核酸扩增和检测新技术在分子诊断中的应用
周林福，博士，2004年6月毕业于浙江大学医学院，获内科学（传染病学）博士学位。2004年6月至今，浙江大学医学院基础医学系，历任讲师、副教授。主持国家科技重大专项等课题多项。
【摘要】分子诊断是指用分子生物学技术检测核酸分子，以判断遗传物质结构或表达水平的变化而做出的诊断，目前主要用于遗传病、传染性疾病、肿瘤等疾病的检测与诊断。核酸扩增和检测技术是分子诊断中最重要的检测技术。在新冠疫情中，核酸扩增技术一直是世界上应对疫情大流行的主要依赖技术。本文着重介绍了分子诊断的核酸扩增和检测相关技术如数字PCR技术、电化学PCR技术、恒温扩增技术、CRISPR/Cas13a技术、微流控技术等技术方法的原理及其应用研究进展。
【关键词】分子诊断；PCR；电化学PCR；恒温扩增；CRISPR；微流
分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴交叉学科，分子生物学相关检测技术广泛应用在科研和临床等重要领域。目前应用于临床的分子诊断技术主要有核酸扩增技术、分子杂交技术、基因测序技术等。随着我国常态化新冠疫情防控措施的落实落细，检测成本较低、操作简单、易推广、准确度和灵敏度较高，且能满足短时间高通量检测的实时荧光定量PCR法在众多检测方法中被认可成为新冠检测的金标准。但是随着检测标本量的增加，荧光定量PCR法本身的一些缺点暴露的更加明显。1. 不够快：从核酸提取、试剂配制到PCR检测的操作和衔接过程需要大量精细操作，完成一轮检测至少需要2小时，不利于迅速得到检测结果；2. 检测结果干扰因素多：如样本种类、样本采集方法、样本储存运送、干扰物质、拭子类型、保存液类型、核酸提取试剂和荧光定量PCR仪稳定性都会直接影响实验结果；3. 低浓度样本的检测准确度和灵敏度不够。为改善上述问题，研究者尝试利用多种新的扩增和检测技术，如数字PCR、电化学PCR、恒温扩增、CRISPR、微流控等技术方法来解决上述方法之不足。
一、数字PCR技术
数字PCR（digital PCR，dPCR）的概念是由Vogelstein和Kinzler在1999年[1]提出，dPCR的原理是在扩增前将反应混合物进行极限稀释，划分为多个反应单元，每个反应单元都含有PCR反应必须的引物探针、酶、缓冲液等，而由于核酸模板数量有限，每个反应单元的核酸模板数为0个或1个，每个反应单元进行PCR扩增后以终点信号的有无作为判断标准，最后根据泊松分布原理计算靶标分子的浓度。它不需要标准曲线或内参基因，在数万个反应单元中独立检测目的序列，显著降低每个反应单元中背景基因和干扰物质的丰度，大大提高了检测灵敏度和对特定扩增抑制剂的耐受性。现有的dPCR根据液体分散方式分类：微流控芯片式、自吸分液式和微滴式，其中微流控芯片是将芯片表面光刻多个腔室，通过阀门控制液体流动和分液；自吸分液式是将芯片表面进行疏水处理，微孔为亲水处理，这种亲疏水的方式可以将反应体系自动的分割为多个独立反应体系。微滴式是将反应体系通过油包水技术乳化分散在大小均一的液滴反应单元中[2]，相比以上两种dPCR技术，微滴式dPCR仪成本更低。
已经商业化的微流控芯片式dPCR仪主要有ThermoFisher公司Quant Studio、Fluidigm公司BioMark和Forulatrix公司Constellation系统。微滴式dPCR仪主要有Bio-Rad公司QX100、QX200和RainDrop系列，锐讯生物公司DropX-2000、小海龟BioDigital以及法国Stilla Technologies公司Naica System[3]。
由于dPCR有超高的灵敏度和较低的浓度变异系数，目前主要用于稀有突变位点检测、拷贝数变异（CNV）检测、NGS文库精确定量等。dPCR在新冠的环境样本和临界浓度新冠样本检测发挥更大的优势。Suo, T等[4]分别对14例新冠疑似患者和63例确诊患者的临床样本进行dPCR和荧光定量PCR的盲样检测，对比结果发现，有26例确诊患者的荧光定量PCR检测阴性的样本，用dPCR随访检测为阳性。该文作者认为dPCR可以作为恢复期患者新冠样本检测结果再确认的补充手段。
相比荧光定量PCR，dPCR技术虽然有颠覆性的技术优势，但该技术的推广仍有一定的难度。dPCR技术目前存在的不足主要有以下多个方面：试剂盒仪器成本较高；实验周期一般要3-4h左右；现阶段的实验流程从样本处理到数据分析操作复杂，对操作人员技术要求较高；且液体分散时会有样品残留，加大定量浓度的标准偏差，低浓度样本检测时更加明显[5]（艾滋病模型中关键指标SIV DNA绝对定量）；检测浓度有上限，浓度过高会导致定量结果不准确，需要稀释后重新检测等不利因素。
