分子诊断POCT系统和相关技术开发进展与挑战
刘佳，博士研究生。圣湘生物科技股份有限公司副总经理兼生命科学研究院执行院长，负责技术及产品开发及国内外注册工作。组织开发了基因诊断产品400余项，参与了国内外20余项行业标准制定，30多个国际、国家标准物质研制。开发的产品获得国家科技进步二等奖、中国体外诊断优秀创新产品金奖、二等奖等系列国家及行业奖项。
新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行引发了临床检测实验室对分子诊断前所未有的关注以及公众对核酸检测的关切。从获得新冠病毒基因组序列后数天内制造商完成基于RT-PCR技术的核酸检测试剂盒的研发，至数十天内由监管部门在紧急授权的程序框架下完成产品的审批上市，分子诊断技术及相关产品展示了其在应对大规模流行病的防控中的重大意义。事实上，目前基于PCR的实验室核酸检测手段已经成为全球范围检测新型冠状病毒的“金标准”。伴随着新型冠状病毒疫情的防控工作的开展，国内临床上出现了一类新的新型冠状病毒核酸检测方法-分子POCT，旨在缩短检测时间、减少实验过程中所需的辅助仪器设备并降低实验室空间要求，以满足在疫情防控期间不断增长的核酸检测规模以及基层医疗机构快速提升核酸检测能力的需求。
对于国内制造商正在进行的将分子诊断推向“POC”（Point-of-Care）场景的努力，业内专家及权威部门也适时进行了必要的疏导和规范，去年8月份发表于《中华检验医学杂志》的“新型冠状病毒核酸快速检测临床规范化应用专家共识”对理想的核酸POCT检测应具备的特性进行了阐述：可以实现采样后，直接在同一封闭的便携式、一体化仪器上完成检测，操作简便，且样本检测全过程所需的时间明显短于常规新冠核酸检测[1]。这些特性可以总结为：快速、便携、简便、封闭以及一体化。本文通过讨论当前分子POCT主要的仪器平台，以及国内分子POCT产品在应用过程中遇到的问题，引出对于样品制备（核酸提取纯化）及功能集成等主要挑战的讨论，强调现场快速核酸检测解决方案仍需关注的方面。
一、当前主要的分子POCT仪器平台
1. Cepheid GexeXpert：GeneXpert是一个模块化平台，具有多种规格（2、4、16、48及80个样本通量），得益于这种设计，可以进行随机检测，即所谓的“随到随检”。该系统使用基于一次性卡盒的试剂盒，包含用于核酸提取纯化和扩增所需的材料和试剂。无需精确移液即可将样本转移至试剂盒。上机后，样本中的病原体颗粒被裂解，核酸被纯化，并自动完成后续的扩增和检测。根据Cepheid提供的信息，用户手工操作时间不超过1分钟，检测新冠RNA所需的时间为45分钟。其新冠检测试剂已获FDA EUA授权，另外Cepheid“甲型/乙型流感及呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂盒”已获FDA CLIA豁免。多篇文献评估了Cepheid系统及检测的性能，对于甲型流感、乙型流感及呼吸道合胞病毒检测与ProdesseProFlu+实时逆转录PCR检测的阳性一致率为100%、100%和97.1%，阴性一致率为95.2%、99.5%和99.6%；与Trombley对比XpertEbola检测表现了100%的敏感性（95%CI 84.6%-100%）和99.5%的特异性（95% 97.0%-100%）[2-4]。
2. Roche Cobas Liat：罗氏Cobas Liat PCR系统已获得FDA CLIA豁免和CE-IVD标志，并通过了FDA510（k）流感A/B和RSV许可。Cobas Liat系统因其采用一种预装有检测所需的所有试剂和材料的柔性塑料检测管而得名，使用浸入约2ml运输介质中的鼻咽拭子样本，标准上样量为200ul，转移至检测管后，即可插入系统进行全自动检测（包括核酸提取和纯化及后续的PCR扩增和检测）。罗氏声称，该系统处理一个样品所需的总时间为20分钟。几个报道评估并比较了Roche Cobas Liat与对照产品的可靠性，并证实了其快速和易用性。对于SARS-Cov-2检测的研究结果显示为敏感性为94.6%, 特异性为99.8%[5-6]。
