成人隐匿性自身免疫糖尿病相关生物标志物的研究与临床诊断价值

牛文彦，医学博士、教授、博士研究生导师。现任天津医科大学朱宪彝纪念医院检验科主任，长期从事与肥胖和糖尿病相关的胰岛素抵抗的发病机制和改善机制的研究。主持6项国家自然科学基金资助课题项目、1项天津市科技支撑重大项目、2项天津市科技局重点项目、1项天津市卫健委重点项目等。获天津市科技进步二等奖1项。获国家发明专利1项。发表SCI收录论文50余篇。兼任天津医学会检验分会副主任委员、天津市医师协会检验医师分会副会长、中国老年医学会检验分会常委、天津市医药学专家协会内分泌专业委员会委员等。担任Theranostics和 Diabetologia等20余个SCI杂志审稿人。指导博士后2名、博士研究生9名、硕士研究生40余名。担任国家卫健委“重大新药创制”科技重大专项二审评委、国家自然科学基金重点、优青、面上、青年项目二审评委、国家卫健委“国家重大研发计划”重点专项、教育部优博论文、全军优博论文评委等。

付正香，天津中医药大学第一附属医院检验科，主管技师，硕士研究生。从事临床医学检验工作十余年，主要研究方向为肥胖与糖尿病的发病及治疗相关分子机制，先后发表中英文科研论文5篇。

【摘要】成人隐匿性自身免疫糖尿病（latent autoimmune diabetes in adults，LADA）是一种以胰岛β细胞遭受自身免疫损害为特征的疾病，具有成年发病、隐匿起病、具有自身免疫证据和最终依赖胰岛素治疗等特点。LADA的早期临床表现酷似2型糖尿病（T2DM），但发病机制与1型糖尿病（T1DM）类似，在临床诊疗过程中极易发生漏诊和误诊，因此探究LADA的发病机制，筛选具备高辨识度的实验室诊断指标，将LADA从初诊T2DM患者中鉴别出来成为解决问题的关键。目前免疫学、遗传学、炎症代谢、伴发症等相关生物标记物已成为LADA早期诊断、鉴别诊断和干预治疗的重要依据。

【关键词】成人隐匿性自身免疫糖尿病；筛选；生物标记物；早期诊断

成人隐匿性自身免疫糖尿病（LADA）是一种成年起病，临床早期不依赖胰岛素治疗，以胰岛β细胞遭受缓慢自身免疫损害为特征的自身免疫糖尿病。LADA患者在全球普遍存在，在我国它是成年人自身免疫糖尿病的最常见类型。LADA的临床异质性大，它虽然具有T1DM和T2DM的部分特征，但是在遗传背景、自身免疫反应、胰岛功能衰退速度、临床代谢特征等方面，LADA又与两者存在差异。基于病因学证据，2020年美国糖尿病学会将LADA归属为T1DM的自身免疫缓慢进展亚型[1]。目前随着国内外研究的深入，关于LADA的筛查和早期诊断方面取得了新的进展，但仍存在争议。本文将分别从体液免疫、细胞免疫、遗传、炎症代谢、伴发症五个方面阐述总结LADA诊断相关生物标记物的研究进展与应用。

一、胰岛自身免疫标志物

1. 体液免疫标记物：LADA的体液免疫反应主要表现为血清中存在胰岛自身抗体，常见的胰岛自身抗体有：胰岛细胞抗体（ICA）、谷氨酸脱羧酶抗体（GADA）、蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体（IA-2A）、锌转运体8自身抗体（ZnT8A）、胰岛素自身抗体（IAA）和4次跨膜蛋白7抗体（Tspan7A）。此外，随着研究的不断深入，更多的其它胰岛自身抗体不断被发现，为LADA的诊疗提供更多的线索。

（1）ICA：最初于1974年被发现，是最早被发现的胰岛自身抗体。ICA是一类和全部胰岛细胞（α、β、δ、PP细胞）发生反应的多克隆自身抗体的统称，它并非胰岛β细胞所特异的。属于胰岛β细胞的胞质抗体主要通过特异性与其胞质成分反应产生细胞毒效应，进而激活补体系统导致人体的糖代谢障碍[2]。ICA通常出现于疾病的早期阶段，有助于LADA的早期诊断，但由于ICA检测的标准化难度较高，不适用于大规模筛查，已逐渐被GADA、IA-2A、IAA及ZnT8A等抗体替代，目前临床应用有限。