Wu X等[6]将CRISPR与dPCR结合起来进行检测，可以在40-60min内得到精确的定量结果。Chen等[7]利用离心力和毛细管作用力可以在很短时间内将PCR体系分散在含有油相的普通PCR管中，扩增后加入的甜菜碱大幅度降低乳剂的光散射，利用快速三维光片荧光成像系统，快速重建整个PCR乳液的三维结构，并实现阳性液滴的数字计数。该技术操作简单，耗材与普通PCR仪通用，防止液体转移的损耗，能够非常准确快速的测定样本浓度。
二、电化学PCR技术
电化学PCR是将PCR扩增和电化学生物传感器检测相结合的技术，并集成在一起，旨在提供一种快速、小型化、手持式仪器。电化学生物传感器的工作原理是工作电极与水电解质中的特定目标分析物相互作用，产生与其浓度相对应的电信号[8]，如产生的氧化或还原信号与PCR扩增产物的数量相关。另外，还有使用纳米材料来标记PCR扩增引物，如金纳米颗粒或半导体量子点，具有标记的PCR扩增引物的扩增产物通过产生电化学信号进行定量检测[9]。电化学PCR中使用的电化学活性标签（如金属配合物、有机分子等）比荧光染料更耐用和更便宜，同时电化学法检测所需要的成本也远低于光学器件[10]。
国外已经有一些公司利用电化学PCR技术开发出相应的微流控产品。其中Atlas Genetics io系统检测模块就是采用电化学检测方法，其电化学检测的原理为：用不对称PCR产生单链DNA，然后单链PCR产物与具有二茂铁标签的探针结合成双链DNA。核酸外切酶消化双链DNA产物，探针上的二茂铁会在水解过程释放出来，从而导致溶液中电化学性质改变，这种改变被电化学传感器检测到并转化为电信号的改变，从而达到检测的目的[11]。另外，GenMark公司的ePlex采用了类似于Atlas Genetics io产品的电化学检测来取代常规的荧光检测。与Atlas Genetics io不同的是，非对称扩增产生大量单链DNA后，单链DNA跟两个探针结合。一条探针被固定在电极上，一条探针被电化学标记物标记。单链DNA先一端与固定探针结合，再另一端与标记的探针结合，因为标记探针靠近了电极，从而检测到了电信号改变。FDA最近也批准了运行在ePlex平台的GenMark ePlex® SARS-CoV-2检测试剂盒[12]。
三、恒温扩增技术
恒温扩增技术（isothermal amplification technology，IAT）是一种在恒定温度条件下、较短时间内和特定酶作用下即可完成核酸扩增的技术。与PCR方法相比，恒温扩增技术是一种快速、特殊、更简单、更便宜的样品核酸检测方法。根据反应原理和技术的不同，恒温扩增技术主要有环介导恒温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[13]、依赖解旋酶扩增（helicase-dependent amplification，HDA）[14]、链替代扩增（strand displacement amplification，SDA）[15]、重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）[16]、依赖核酸序列扩增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）[17]、滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）[18]、信号介导RNA扩增技术（Signal—mediated amplification of RNA technology，SMART）[19]、多交叉置换扩增技术（Multiple Cross Displacement Amplification，MCDA）[20]和切口酶扩增反应（Nicking Enzyme amplification，NEAR）[21]等。
LAMP是基于DNA在恒温60℃-65℃处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会变成单链，在此前提下利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，在链置换型DNA聚合酶的作用下，以外侧引物区段的3’末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成大量具有互补序列和交替、重复结构的DNA扩增产物[22]。LAMP在分子诊断上有着大量的应用，Meridian Bioscience的Alethia系列产品、3M公司的3M™ Molecular Detection System、Pro-Lab Diagnostics公司的Pro-AmpRT SARS- CoV-2 Test和Atila BioSystems，Inc.公司的iAMP COVID-19 Detection Kit均采用的LAMP技术。