3. Abbott ID Now：Abbott ID Now是一款CLIA豁免的桌面设备，主要用于对流感病毒及SARS-CoV-2进行快速检测。值得注意的是，ID NOW并未采用PCR方法，而是一种被称为切口酶等温扩增的方法。它有2个样品处理容器，按照要求放置到ID NOW仪器上并进行加热，拭子样本在预热好的裂解缓冲液中搅拌10秒钟，然后将两个样品容器对接密封，即开始核酸扩增。对于流感A/B检测，ID NOW可以实现不到13分钟的快速检测，并能保持95%及以上的敏感性。当进行SARS-CoV-2检测时，尽管样本周转时间仍能保持不到13分钟，但仅能达到73.9%的总体敏感性，对于低病毒载量样本甚至下降至34.3%[7]。导致低敏感性结果的原因可能是由于使用的样本保存介质与ID NOW系统不兼容[8-9]。
上述三个产品自出现以来便被视为新型分子诊断系统的杰出代表，实现了分子诊断实验过程中单个样本处理（核酸提取纯化）、扩增与检测等核心过程的一体化完全集成。也是制造商推动分子诊断向POC场景应用取得的巨大进步。尽管如此，值得关注的是三者的定位及设计思路的区别：Cepheid GeneXpert系统的模块化设计体现了其试图重新定义分子检测平台的意图，而非仅仅关注分子POCT场景；而Roche Cobas Liat和Abbott ID NOW单样本通量和超快速样本周转的设计可能与其定位的主要应用场景是小型诊所（Physicianoffice laboratory）有关。
相比较而言，国内分子POCT产品尚处在研发早期。2020年以来，国内才开始有数款具有小型化、快速或者一体化等特征的分子诊断设备获得NMPA的批准或者紧急授权，主要适用新冠病毒核酸检测。事实上在新冠疫情之前，国内的临床分子检测市场几乎全部集中在三甲医院检验科或者大型的第三方实验室。制造商甚少推出典型的分子POCT产品。一段时间内，国内市场对分子POCT的定义缺乏共识，“核酸快检”几乎成为分子POCT的代名词。“新型冠状病毒核酸快速检测临床规范化应用专家共识”（后文简称“专家共识”）对于临床应用规范的技术细节的重申以及对“理想分子POCT”的描述体现了业界对当前国内分子POCT发展状况的认识及对未来发展趋势的期待。
二、近年来国内制造商提供的主要分子POCT仪器平台
1. 优思达UC0102核酸扩增检测分析仪：优思达UC0102核酸扩增检测分析仪是国内首个获批的小型一体化封闭式核酸检测设备。该设备使用基于交叉引物恒温扩增技术开发的配套试剂，也是国内首个实现单个样本的核酸检测全功能集成的设备。通过疏水分隔将检测管分成裂解区、洗涤区和扩增区，使得整个检测过程得以在这个管状的封闭容器内完成。这个检测管在加入样本后就被管盖封闭，然后插入到检测设备，设备首先对裂解区进行加热，使得样本中的核酸释放到溶液中，释放的核酸随即被溶液中的磁珠所吸附；磁珠-核酸复合物进而被磁场牵引穿过疏水隔离层进入洗涤区，并在这一区域进行洗涤去除杂质；随后干净的核酸再次在磁场的牵引下随同磁珠一起穿过第二个疏水隔离层进入扩增区；在扩增区内，核酸先在洗脱液中与磁珠脱离，随即与反应试剂一起在扩增区开始恒温扩增。在扩增过程中，荧光探针与扩增区域的序列发生特异性结合而生发荧光信号，并被设备检测后经过处理生成扩增曲线等结果。
优思达UC0102配有2个独立模块，可以处理2个样本管。基于该设备开发的结核分枝杆菌复合群核酸测试试剂盒（恒温扩增-实时荧光法）与已上市的对照试剂盒（Taqman探针法，ABI7500）在临床试验中的对比数据为阳性符合率为96.67%，阴性符合率为100.00%，总符合率为98.51%[10]。
2. 奥然生物核酸扩增分析仪：奥然生物的3款核酸扩增分析仪（Galaxy nano、Univesal Nano以及Univesal Pro）在2020年获批。这三款分析仪都属于一体化设备，由分析仪和Galaxy智能盒组成。智能盒内含有预装的核酸提取试剂，并预留有装载PCR扩增试剂以及用于PCR扩增反应的腔室。目前，这几款设备尚没有配套的试剂获批。
