POCT分子诊断检测技术在感染性疾病诊断中的应用与临床应用范围
张嘉威，医学博士，副主任医师，就职于福建医科大学附属第一医院检验科。以第一作者或共同第一作者发表SCI论文5篇。
欧启水，福建医科大学附属第一医院副院长、福建省检验医学重点实验室主任、主任技师、教授、博士研究生导师。担任中国医师协会检验医师分会副会长、中华医学会检验医学会分会常务委员兼实验室管理组组长、中华检验医学教育学院副院长、福建省医学会检验医学分会主任委员、国家卫生健康突出贡献的中青年专家、福建省科技创新领军人才等。主持完成国家自然科学基金重点项目等国家级、省级课题20余项；主要从事临床免疫学检验与分子生物学检验工作；在国内外杂志发表论文100余篇，其中SCI收录60篇；主编、副主编或参编教材和专著10余部；持有国家发明专利4项，以第一完成人获得福建省科技进步奖一等奖1项、三等奖2项，曾获得福建青年科技奖、福建运盛青年科技奖等奖项。
即时检测（point-of-care testing，POCT）是在患者所在地或其附近进行的、可便捷、快速地获得检测结果的检测方法。相比于传统的检测方法，其在样本周转时间方面有较大的优势，特别适用于影响临床决策的诊断指标和监测指标。同时POCT检测对于人员的要求一般较低，通常经过简单培训或不需经过培训仅阅读了说明书的人员即可进行检测[1]。POCT目前已经被广泛应用于生化、免疫指标的检测，例如末梢血血糖检测和HIV抗体检测，前者用于糖尿病患者血糖管理，后者应用于HIV感染者筛查。
随着精准医学的发展，在满足检测准确度的前提下，感染性疾病的快速诊断和治疗药物的选择对检测周转时间提出了更高的要求。传统的细菌检测方法通常包括细菌的涂片染色、分离培养、鉴定试验、药敏试验等，出具明确结果周期长，影响临床及时诊断和用药。常规的病毒检测技术通常为核酸检测，即检测病毒基因组特异性的核酸序列，例如荧光定量PCR技术。然而，临床在使用该技术检测病毒核酸时，通常需要经过几个相互独立的步骤，包括标本采集、核酸提取和纯化、核酸扩增和检测，但是这些步骤在转运、检测等过程中通常需耗费较长时间，操作步骤也较为繁琐，难以早期、快速地报告检测结果。感染性疾病的分子诊断POCT可以为临床诊疗争取时间，及时停止非必要的经验治疗，启动针对性抗感染治疗或对症治疗，具有较高的临床价值和前景。
目前，感染性疾病的分子诊断主要以核酸作为检测靶标。本文首先以我国已经批准的国内外POCT检测仪器-试剂为例，从检测原理、应用场景和检测性能方面介绍感染性疾病分子诊断POCT的应用现状，然后根据已有研究进一步从检测全流程的角度对该检测方法的发展进行讨论分析。
一、感染性疾病分子诊断POCT的应用现状
根据待检测病原体类型和预期用途，感染性疾病的分子诊断POCT最常见的检测项目包括病毒的定性检测和病毒载量的监测、性传播疾病病原体的筛查和细菌耐药基因的检测。Cepheid公司是最早涉及感染性疾病核酸POCT的公司之一，我们在这部分中以该公司的分子诊断POCT产品为例进行介绍。
1. 病毒的定性检测和病毒载量的监测：感染性疾病分子诊断POCT已经应用于甲型流感病毒（Flu A）、乙型流感病毒（Flu B）和呼吸道合胞病毒（RSV）等呼吸道病毒的定性检测。上述几种病毒是冬春常见的呼吸道感染病原体，其临床症状相似，因此很有必要在感染早期进行病原学鉴定。Cepheid公司的Xpert Flu+RSV Xpress检测试剂盒是我国2019年8月批准的一项甲型/乙型流感和呼吸道合胞病毒核酸快速检测试剂盒，在疑似患者就诊后，检测人员仅需要将患者鼻咽拭子标本加入试剂盒中，试剂盒会自动将标本与裂解液混合，再通过泵将处理后的标本与反应液混合，进行逆转录-多重实时荧光PCR扩增和荧光检测，整个检测可在45分钟内完成。与常规RT-qPCR方法相比，Xpert Flu+RSV Xpress检测三种病毒的一致性能够达到94.7%~100%[2, 3]。因此，病毒核酸POCT检测的开发和应用有助于快速鉴别症状相似的病毒感染，有助于临床医生及时进行对症和对因治疗。