NASBA是结合了自主序列复制系统（Serf-sustained sequence replication，3SR）和转录依赖扩增系统（Transcription based amplification system，TAS）两种方法整合并改进。使用PCR引物、RNaseH、T7 RNA聚合酶和AMV逆转录酶一起完成恒温扩增。NASBA检测技术现在已经十分成熟，在国际上受到基础科学和应用科学研究领域的一致认可。Biomeriex公司的恒温扩增产品便是采用这种方法设计的。
RPA的反应温度为37℃-42℃，反应体系包括1对引物和3种关键酶：重组酶与引物结合, 形成蛋白-核酸聚合体，并利用引物特异性特征在模板DNA上寻找到与之完全互补的靶向序列；此时重组酶离开引物，并在DNA聚合酶的作用下合成新DNA链，与此同时单链DNA结合蛋白（single strand DNA-binding protein，SSB）被激发，同被置换出来的DNA单链进行结合，防止DNA模板再次形成双链。目前，RPA在国际上主要是被雅培收购的TwistDx的核酸扩增产品运用了该技术。
NEAR是一种链置换放大技术，其原理是在核酸切刻内切酶切刻形成的裂口处，通过聚合酶的作用以dNTPs为原料从裂口处的3’端聚合延伸，置换出等位的DNA链，由此又形成了新的完整的含有切刻酶识别位点的DNA序列。这条双链再次被核酸切刻内切酶识别切割，进而开始“聚合-切刻”的循环，产生大量被置换下来的DNA单链，形成指数级扩增。被雅培收购的Alere ID NOW便是使用NEAR技术开发人类疾病诊断试剂盒及仪器。
SDA主要依赖于限制性内切酶对半硫代磷酸化碱基对应互补链的切割作用，以及聚合酶exo-klenow对切口的延伸作用和对下游DNA片段的置换作用。其中，BD Diagnostics的BD ProbeTec™产品采用这种方法。
HDA是根据DNA体内复制主要依赖于DNA解旋酶、DNA聚合酶以及各种辅助因子的复制机制，模拟出依赖解旋酶扩增技术。Quidel Corporation的恒温扩增产品便是采用HDA原理设计的。
四、CRISPR技术
CRISPR/Cas系统是由成簇规律间隔短回文重复序列及其相关基因（Clustered regularly interspaced short palindromic Repeats，CRISPR）序列与Cas核酸酶构成，是基因组编辑的基础，该技术在分子诊断检测也越来越热门。CRISPR是在细菌和古菌基因组中发现的一个DNA序列家族。Cas是基因编辑工具中最常用的内切酶，利用引导RNA与目标序列结合或切割目标DNA和RNA，从而产生信号。由于其高特异性，这种方法在床旁诊断中具有较大吸引力。
CRISPR/Cas13a检测体系又称之为“SHERLOCK”，经过RPA 37℃~42℃间恒温反应获得双链DNA后，需经来自T7噬菌体的T7 RNA聚合酶转录成RNA，之后与Cas13a反应。当gRNA与目标序列配对后，Cas13a蛋白质会切割附近任何RNA分子，包含报导RNA。报导RNA 被切断后，会发出荧光[23]。CRISPR/12a是一类借助Cas12a蛋白识别并剪切双链DNA的检测技术，又称之为“DETECTR”[24]。到目前为止，科学家们已在试管水平证明“DETECTR”可以100%准确地检测出HPV16感染，92%准确地检测出HPV18感染。该方法使用环介导恒温扩增RT-LAMP技术，对从鼻咽或口咽拭子中提取的RNA进行反转录和恒温扩增，然后利用Cas12a检测设定的冠状病毒序列。Hou等[25]人开发了一种名为CRISPR-covid的快速检测SARS-CoV-2，实验周期更短（~40min），并同步与RT-PCR和宏基因组测序进行对比[26]。Boning使用CRISPR/cas12a系统无需RNA提取，利用RT-RPA-CRISPR和手持式的荧光检测系统在15min即可得到结果，线性范围为1~105拷贝/ul，检测限为0.38拷贝/ul，高于对比的qRT-PCR的结果。
五、微流控技术
微流控（microfluidics）是指在微米和亚微米级别流道或空间上对微小量级的流体进行精准操控与分析检测的技术[27]。微流控核心为实现流体操控载体的微流控芯片，其可以进行样品分离、纯化、试剂混合反应和检测分析等步骤，涵盖小型化实验的基本过程[28]。微流控芯片具有集成化、自动化和微型化等特点，因此也被称为“微型全分析系统”（micro-Total Analytical System，μTAS）和“芯片实验室”（Lab-on-a-chip，LOC）[29]。
