分子生物学诊断技术在急性白血病诊断与治疗中的应用

作者:张翔 黄建松 金洁 2022-03-30
作者单位:浙江省血液肿瘤(诊治)重点实验室/浙江大学医学院附属第一医院血液科(张翔 黄建松 金洁)

金洁,主任医师,教授,博士生导师,浙江大学医学院附属第一医院血液科主任、浙江省血液肿瘤(诊治)重点实验室主任、卫生部国家临床重点学科血液学科带头人、浙江省重点学科血液学科带头人、浙江省医师协会血液学分会会长、中国女医师协会血液专委会主任委员。主要研究方向为白血病的基础和临床研究,自主设计HAA方案治疗AML获得国际认可,作为负责人获国家科技进步二等奖1项,浙江省科技进步一等奖2项、二等奖4项;现已发表SCI论文200余篇,承担国家自然科学基金7项、国家高技术863课题子课题2项、科技部重大课题子课题1项、国家十一五支撑项目等二十余项课题。

【摘要】急性白血病的诊断分型、治疗选择及预后判断已经进入了分子生物学时代,新的分子生物学技术应用使我们对急性白血病有更全面和更深入的了解,为急性白血病的精准诊治提供了技术支撑。本文系统介绍聚合酶链式反应(PCR)、基因测序、荧光原位杂交等分子生物学技术在急性白血病诊治中的应用进展,其中重点描述微滴式数字PCR技术、二代测序技术(包括转录组测序、外显子组测序、全基因组测序、单细胞测序)的优缺点和应用范围,以期促进临床工作者进一步了解新型分子生物学技术,进而合理高效地应用于急性白血病诊治。


【关键词】急性白血病;诊断和治疗;聚合酶链式反应;测序;荧光原位杂交


急性白血病(Acute leukemia,AL)是临床最常见的血液肿瘤之一,目前对于该类疾病需要基于包含形态学(Morphology,M)、免疫学(Immunology,I)、细胞遗传学(Cytogenetics,C)以及分子生物学(Molecular biology,M)的MICM体系做出诊断,其中分子生物学的信息尤为关键,例如在急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)中,若PML-RARA、AML1-ETO或者CBFβ-MYH11融合基因阳性,形态学对于原始细胞比例大于20%要求并不是诊断所必需的,在此特定条件下分子生物学信息的诊断价值超越了形态学;更为重要的是在WHO 2016对于AL的分型中,已将有特殊分子生物学的特征的AML列为独立的亚型,进而确立了分子生物学在AL诊断中的地位[1]。除此之外,分子生物学对于AL治疗的变革和推进也具有重要意义,例如AML的巩固治疗策略需要依赖基于分子生物学诊断的预后分层,而更为突出的是驱动AL的分子生物学事件的发现,引领了分子靶向治疗的发展,包括酪氨酸激酶抑制剂治疗BCR-ABL阳性的白血病[2, 3]、全反式维甲酸联合砷剂治疗PML-RARA阳性的急性早幼粒细胞白血病[4]等均在AL治疗领域取得了历史性的突破,因此,分子生物学信息在疾病治疗中也是不可或缺的。近年来,基于分子生物学信息在疾病诊断及治疗中的重要地位,相应的分子生物学技术也在不断地革新和发展,那么这些新技术在AL中如何应用、同时又为AL的诊疗体系带来了哪些变化呢,我们将在本文当中进行详述。


一、以聚合酶链式反应(PCR)为基础技术


PCR技术是分子生物学的基础,是AL融合基因、基因突变检测的经典技术。融合基因检测主要有逆转录PCR结合一代测序(RT-PCR)和逆转录定量PCR(RT-qPCR);基因突变检测则主要依靠逆转录PCR结合一代测序或者扩增阻碍突变系统PCR(ARMS-PCR);PCR对于已知融合基因及基因突变位点的检测准确性毋庸置疑,现在对于PCR的发展主要集中在检测精度上的提升。第三代PCR技术微滴式数字PCR(Droplet Digital PCR,ddPCR)是目前在临床较为推广的PCR检测方法,相较于第一代和第二代PCR,ddPCR具有灵敏度高、定量准确、通量较大的特点。首先,ddPCR灵敏度可高达0.001%,显著高于突变阻滞扩增系统(0.1%)和一代测序(10%);其次,ddPCR实现的是绝对定量,有别于RT-qPCR的相对定量,使定量更加准确;最后,ddPCR可以结合芯片技术实现高通量检测,进一步提高检测效率。利用ddPCR的特性,在AL诊治中有以下几方面的应用:1、对于常见融合基因和常见基因热点突变的检测,帮助AL的分子诊断,作用类同于传统PCR技术,但是在灵敏性上具有较大优势[5];2、对于诊断时检测到的突变或者融合进行监测,用于疗效判断并早期发现分子生物学的复发,例如AML1-ETO阳性的AML治疗策略依赖于AML1-ETO拷贝数下降的程度,且最终转为阴性者不容易复发[6],ddPCR绝对定量的特点能够使检测更准确,而且灵敏度高的特点能更加严格地定义阴性,为临床决策提供依据;3、对于AL前期状态例如克隆性造血具有筛查作用,例如通过对DNMT3A、TET2、IDH1/2等的热点突变检测[7],能够提早发现少量的克隆性造血,提醒阳性者加强随访。我们认为ddPCR在监测AL的分子生物学微小残留病灶时具有独特的优势,能够准确地评估融合以及突变的残留情况,在更深的层面评估AL的缓解情况,是该技术在AL诊治中应用最广的领域。