（2）GADA：谷氨酸脱羧酶（GAD）是催化抑制性神经递质γ氨基丁酸合成的限速酶，根据其相对分子量分为GAD65和GAD67两种亚型，人类胰岛细胞主要表达GAD65亚型。其抗体GADA是LADA患者最常见的胰岛自身抗体，GADA一旦生成可与谷氨酸脱羧酶结合，使其失去活性，干扰胰岛素的合成与分泌[3]。GADA阳性预示内泌性胰岛素的缺乏或缺失。GADA滴度能预测LADA患者的β细胞功能衰竭程度，GADA滴度越高胰岛功能衰竭越快，更容易依赖胰岛素治疗[4]。GADA是公认的诊断LADA最敏感的免疫指标，我国一项大型全国多中心研究结果显示，GADA在T2DM阳性率为2.6%-10%，明显高于IA-2A、IAA及ZnT8A等抗体[5]。与其他抗体相比，GADA特异性好、敏感性高、在患者体内持续时间长，且随着病程延长波动幅度小，可以有效地将LADA患者从T2DM人群中分离出来，对LADA的预测及早期诊断具有重要临床意义。国际共识和我国共识均推荐把GADA 作为LADA的初筛抗体。

（3）IA-2A：酪氨酸磷酸酶样蛋白质分子（IA-2）是胰岛细胞上的一种跨膜糖蛋白，参与调节胰岛素分泌，其抗体IA-2A主要通过针对IA-2的膜内结构反应而产生，当某些因素影响到膜内结构时，就会使膜内结构暴露从而启动针对胰岛β细胞的特异性自身免疫应答。

研究表明，IA-2A的产生同自身免疫介导的B细胞损伤有关[6]，因此IA-2A通常被认为是胰岛早期免疫成分中最能够反应B细胞损伤的特异性指标。IA-2A在初诊T2DM中的阳性率较低，其检出率会随病程的增加而下降，对GADA阳性者加测IA-2A，增加LADA患者对胰岛素治疗需要的预测[7]，故通常把IA-2A作为LADA筛查的二线抗体。

（4）IAA：IAA于1983年在未使用外源性胰岛素治疗的TIDM患者血清中被首次发现。IAA的产生机制可能与胰岛β细胞损伤所导致的结构变异的胰岛素分子释放有关。IAA在初诊T2DM中阳性率达2%左右，与经典T1DM不同，其分布与年龄无关。临床应用中IAA常联合其它抗体检测，GADA和IAA同时阳性的LADA患者与随后快速需要胰岛素治疗相关联，IAA阳性但GADA/IA-2A阴性的个体缓慢发展为胰岛素依赖。

值得注意的是，由于外源胰岛素本身可诱导IAA的产生，因此，IAA检测建议只在尚未使用胰岛素治疗的T2DM患者中应用。

（5）ZnT8A：锌离子转运蛋白8（ZnT8）是胰岛β细胞特异性的锌离子转运体，为胰岛素成熟储存过程中锌离子的供应者，当锌离子水平及转运过程受到干扰时，就会影响胰岛素的合成、储存及分泌过程，甚至对胰岛细胞的旁分泌过程也造成影响[8]。

ZnT8A于2007年被发现，在初诊T2DM中阳性率与IA-2A相似，且稳定性也较好，在已检测GADA基础上，进一步联合ZnT8A和IA-2A能将LADA的阳性诊断率由6.43%提高到8.62%。ZnT8A是LADA筛查的二线抗体。

（6）Tspan7A：4次跨膜蛋白（Tspan7）是4次跨膜蛋白超家族中的一种糖蛋白，它位于细胞表面，由TM4SF2基因编码，其抗体Tspan7A是一种新型胰岛自身抗体。研究证实，Tspan7A阳性的LADA患者胰岛功能更差，有利于早期识别胰岛β细胞衰竭风险高的患者，对于LADA的胰岛功能预测具有一定的临床意义。我国LADA患者Tspan7A阳性率为21.4%，在GADA、A-2A和ZnT8A基础上增加Tspan7A检测，可将多抗体阳性的LADA患者比例从22%提升至32.4%[9]。因此，2021版成人隐匿性自身免疫糖尿病诊疗中国专家共识将Tspan7A纳入作为LADA的常规筛查抗体[10]。