Cepheid公司的Xpert HIV检测试剂盒与Xpert Flu+RSV Xpress检测试剂具有相同的原理和使用方法，该试剂盒可以在90分钟内检测血液标本中HIV病毒载量，对于病毒学失败（抗病毒治疗后病毒载量首次＞1000拷贝/mL）的检测灵敏度和特异性分别为94%和99%。该检测可用于HIV感染者在抗逆转录治疗过程中持续的病毒学监测，而对于妊娠或哺乳期妇女而言，通过POCT更快地识别病毒学失败可能有助于预防母婴传播[4]。由此可见，对于需要监测病毒载量以明确治疗效果或复发情况的感染性疾病，POCT的检测便捷性和可及性可以有效提高患者的定期检测的依从性。
2. 性传播疾病病原体感染的筛查：沙眼衣原体（CT）与淋球菌（NG）是常见的性传播疾病病原体，严重危害生殖道健康。为阻断CT/NG的传播，及时治疗感染者，降低社会疾病负担，通常建议高危人群主动进行CT/NG的筛查。Cepheid CT/NT快速检测试剂盒通过将尿液、子宫颈黏液拭子或阴道拭子等标本和裂解液混合后，释放病原体基因组DNA，通过玻璃纤维柱结合核酸并洗涤纯化，再通过实时荧光PCR的方法检测目标DNA，从而证实样本中存在目标病原体（沙眼衣原体或淋球菌）。与常规的核酸检测方法相比，快速检测显示出良好的性能，CT和NG的检测敏感性均＞95%，特异性＞99%[5]。整个检测过程短至1.5小时，相比于常规检测方法缩短超过一半以上的时间（常规方法需要3~4小时），同时每个样本互相独立，即来即检，患者在检测当日即可得到诊断和相应的临床咨询。
3. 细菌耐药基因的检测：细菌耐药性检测通常采用基于分离培养获得的纯菌株进行检测，该试验一般需要56~84小时[6]，较长的检测周期制约了抗生素的精准用药。细菌耐药基因检测的POCT可以在数小时内出具报告，根据耐药基因的定性分析结果提示病原体是否存在耐药现象，从而辅助临床精准治疗。例如Xpert Carba-R试剂盒可以检测分离纯化的菌落或肛拭子标本中五个临床相关的碳青霉烯类耐药基因的存在，Xpert SA Nasal Complete试剂盒可以辅助鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。上述试剂盒适配Cepheid的POCT检测系统，操作与病毒检测类似：将菌悬液（通常取纯培养物制备，Xpert Carba-R试剂盒还可采用肛拭子）加入到试剂盒中，仪器中超声装置可高效裂解细菌并释放DNA，DNA溶液与干燥的PCR试剂混合，由泵自动转移到PCR管中进行实时荧光PCR并检测。Xpert Carba-R具有较好的性能，与常规PCR耐药基因检测方法相比，对革兰氏阴性细菌中的碳青霉烯类耐药基因的检测精确度是100%[7]；一项荟萃研究分析表明，与基于培养和PCR的药敏试验相比，Carba-R在肛拭子或者细菌纯培养物中，检测产碳青霉烯酶细菌的敏感性为95%，特异性为99%，具有较好的准确性[8]。由于细菌可能存在其他耐药机制，细菌耐药基因检测仅能作为药敏试验等检测方法的辅助手段，而不能排除病原菌对某一类抗生素的耐药情况。值得注意的是，对于重症监护室（ICU）的患者，具有碳青霉烯类耐药基因的肠道菌株比例较高，快速检测耐药基因还可以用于菌株耐药基因型的监测，对病人进行针对性治疗，有效降低肠道耐药菌株的ICU住院患者比例[9]。