二、以测序(Sequencing)为基础的技术


AL研究已经进入了大数据时代,研究往往通过多组学、大样本的分析,期望获得AL或者AL的某个特殊亚型疾病全貌,随之而来的是原来作为科研技术的二代测序技术,包括转录组测序、外显子组测序、全基因组测序、单细胞测序等,变得普遍化,被推向临床用于AL的诊断和治疗,甚至有取代原有经典技术的趋势。


1. 转录组测序(RNA-Sequencing):表达致病的融合基因是AL的一个重要特点,在该病中融合基因的阳性率要远远高于其他恶性肿瘤,对于经典且融合位点较为保守的融合基因,例如PML-RARA、BCR-ABL、AML1-ETO、CBFβ-MYH11等,使用PCR结合一代测序或者定量PCR技术检测已具有很好的特异性和敏感性,但是也存在一定的局限性,包括:1、对于融合位点变异较大的融合基因例如FIP1L1-PDGFA检测效果欠佳[8];2、对于融合伙伴较多基因例如MLL[9]或者NUP98[10]并不能保证检测阳性;3、对于未知的融合基因无法检测等。RNA-Sequencing正好克服了PCR技术检测的局限性,理论上能够检测到所有已知和未知的融合,这是该技术在AL诊治中最重要的应用。除此之外,RNA-Sequencing还可以提供部分基因突变的信息,但是只有被转录的突变可以被检测到,而没有转录活化的基因突变检测不到,RNA调变比较迅速,所以没有检测到的基因突变是确实表达还是因为样本采集处理中出现了变化难以确定;RNA-Sequencing可以提供AL肿瘤细胞基因表达谱的变化,对于费城染色体样的急性淋巴细胞白血病(Ph-like acute lymphoblastic leukemia,Ph-like ALL)等依赖于表达谱类比的特殊AL亚型诊断有一定帮助,但是该法对于临床的诊断来说可操作性较差,Ph-like ALL的诊断已经被检测具有特征性的突变或者融合替代[11]。


2. 外显子组测序(Exome-Sequencing):基因突变是肿瘤包括AL在内的重要特点,尤其在AML中,例如DNMT3A、NPM1、FLT3-ITD、IDH1/2、TP53、ASXL1、TET2等突变已经证实可直接参与AML的发病[12-14]。对于基因突变的检测,PCR结合一代测序仍然是临床常用的方法,用于对已知基因的已知突变位点的检测,但是对于未知突变的检测以及检测通量存在明显的局限性。Exome-Sequencing测序主要分为两种:靶向外显子组测序(Targeted-Exome-Sequencing,TES)和全外显子组测序(Whole-Exome-Sequencing,WES),两者有各自的优缺点。TES主要针对预先设计好的固定基因进行外显子测序,优势在于测序深度高,至少能够达到5000乘以上的覆盖率,可以检测到等位基因变异率(Variant allele frequency,VAF)大于等于1%的突变,且VAF值能够精确到0.02%,能够发现这些基因外显子以及部分剪接位点突变,但是对于固定基因外的基因突变无法检测。WES针对所有基因的外显子进行测序,理论上可以发现所有基因的突变,但是由于外显子的覆盖面增加,测序深度相对TES显得不足,对于VAF值大于等于5%的突变具有可靠的检测能力。AL标本结合口腔或者毛发的胚系对照标本进行TES或者WES,可以鉴别突变为胚系突变还是体细胞突变,有助于加深对于患者疾病的认识并指导治疗。除了发现基因突变外,TES或者WES对于基因重排有一定的检测能力,但是基因的断裂点必须位于外显子剪接位点附近,否则TES或者WES无法测出;同时,TES或者WES也可以发现基因拷贝数的变化,但是仅限于影响到外显子的扩增或者缺失。