3. 圣湘生物iPonatic核酸检测分析仪：圣湘生物iPonatic核酸检测分析仪的两种规格SQ-31A和SQ-31B分别在2020年和2021年获得NMPA批准。iPonatic系列设备2种规格的差异在于样本通量，SQ-31A为单样本通量，SQ-31B为4样本通量。iPonatic的特点在于采用内置的机械臂进行样本处理，具有较好的灵活性；同时其“一步法”核酸提取技术和快速扩增模块的搭配也能实现较快的样本周转时间。
除此之外，还有一类设备的商业化在近几年尤其是新冠疫情期间得到快速推进，并且也被归为分子POCT仪器。这是一类小型化的实时荧光PCR仪器，并不集成样本处理（核酸提取纯化）功能，如卡尤迪FLASH2.0和安誉生物AGS8830。在特定的应用中，制造商采用免提取（确切讲应该是免纯化）的方法以简化操作，近年来，已有报道描述了不易受抑制的PCR检测方法[11-12]，可在一定程度上简化样本处理过程。
三、功能集成仍是分子POCT商业化的关键挑战
对于核酸检测，特别是分子POCT应用，便捷且高质量的样品制备（核酸提取纯化）是一个挑战[13]。因为它涉及到复杂的过程，往往需要手工进行操作。在临床实验室环境下，这个过程一般通过工作站等设备实现自动化。然而在POCT场景下，临床样本的核酸提取纯化应该与扩增、检测集成到一起，并以简单、便携、自动化的封闭系统的形式进行。微流控技术早已被引入，以实现单个步骤或整个过程的自动化[14-15]，可能由于系统复杂性、可制造性与可重复性等设备相关的挑战，仍然少有商业化产品。而且，大多数感染性疾病相关的病原检测需要从较大量的样本中提取和浓缩目标核酸，以达到适当的检测限。因此，宏观流体控制系统可能比微流控设备更能满足这种要求。
化学或酶的方法可能对大多数病原体的裂解有效。然而，对于结核分枝杆菌、真菌等微生物，则难以发挥足够的作用。GeneXpert利用小型超声换能器、FilmArray采用玻璃珠研磨的方式进行物理破坏帮助裂解病原以释放核酸。裂解后，利用特定的固体介质对释放出来的核酸进行特异或非特异的捕获，并进行洗涤和洗脱，以便于后续的扩增反应[15]。这个纯化步骤不仅缓解了聚合酶反应时受到样本以及裂解过程中引入的化学成分的抑制效应，也有助于浓缩目标核酸，使得系统可以用较大的样本上样，以获得检测限优势。
扩增和检测在分子诊断过程中属于核心步骤，提供了在分析灵敏度以及多靶点同步检测方面的相对优势，多种扩增方法和检测手段已经被报道，其中多种得以成功商用。基于聚合酶的PCR扩增是目前用于满足低检测限（尤其对于传染病病原诊断，通常对检测限要求较高）要求的主要技术。
PCR的驱动力来自于热循环，高温熔化DNA，然后在较低温下进行引物退火和延伸。宏观流体[16]和微流体[17]装置已经被用于完全功能集成，许多基于芯片实验室（Lab on a Chip）的系统也被设计成小型化的PCR仪器[18-20]。尽管基于热循环的PCR技术已经得以广泛商用，温控的复杂度、功率以及升降温速率等问题一直遭到诟病。等温扩增技术避免了采用热循环装置，从而降低了设备的复杂度和成本，被认为更适合在欠发达地区应用。例如使用水浴、简单的电阻式或放热的化合物作为热源等[21]。等温扩增技术也得到了很好的发展，其中一些，如环介导等温扩增（LAMP，Eiken）[22-23]正在成为主流。
四、技术发展为新型分子POCT的集成提供条件
一些新型PCR方法已经被构建用来实施快速扩增，由GNA Biosolutions GmbH（德国马丁斯里德）开发的激光PCR是根据核酸在功能化纳米粒子上的脉冲控制扩增（PCA）的原理进行的。激光激活的PCA在局部引发了瞬时的加热和冷却，而反应的大部分则保持在一个恒定的温度。鉴于激光波长和金纳米粒子的质子吸收特性相匹配，激光照射胶体纳米粒子（最好是由金制成的）能够对均匀分散的纳米粒子进行局部和超快速的加热。激光以短脉冲（如微秒）加热纳米粒子（皮摩尔浓度），从而在核酸扩增过程中保持批量反应温度基本不变。通过有效地将热循环限制在纳米粒子上，引物附着在纳米粒子的表面，激光PCR可以实现加热和冷却循环，可以在10分钟内对10拷贝的目标核酸完成扩增[24]。