二、感染性疾病分子诊断POCT的技术进展
现有的感染性疾病分子诊断POCT技术在保证检测准确性的前提下，提高了操作的便捷性和结果报告的速度，但仍未能达到理想中的“现场、即时、简单”，这主要受到标本类型、检测方法和仪器平台等的限制。目前，已经有许多研究对POCT的不足进行了探讨和改进，国内亦有创新的POCT试剂盒获批用于临床检测。
1. 改进标本类型有助于增加操作便捷性：呼吸道感染病原体核酸检测的POCT通常采用鼻咽拭子，HIV、HCV病毒载量监测涉及静脉采血，消化道定植细菌耐药基因检测可采用肛拭子，以上标本均需要专业的医疗人员采集。在现有POCT检测原理和方法的基础上改进检测标本类型，在不降低方法准确度的前提下，有助于缩短样本周转时间，增加检测的便利性。例如，使用Xpert Flu/RSV试剂盒检测唾液标本中的病毒核酸与鼻咽拭子检测的总体一致性较高，为93.3%[10]，且采用唾液标本患者的耐受度较好；又如，采用末梢血标本检测HCV病毒载量的灵敏度和特异性均大于95%（稍低于静脉血标本），且该检测有助于提高患者监测HCV感染活动性的依从性[11]。
2. 改进与创新扩增方法有助于提高检测速度：尽管短至1s的变性和退火时间可以有效扩增目的片段[12]，且单一检测模块的温度控制相对容易，但准确升高或降低至目标温度的循环过程是基于PCR检测方法的一个限速步骤。等温扩增在检测过程中以恒定的温度进行分子扩增反应，避免了温度的循环，可提高检测速度。例如，利用环介导等温扩增方法检测碳青霉烯类耐药基因的时间短至30分钟，并且该方法与RT-PCR的一致性为100%[13]；又如，相比于Xpert MTB/RIF结核分枝杆菌检测试剂盒，基于交叉引物扩增技术的结核分枝杆菌复合群即时分子诊断系统可在不到2小时内检出更高比例的涂阴肺结核患者[14]。
3. 便携的仪器平台有助于实现即时检测：POCT检测试剂的集成化实现了“样本进-结果出”的应用，但是，样本与试剂的混合依赖于仪器中反应流控制系统（如注射泵），反应温度依赖于温度控制系统（如金属热模块和风扇），结果的读取依赖于光学系统，因此现有的分子诊断POCT检测仪器更倾向于“全自动核酸分子诊断系统”，检测平台对分子检测实验室环境有较高的依赖性。
为改进仪器的便携性，许多检测方法将反应流控制系统改进为集成性更好的微流体平台：反应盒中的试剂以冻干或玻璃化的状态保存于不同腔室中，以便常温运输和保存，使之更适合于在目标场景（例如社区医院、急诊室、ICU床旁等）中使用；反应过程中，通过离心力或虹吸力等的改变将标本或试剂转移到反应腔室中，通过简单的离心机进行液流控制，替代复杂的注射泵系统[15]；在结果判读阶段，荷兰莱顿大学的研究人员研制的呼吸道病原体POCT检测试剂盒采用铁标记探针与扩增产物杂交，通过伏安法检测其电信号的改变，代替实时荧光PCR精密的光学系统[16]；美国波士顿大学的研究人员研发了基于纸张的体外合成平台用于核酸检测，检测结果可以通过肉眼直接判读，在分子诊断POCT实现“即时性”方面具有广阔的前景[17]。
总之，分子诊断POCT结合了分子检测的高灵敏度和POCT的快速、简便的特点，在感染性疾病诊疗现场的检测和高危人群的筛查方面有较好的应用价值。随着检测技术的成熟、仪器和试剂等检测成本的进一步下降以及分级诊疗的开展，有望在门急诊等医院科室或基层医疗机构快速搭建病原体核酸检测平台，有助于感染性疾病的防控和诊疗。
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