更深层次揭示急性白血病的本质，成为形态学和免疫学诊断的有益补充，指导临床诊断和治疗。
遗传性疾病由于病种繁多，临床表现复杂多样，且多为罕见病，临床上极易发生漏诊、误诊。分子诊断技术的应用和发展极大地改变了疾病的诊疗模式，使遗传病的诊断与防治困境得以改善。DNA微阵列芯片突变分析技术因其固相杂交而具有的并行性和高通量等特点，已被广泛用于肝豆状核变性的临床诊断，研究人员已开发了一种可检测87种ATP7B基因突变的DNA 微阵列芯片，实现了肝豆状核变性ATP7B基因突变的快速筛查[23]。本期中，我们邀请了王剑教授就分子诊断在遗传性疾病诊断中的应用进行了述评，认为分子诊断技术的灵活应用可以在遗传病发病机制和治疗方法研究中发挥重要作用，尤其是多组学研究有助于进一步认识基因突变对机体、组织、细胞的分子水平的影响。
七、展望
分子诊断技术的发展与应用在感染性疾病、遗传病、肿瘤的诊断和治疗中发挥了极其重要的作用，尤其是以等温扩增技术、dPCR技术、高通量测序技术等为代表的新型分子诊断技术的兴起及向临床中的转化应用，极大的弥补了传统方法在检测范围、敏感性、特异性及周转时间等多方面的不足。在未来的发展方向上，分子诊断技术将在快速便捷、高灵敏、高准确性、高度自动化集成化、高通量的方向上持续优化和转化，促进临床疾病的早期精准诊断和治疗。但必须明确的是，当这些新兴分子诊断技术不断被引入用于临床标本的检测时，临床实验室务必做好内部质量管理、性能确认、临床沟通和结果解释，确保检测系统适用于拟检测标本的预期用途，促进技术在临床应用中的有序发展及合理使用。
参考文献
H. Wu, S. Zhang, Y. Chen, C. Qian, Y. Liu, H. Shen, Z. Wang, J. Ping, J. Wu, Y. Zhang, H. Chen, Progress in molecular detection with high-speed nucleic acids thermocyclers. J Pharm Biomed Anal 190 (2020) 113489.
Q. Song, X. Sun, Z. Dai, Y. Gao, X. Gong, B. Zhou, J. Wu, W. Wen, Point-of-care testing detection methods for COVID-19. LAB CHIP 21 (2021) 1634-1660.
R. Tong, L. Zhang, Q. Song, C. Hu, X. Chen, K. Lou, X. Gong, Y. Gao, W. Wen, A fully portable microchip real-time polymerase chain reaction for rapid detection of pathogen. ELECTROPHORESIS 40 (2019) 1699-1707.
Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000; 28: e63-e.
Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 1991; 350: 91-2.
Zhao Y, Chen F, Li Q, Wang L, Fan C. Isothermal amplification of nucleic acids. Chem Rev. 2015; 115: 12491-545.
Nie S, Roth RB, Stiles J, Mikhlina A, Lu X, Tang Y-W, et al. evaluation of Alere i Influenza A&B for rapid detection of influenza viruses A and B. Journal of clinical microbiology. 2014; 52: 3339-44.
Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biol. 2006; 4: e204.
Vogelstein B, Kinzler KW. Digital pcr. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1999; 96: 9236-41.
Thorsen T, Maerkl SJ, Quake SR. Microfluidic large-scale integration. Science. 2002; 298: 580-4.
Margulies M, Egholm M, Altman WE, Attiya S, Bader JS, Bemben LA, et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature. 2005; 437: 376-80.
Dressman D, Yan H, Traverso G, Kinzler KW, Vogelstein B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2003; 100: 8817-22.
Kim YK, Chang SH. Clinical usefulness of extraction-free PCR assay to detect SARS-CoV-2. J Virol Methods. 2021; 296: 114217.
Smyrlaki I, Ekman M, Lentini A, de Sousa NR, Papanicolaou N, Vondracek M, et al. Massive and rapid COVID-19 testing is feasible by extraction-free SARS-CoV-2 RT-PCR. Nat Commun. 2020; 11: 1-12.
Han D, Li Z, Li R, et al. mNGS in clinical microbiology laboratories: on the road to maturity[J]. Critical Reviews in Microbiology, 2019: 1-18.
Han D, Li R, Shi J, et al. Liquid biopsy for infectious diseases: a focus on microbial cell-free DNA sequencing[J]. Theranostics, 2020, 10(12): 5501-5513.
宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识[J]. 中华检验医学杂志, 2021, 44(2): 107-120.
李颖, 麻锦敏. 宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识 (第一版) [J]. 中华危重病急救医学, 2020, 32(05): 531-536.
中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识[J]. 中华传染病杂志, 2020, 38(11): 681-689.
宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用专家共识组. 宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识[J]. 中华急诊医学杂志, 2019, 28(2): 151-155.
Nie M, Zheng M, Li C, et al. Assembled Step Emulsification Device for Multiplex Droplet Digital Polymerase Chain Reaction. Anal Chem. 2019 Feb 5; 91(3): 1779-1784.
Bratman SV, Newman AM, Alizadeh AA, et al. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev Mol Diagn. 2015 Jun; 15(6): 715-9.
Gojová L, Jansová E, Külm M, et al. Genotyping microarray as a novel approach for the detection of ATP7B gene mutations in patients with Wilson disease. Clin Genet. 2008 May; 73(5): 441-52.