Katharina Müller等人进一步开发了一种更加经济的脉冲控制扩增方法。利用能量脉冲控制直接嵌入扩增反应中的微尺度金属加热元件，在几微秒内加热反应体积的一部分。被加热的微循环器几乎瞬间冷却，形成了超快的加热和冷却循环，只需15分钟就可以完成典型的扩增反应[25]。除了这两种基于时间改变的快速扩增技术，另一类则是基于空间改变实现的。Katharina Müller等人报道了一种在Rayleigh-Benard对流腔内进行的PCR方法，利用在特定尺寸的对流腔的两端施加的恒定温度（变性和退火的典型温度值），形成腔内反应液的在重力方向上的温度梯度，进而导致其密度梯度的形成以引发自然对流。反应液的对流运动在温度区域间进行，偶联的DNA变性和退火随之进行[26]。Wen Pin Chou等报道了利用对流PCR技术在30分钟内完成3种病毒基因组扩增的研究，检测限达到了30拷贝/反应[27]。对流PCR技术采用简易温控设备（单个或多个空间分布的恒温热源）进行快速PCR的方案，但由于驱动力是自然对流，目前还没有实现对反应进展的有效预测和控制，因而难以进行定量检测。另一类基于空间改变的快速PCR方案驱动样本在一种微通道内移动，该通道被放置在相关加热块的顶部表面，在整个反应过程，各加热块保持恒温[28]。这类流动式的PCR设备根据反应液流动的方向可以分成两种形式，朝一个固定方向持续流动的被称为连续流PCR，另一种反应液被驱动在两个加热块之间返复流动，可被称为“返复流PCR”。
焦磷酸盐沉淀引发浊度改变已被用于LAMP反应的视觉终点检测[23]。加入钙黄素染料可以通过荧光增强浊度。为了获得不同颜色的沉淀物，可添加阳离子聚合物以及荧光标记的引物和探针[29]。这些方法都可在反应管密闭状态下完成检测，因此可将扩增子污染的风险降至最低。此外，等温扩增和基于微阵列检出装置组合，用于多重靶点的检测[30]。新型的流体管理和分腔设置使得小规模的多靶点检测变得更加方便。 光学检测一直是Real-Time PCR的主流方案，led光源已经大部分替代了原来笨重、昂贵且容易损坏的卤素灯，光电二极管（PD）也正在越来越多的被应用于检测偶联PCR反应过程中被水解的Taqman探针发出的微弱光信号。然而由于分光的需要，检测光路所需的各种光学元件使得检测系统的微型化变的困难。电化学生物传感器已经被证明可以小型化并集成到微流控设备中[31]。
五、结论
制造商将分子诊断推向POCT环境所作的努力，促进了样本制备（核酸提取纯化）、扩增和检测等技术的发展和集成。功能集成对于分子诊断主流技术PCR在复杂性和污染风险控制等核心问题的解决是至关重要的。PCR实验室一贯强调合理的分区和必要的人员训练水平，旨在通过制度安排降低这些问题带来的风险，但同时也造成了实施分子诊断的条件障碍。制造商必须证明其系统进行了周密设计以控制这些风险。
本文讨论了目前市售的主要国内外分子POCT设备以及核酸检测各步骤相关技术的进展。分子POCT的可行性和价值已经得到认可，近年来开发兼容POC的核酸检测技术的取得显著进展。国内制造商已经推出了多款设备，更多的完全集成的分子检测设备已经处于开发后期或申报流程中。
精心选择和开发合适的关键技术的组合方式，并以更稳健、用户友好的形式提供产品仍是一个挑战。简便高效的核酸提取技术、轻量化的快速扩增和检测方法的发展为新一代的集成方案提供了更多机会。进一步的以更经济的方式提供分子POCT系统可以使得基层医疗和资源匮乏地区的医疗机构成为市场。lucira公司将LAMP和一种新型的光学检测装置组合提供了“非仪器”的一次性分子检测产品，并通过FDA EUA进入家庭自测场景，首次将分子检测的应用拓展到家用是一个振奋人心的事件。专业市场和自测市场具有迥异的需求关注，各种独特的技术组合可以通过各自方式进入市场。此外，为宠物医疗、食品安全、环境监测和兽医检测等非临床应用开发的系统与临床应用一样需要更简便、更快速等类似的特性，但更容易进入市场，并为临床分子POCT奠定基础。
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