（7）其它胰岛自身抗体：除以上经典胰岛自身抗体外，目前已发现更多其它胰岛自身抗体，如：CPH-A（羧基肽酶H自身抗体）、SOX13-Ab（转录因子SOX13抗体）、CD38抗体、Glima38抗体等。相对于经典抗体，这些抗体普遍具有阳性检出率比较低、敏感性和特异性不理想、绝大多数出现于病程中晚期等特点，对于LADA的诊断和预测价值不大，通常需要同其它抗体联合检测才能获得相应的诊断效果，因此目前的临床应用率比较低。

胰岛自身抗体作为胰岛自身免疫标志物，是将LADA从初诊2型糖尿病患者中识别出来的重要免疫学标志物，是目前诊断LADA必不可少的指标，多种抗体的联合检测已成为筛查和诊断LADA的重要手段。随着对糖尿病患者胰岛自身抗体研究的更加深入，相信将会有更多的胰岛自身抗体标记物被发掘，对LADA患者起到更好的临床诊断效果。

2. 细胞免疫生物标记物：1992年Zavala等发现LADA患者的外周血单个核细胞（PBMC）可抑制大鼠的胰岛细胞分泌胰岛素，证明其体内存在细胞介导的自身免疫反应。LADA的细胞免疫异常主要表现在血液循环中多种免疫细胞（T细胞，B细胞，NK细胞和中性粒细胞）及其亚群数量和功能的改变。

（1）胰岛自身免疫T细胞：1999年，Brooks-Worrell等采用细胞免疫印迹技术研究发现，部分抗体阴性的临床诊断T2DM的患者存在对胰岛蛋白的细胞免疫反应，这类患者因胰岛抗体阴性、而外周血T细胞对胰岛抗原呈增殖反应，被称为“T-LADA”[11]，“T-LADA”的发现提示在胰岛抗体阴性的患者中检测胰岛自身免疫T细胞可进一步识别胰岛自身免疫病患者。同时利用酶联免疫斑点试验发现，LADA患者中存在GAD65反应性T细胞，提示T细胞联合胰岛抗体检测可提高LADA诊断的灵敏度[12]。除此之外，LADA患者T细胞亚群也存在数目和功能的改变，其调节性T细胞mRNA表达水平下降，CD4+T细胞甲基化程度增加，Th1/Th2细胞比例失衡[13]。并且T细胞亚群的分布与C肽水平相关，提示其可能用来预测LADA患者胰岛功能的变化[14]。基于以上证据，成人隐匿性自身免疫糖尿病诊疗中国专家共识（2021版）将胰岛自身免疫性T细胞纳入LADA的诊断标准。由于目前T细胞检测要求较高，建议有条件的单位开展，为抗体阴性的LADA提供细胞免疫诊断手段。

（2）B细胞：B细胞也可能参与LADA的病理机制。研究发现，LADA患者存在B细胞亚群的改变，主要表现为边缘区B细胞比例增加，滤泡状B细胞以及产生白细胞介素-10的B细胞比例下降，这些频率改变与胰岛功能和血糖有关[15]，具体机制仍需进一步研究。

（3）NK细胞和中性粒细胞：NK细胞和中性粒细胞在人体的固有免疫中发挥着重要作用，有证据表明二者参与LADA的发病过程。研究发现，LADA患者外周NK细胞数量减少，并且其亚群频谱也发生了改变；与健康人群相比，LADA患者的中性粒细胞RNA表达谱也存在明显差异[16, 17]。

LADA的临床异质性大，难以用单一的临床和免疫指标界定，单以抗体诊断LADA在一定程度上会导致漏诊。LADA是T细胞介导的自身免疫病，直接检测针对胰岛自身抗原的细胞免疫反应可以弥补抗体筛查的弊端，所以在抗体筛查基础上，对临床疑诊LADA但又缺乏抗体证据的患者进行细胞免疫检测，可以提高LADA的诊断效率。

二、遗传特征标志物（易感基因）

LADA的发病具有显著的遗传背景。T1DM和T2DM的易感基因均参与LADA的发病[18]。

1. T1DM易感基因：综合国内外研究发现，人类白细胞抗原HLA-Ⅱ类基因是LADA的主要易感基因，全基因组关联研究证实LADA的遗传特征大部分与经典T1DM类似，LADA最易感的位点是HLA-DQB1基因rs9273368，但LADA的HLA易感基因频率明显低于经典T1DM。LADA的HLA易感基因具有种族特异性，不同种族的LADA患者易感基因存在显著差异，中国LADA患者最常见的HLA-Ⅱ类易感基因型是DR9/DR9。此外，LADA与T1DM相关的非HLA基因也存在关联，这些基因包括：胰岛素基因（INS）、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4基因（CTLA4）、SH2B衔接蛋白3基因（SH2B3）、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22基因（PTPN22）C1858T等[19]。