3. 全基因组测序(Whole-Genome-Sequencing,WGS):染色体的异常也是AL的重要特征,例如t(8;21)、t(9;22)、t(15;17)等都是AML中经典的染色体易位,临床往往采用染色体核型分析以及荧光原位杂交技术对肿瘤细胞的核型进行分析,但是染色体核型分析分辨率较低,对于小片段的改变难以区别,且依赖于分裂期细胞的存在,染色质成为染色体且在分裂期排列至细胞中央时才便于观察;荧光原位杂交(FISH)技术则只能检测探针所设计的靶点所在的染色体区段,不能探索未知的核型异常,所以目前临床常用的技术很难兼顾全面性和敏感性。目前认为WGS对于核型的分析可以完全替代染色体核型分析和荧光原位杂交[15],检测出AL中常见的一些染色体结构和数量异常,包括重排、缺失、获得、倒位、删除等等,并且能够达到较高的分辨率和异常的覆盖率。除了对于染色体核型的解析,WGS也基本涵盖了WES所有的功能,但是受限于测序的深度,WGS对于低频突变检测往往效率不足。


三、单细胞测序(Single-cell-based Sequencing)


AL和其他肿瘤一样,存在较大的内在异质性,上述的RNA-Sequencing、Exome-Sequencing和WGS都是针对肿瘤整体的分子生物学特点进行解析,而单细胞技术则是对于AL肿瘤内在异质性的解析。克隆演进时刻伴随着AL的发生发展,AL在某一个时间点上,存在着很多突变,包括致病的高频突变以及伴随的低频突变,这些突变之间相互存在关系是整体测序不能回答的问题,而以单细胞技术为基础的Exome-Sequencing是解决该问题的重要方法,通过该技术能够为临床提供AL的克隆构成以及克隆演进情况,为制定更加精确的靶向治疗方案提供依据[16],例如我们在使用BCL2抑制剂联合去甲基化药物阿扎胞苷治疗的AML患者中发现FLT3-ITD扩增和TP53突变获得是重要的耐药机制[17],从整体测序结果来看,我们只能得到突变及其VAF的信息,但是通过单细胞技术为基础的Exome-Sequencing,我们可以了解到在疾病复发时FLT3-ITD和TP53突变与原有突变的关系,明确FLT3-ITD和TP53突变导致的复发是属于一个新的克隆发展而来还是和在原有克隆基础上获得基因突变导致进展,对于探索疾病规律、提早靶向治疗干预有指导价值。单细胞技术为基础的RNA-Sequencing对于鉴别AL样本中肿瘤细胞与非肿瘤细胞、提供各个细胞群体的表达谱特征、解析它们之间的异质性和相互关系具有独特的优势[18, 19],但是目前更多地用于科研,而对于临床诊断和治疗目前还未有较好的应用切入点。


随着二代测序的发展和临床大量应用,似乎一代测序技术应用空间进一步被压缩,但是二代测序的结果往往是通过生物信息学分析获得的,虽然随着测序和分析技术的日趋成熟,已经具备了很高的分析准确性,但是PCR结合一代测序的验证仍然是金标准,因此,临床诊断和治疗中二代测序和一代测序的相互验证显得尤为重要。


四、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)


FISH技术本质上是分子探针,通过探针与荧光基团的偶联,能够检测RNA或者DNA定位及数量的异常。FISH目前在临床上应用最广泛的是对于染色核型的分析以及分子拷贝数的检测。FISH对于染色体核型分析主要是用于检测目的区段的变化,能够发现重排、缺失、扩增等情况,是对于染色体核型分析很好的补充,同时也能检测染色体核型分析分辨不出的新区段的改变,而且其具有检测方便迅速的特点,能够在临床第一时间提供对于AL具有治疗选择意义的靶点,例如t(15;17)导致的PML-RARA、t(8;21)导致的AML1-ETO、t(9;22)导致的BCR-ABL等,为尽快选择具有优势的诱导治疗方案提供依据。FISH还可以检测分子拷贝数的变化,例如MYC活化在AL中是重要的推动疾病发展的因素,但是MYC活化引起的原因有很多,可能是突变、重排、扩增等,通过FISH技术能够对于其中的重排以及扩增做出迅速的判断,在疾病的诊断,尤其是ALL-L3亚型的分类中,提供重要的依据[20-21]。


五、总结


虽然目前AL诊断仍然以形态学结果为基础,但是分子生物学的信息对于AL分子亚型的判断、临床结局的预测、治疗的选择以及分子靶点的发现都具有重要意义,已经成为AL临床诊治过程中不可或缺的内容。相较于以往,二代测序的推广和应用是近几年在AL诊治中最大的变化,通过不同层面的测序,基本能够解析单个患者的细胞遗传学和分子生物学特征,与传统的分子生物学技术相结合,能够使结果变得更加准确。但是从经济角度而言,二代测序的费用相对昂贵,临床实践中也很难做到完成所有层次的检测,因此,选择对于患者合理且合适的组合尤为重要,以最低的经济代价获得最有必要的信息是重要的课题;同时组学能够提供大量的信息,生物信息学的分析能够为临床医师过滤掉大部分的无用的信息,但是仍有较多的分子生物学信息需要临床医师结合疾病去伪存真,因此,提取有效的信息为临床诊治也是分子生物学时代临床医师所需要具备的能力。在分子生物学技术蓬勃发展的现在,希望能够有更新的技术加入到AL的临床诊治当中,为进一步提高AL的诊治水平和临床疗效提供强有力的支持,更好地实现精准治疗。