微流控平台起源于20世纪90年代，最近十几年中在分子诊断应用中稳步发展。以微流控技术为基础的即时检验（point-of-care testing，POCT），是对传统检验的一个有利补充[30]。微流控芯片技术将核酸提取、扩增和检测集成于一起，因而可摆脱专业繁琐的操作以及对专业实验室的依赖，从而可以由非专业人员完成操作，普及到医院门急诊、床旁检测，甚至可以居家自测，受众更加广泛，临床适应性更强。此外，由于反应过程处于封闭的环境中，可以消除交叉污染的可能性，同时也避免操作者感染的风险。由于功能集成，提高了检测效率，因此可以在较短时间内完成多个项目的检测，显著提升检测效率。
现在主要的商业化微流控分子诊断产品包括GeneXpert全自动分子诊断平台，FilmArray全自动分子诊断平台，Atlas Genetics io系统，ePlex检测系统，Cobas Liat PCR检测系统，Revogene全自动化分子诊断设备以及国内博晖创新的GenPlex微流控全自动核酸检测系统等。其中，GeneXpert系统是全球首套整合自动完成样品裂解、核酸纯化浓缩、定量PCR扩增检测，提供快速、准确的测试结果于一体的系统[31]。GeneXpert的测试盒由多个腔室组成，每个腔室分别装有不同的试剂，同时保留处理废物的腔室，测试盒附加有一个PCR反应室。通过活塞抽提-压入方式操控微流体的流动，以实现整个检测的流程。同时，使用试剂冻干粉预存储技术，操作更为简便。另外，Filmarray是由BioFire公司研发的基于微流控技术的全自动分子诊断平台。该产品采用多重PCR和巢式PCR技术，同样使用了试剂冻干粉预存储技术。
Atlas Genetics io微流控芯片内部跟GeneXpert的设计类似，通过施加压力来操控微流体的流动，以实现整个检测的流程。不过，与常规使用光学法来检测目标产物不同，Atlas Genetics io系统采用电化学检测方法，所以仪器中就不需要复杂光学器件，同时电化学法检测所需要的成本也远低于光学器件，从而使其成本可以做的更低。
ePlex是由GenMark公司研发的基于微流控技术的全自动化的分子诊断设备。ePlex使用了数字微流控技术（digital microfluidics），整个反应是以电润湿（electrowetting on dielectric，EWOD）来对液滴在平面电极阵列中进行操控来实现的。同时采用了类似于Atlas Genetics io产品的电化学检测来取代常规的荧光检测。
另外，Micronics Inc开发的PanNAT System是一种紧凑、全自动的分子诊断设备，可处理单个测试盒。QuantuMDx的Q-POCTM利用连续PCR技术，可以处理血液、新鲜组织、石蜡包埋组织、痰液和拭子。SRI开发了用于检测细菌和病毒的低成本Sentinel Nucleic Acid Analysis系统[32]。
上述5大类技术方法各有特色和适用范围，将可能会成为在分子诊断各细分领域的主要检测方法。
参考文献
Vogelstein B, Kinzler K W. Digital pcr[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96(16): 9236-9241.
Dueck M E, Lin R, Zayac A, et al. Precision cancer monitoring using a novel, fully integrated, microfluidic array partitioning digital PCR platform[J]. Scientific reports, 2019, 9(1): 1-9.
冯秀晶, 易红梅, 任星旭, 等. 数字 PCR 技术及其在检测领域的应用[J]. 遗传, 2020, 42(4): 363-373.
Suo T, Liu X, Feng J, et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens[J]. Emerging microbes & infections, 2020, 9(1): 1259-1268.
Suo T, Liu X, Feng J, et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens[J]. Emerging microbes & infections, 2020, 9(1): 1259-1268.
Wu X, Tay J K, Goh C K, et al. Digital CRISPR-based method for the rapid detection and absolute quantification of nucleic acids[J]. Biomaterials, 2021, 274: 120876.