2. T2DM易感基因：LADA相关的T2DM易感基因有转录因子7类似物2（TCF7L2）、ZMIZ1基因、KCNQ1基因等。目前研究最多的是TCF7L2，TCF7L2的rs7903146位点是欧洲高加索LADA超重患者人群的易感基因[20]。研究显示，LADA患者的GADA抗体滴度值与T2DM的易感基因变异型相关[21]。

通过检测遗传特征标志物，制定基因风险评分模型可对胰岛抗体阳性患者的病程进展分级，并有利于识别出快速进展至胰岛素依赖的LADA患者[22]。目前关于LADA易感基因的研究仍具有局限性，并且与正常人群部分重叠，因此遗传特征标志物还不能作为独立诊断指标，只能对LADA起到辅助诊断作用。

三、胰岛素抵抗及代谢综合征相关生物标志物

众所周知，T2DM发病机制主要为胰岛素抵抗，胰岛素抵抗导致的系统性炎症与T2DM的发病密切相关。我国一项采用高胰岛素正糖钳夹评价胰岛素敏感性的研究显示，LADA的胰岛素抵抗程度与T2DM相似[23]，提示LADA患者体内同样存在胰岛素抵抗相关的系统性炎症。

代谢综合征的核心病理生理基础是胰岛素抵抗，LADA血循环中炎症细胞因子失衡所致胰岛素抵抗可能是其发生代谢综合征的重要机制[24]。研究发现，多项低度炎性标志物（超敏C反应蛋白、脂联素、白细胞介素-6、可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ等）联合模型对LADA患者具有潜在的诊断价值[25]。这些炎性因子可能通过影响胰岛素信号通路、调控基因表达、作用于其它细胞因子或者直接损伤胰岛β细胞等途径导致胰岛素抵抗[26]，使患者表现出相应的临床症状。随着研究的进一步深入，这些炎症指标有潜力成为LADA诊断和治疗的早期生物标志物。

四、伴发病相关生物标志物（非胰岛细胞自身抗体）

LADA是一种自身免疫性疾病，可作为自身免疫多内分泌腺病综合征（APS）的一个重要组成部分，易伴发其他自身免疫病或自身免疫相关抗体。较常见的自身免疫病包括自身免疫性甲状腺病、乳糜泻、Addison病和自身免疫性胃炎等。研究表明，伴发症患病风险与胰岛自身抗体滴度相关，例如高滴度GADA女性患者易患自身免疫性甲状腺疾病、IA-2A阳性患者乳糜泻的风险增高。LADA患者体内非胰岛β细胞器官特异性的自身抗体的阳性检出率较高，其中自身免疫性甲状腺疾病相关的甲状腺过氧化物酶抗体（TPO-Ab）、乳糜泻相关的转谷氨酰胺酶抗体（tTG-Ab）及Addison病相关的21羟化酶抗体（21OH-Ab）阳性率分别为16.3%、2.1%、1.8%[27]。这些抗体虽然对LADA的诊断无特异性，但可在LADA的诊断中起到提示和辅助作用，应格外引起重视。

糖尿病是由遗传、环境、行为等多因素复杂作用所导致的一组常见病和多发病。在糖尿病中以T1DM和T2DM为经典类型。依据病因学分类，LADA归属于T1DM的自身免疫亚型。在中国，LADA约占全部成年人T1DM患者的2/3，远高于经典T1DM。由于LADA早期临床表现与T2DM类似，容易导致漏诊而延误治疗，因此LADA的早期筛查和准确诊断成为防治的关键。实验室相关生物标记物在LADA的筛查和诊断过程中扮演着重要角色，其中胰岛自身抗体阳性又是诊断LADA的必不可少的指标；随着研究的进一步深入，胰岛自身免疫T细胞阳性被“2021版成人隐匿性自身免疫糖尿病诊疗中国专家共识”纳入LADA的诊断标准；基因、胰岛素抵抗及代谢相关炎性介质以及非胰岛细胞自身抗体也已经成为LADA的辅助诊断依据。随着实验室技术和临床实践的进步，国内外有关LADA的研究已经取得了诸多重要进展，希望将来有越来越多的生物标记物被发掘，为LADA的精准诊疗提供新的思路和证据。

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