参考文献


Arber DA, Orazi A, Hasserjian R, et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia [J]. Blood.2016; 127(20): 2391-2405.

Kantarjian H, Shah NP, Hochhaus A, et al. Dasatinib versus Imatinib in Newly Diagnosed Chronic-Phase Chronic Myeloid Leukemia[J]. New Engl J Med.2010; 362(24): 2260-2270.

Saglio G, Kim DW, Issaragrisil S, et al. Nilotinib versus Imatinib for Newly Diagnosed Chronic Myeloid Leukemia[J]. New Engl J Med. 2010; 362(24): 2251-2259.

Lo-Coco F, Avvisati G, Vignetti M, et al. Retinoic Acid and Arsenic Trioxide for Acute Promyelocytic Leukemia[J]. New Engl J Med. 2013; 369(2): 111-121.

Alfonso V, Iaccarino L, Ottone T, et al. Early and sensitive detection of PML-A216V mutation by droplet digital PCR in ATO-resistant acute promyelocytic leukemia[J]. Leukemia. 2019; 33(6): 1527-1530.

Zhu HH, Zhang XH, Qin YZ, et al. MRD-directed risk stratification treatment may improve outcomes of t(8;21) AML in the first complete remission: results from the AML05 multicenter trial[J]. Blood. 2013; 121(20): 4056-4062.

Jaiswal S, Fontanillas P, Flannick J, et al. Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated with Adverse Outcomes[J]. New Engl J Med. 2014; 371(26): 2488-2498.

Walz C, Score J, Mix J, et al. The molecular anatomy of the FIP1L1-PDGFRA fusion gene[J]. Leukemia. 2009; 23(2): 271-278.

Li ZY, Liu DP, Liang CC. New insight into the molecular mechanisms of MLL-associated leukemia[J]. Leukemia. 2005.; 19(2): 183-190.

Michmerhuizen NL, Klco JM, Mullighan CG. Mechanistic insights and potential therapeutic approaches for NUP98-rearranged hematologic malignancies[J]. Blood. 2020; 136(20): 2275-2289.

Roberts KG, Li Y, Payne-Turner D, et al. Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia[J]. New Engl J Med. 2014; 371(11): 1005-1015.

Dohner H, Estey E, Grimwade D, et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel[J]. Blood. 2017; 129(4): 424-447.

Ley TJ, Miller C, Ding L, et al. Genomic and Epigenomic Landscapes of Adult De Novo Acute Myeloid Leukemia[J]. New Engl J Med. 2013; 368(22): 2059-2074.

[Papaemmanuil E, Gerstung M, Bullinger L, et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia[J]. New Engl J Med. 2016; 374(23): 2209-2221.

Duncavage EJ, Schroeder MC, O'Laughlin M, et al. Genome Sequencing as an Alternative to Cytogenetic Analysis in Myeloid Cancers[J]. New Engl J Med. 2021; 384(10): 924-935.

Smith CC, Paguirigan A, Jeschke GR, et al. Heterogeneous resistance to quizartinib in acute myeloid leukemia revealed by single-cell analysis[J]. Blood. 2017; 130(1): 48-58.

Zhang X, Qian JJ, Wang HF, et al. Not BCL2 mutation but dominant mutation conversation contributed to acquired venetoclax resistance in acute myeloid leukemia[J]. Biomark Res. 2021; 9(1)30.

Baryawno N, Przybylski D, Kowalczyk MS, et al. A Cellular Taxonomy of the Bone Marrow Stroma in Homeostasis and Leukemia[J]. Cell. 2019; 177(7): 1915- 1932.e16.

Wu JQ, Xiao YY, Sun J, et al. A single-cell survey of cellular hierarchy in acute myeloid leukemia[J]. J Hematol Oncol. 2020; 13(1)128.

Sesques P, Johnson NA. Approach to the diagnosis and treatment of high-grade B-cell lymphomas with MYC and BCL2 and/or BCL6 rearrangements[J]. Blood. 2017; 129(3): 280-288.

Ott G, Rosenwald A, Campo E. Understanding MYC-driven aggressive B-cell lymphomas: pathogenesis and classification[J]. Blood. 2013; 122(24): 3884-3891.