Liao P, Jiang M, Chen Z, et al. Three-dimensional digital PCR through light-sheet imaging of optically cleared emulsion[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2020, 117(41): 25628-25633.
Drummond T G, Hill M G, Barton J K. Electrochemical DNA sensors[J]. Nature biotechnology, 2003, 21(10): 1192-1199.
Santhanam M, Algov I, Alfonta L. DNA/RNA electrochemical biosensing devices a future replacement of PCR methods for a fast epidemic containment[J]. Sensors, 2020, 20(16): 4648.
2.Deféver T, Druet M, Evrard D, et al. Real-time electrochemical PCR with a DNA intercalating redox probe[J]. Analytical chemistry, 2011, 83(5): 1815-1821.
Ferapontova E E, Hansen M N, Saunders A M, et al. Electrochemical DNA sandwich assay with a lipase label for attomole detection of DNA[J]. Chemical communications, 2010, 46(11): 1836-1838.
Gupta N, Augustine S, Narayan T, et al. Point-of-Care PCR Assays for COVID-19 Detection[J]. Biosensors, 2021, 11(5): 141.
Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic acids research, 2000, 28(12): e63-e63.
Vincent M, Xu Y, Kong H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification[J]. EMBO reports, 2004, 5(8): 795-800.
Walker G T, Fraiser M S, Schram J L, et al. Strand displacement amplification—an isothermal, in vitro DNA amplification technique[J]. Nucleic acids research, 1992, 20(7): 1691-1696.
Piepenburg O, Williams C H, Stemple D L, et al. DNA detection using recombination proteins[J]. PLoS biology, 2006, 4(7): e204.
Malek L, Sooknanan R, Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA™)[M]//Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes. Humana press, 1994: 253-260.
Ali M M, Li F, Zhang Z, et al. Rolling circle amplification: a versatile tool for chemical biology, materials science and medicine[J]. Chemical Society Reviews, 2014, 43(10): 3324-3341.
Wharam S D, Marsh P, Lloyd J S, et al. Specific detection of DNA and RNA targets using a novel isothermal nucleic acid amplification assay based on the formation of a three-way junction structure[J]. Nucleic Acids Research, 2001, 29(11): e54-e54.
Wang Y, Wang Y, Ma A J, et al. Rapid and sensitive isothermal detection of nucleic-acid sequence by multiple cross displacement amplification[J]. Scientific reports, 2015, 5(1): 1-16.
Deng H, Gao Z. Bioanalytical applications of isothermal nucleic acid amplification techniques[J]. Analytica chimica acta, 2015, 853: 30-45.
Notomi T, Mori Y, Tomita N, et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects[J]. Journal of microbiology, 2015, 53(1): 1-5.
Gootenberg, Jonathan, S, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.[J]. Science, 2017.
Aman R, Mahas A, Mahfouz M. Nucleic acid detection using CRISPR/Cas biosensing technologies[J]. ACS synthetic biology, 2020, 9(6): 1226-1233.
Ning B, Yu T, Zhang S, et al. A smartphone-read ultrasensitive and quantitative saliva test for COVID-19[J]. Science advances, 2021, 7(2): eabe3703.
Hou T, Zeng W, Yang M, et al. Development and evaluation of a rapid CRISPR-based diagnostic for COVID-19[J]. PLoS Pathogens, 2020, 16(8): e1008705.
Whitesides G M. The origins and the future of microfluidics[J]. nature, 2006, 442(7101): 368-373.
Liu K K, Wu R G, Chuang Y J, et al. Microfluidic systems for biosensing[J]. Sensors, 2010, 10(7): 6623-6661.
Harrison D J, Fluri K, Seiler K, et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip[J]. Science, 1993, 261(5123): 895-897.
Jung W, Han J, Choi J W, et al. Point-of-care testing (POCT) diagnostic systems using microfluidic lab-on-a-chip technologies[J]. Microelectronic Engineering, 2015, 132: 46-57.
Raja S, Ching J, Xi L, et al. Technology for automated, rapid, and quantitative PCR or reverse transcription-PCR clinical testing[J]. Clinical chemistry, 2005, 51(5): 882-890.
Gupta N, Augustine S, Narayan T, et al. Point-of-Care PCR Assays for COVID-19 Detection[J]. Biosensors, 2021, 11(5): 141.
