肾脏生物标志物在糖尿病肾病早期诊断中的价值与临床应用

邸阜生，教授、主任医师，天津市第三中心医院内分泌科主任，内科教研室主任，循证医学教研室主任，中华医学会内分泌专业委员会肝脏与代谢学组委员，中国医师协会内分泌代谢分会委员，中国医师协会循证医学专业委员会全国常委，天津市糖尿病学会副主任委员，天津市中西医结合学会内分泌代谢分会副主任委员，天津市医学人文学会副主任委员。

常云鹏，医学博士、医师。现任天津市第三中心医院内分泌科住院医师，天津市中西医结合学会内分泌专业委员会青年委员，参与多项国家自然科学基金的研究工作，参与多篇SCI期刊学术论文发表。

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）作为糖尿病微血管并发症之一，是终末期肾脏疾病（end-stage renal disease，ESRD）的主要原因，也是糖尿病患者寿命缩短的主要原因之一[1]。DKD早期诊治对延缓DKD进展、延长糖尿病患者寿命意义重大。

生物标志物指可以标记系统、器官、组织、细胞甚至亚细胞结构变化或功能异常的生化指标。尿白蛋白-肌酐比值（urine albumin-to-creatinine ratio，UACR）和肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）是诊断DKD的两个指标。研究表明，在尿白蛋白中度增加的时候，一些糖尿病患者肾脏已经发生肾小球和肾小管间质损害，这表明尿白蛋白不是DKD的敏感标志物[2]。另外，根据血肌酐估算的肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）值仅在eGFR＞60ml/（min·1.73m2）时才准确[3]。另外，肾活检是DKD的诊断标准之一，可提供具有适当预后价值的肾小球和肾小管组织学依据，但它作为一种有创检查，存在禁忌证且有并发症风险，可重复性非常差，多用于DKD和非DKD的鉴别诊断。因此，寻找比UACR和eGFR更敏感和特异的生物标志物在早期DKD诊治方面是具有十分重要的意义。

一、肾脏生物标志物在糖尿病肾病早期诊断价值的研究

（一）肾小球损伤相关生物标志物

1. 肾病蛋白（nephrin）：足细胞作为终末分化的细胞，是肾小球滤过膜的最后一道屏障，在防止蛋白尿产生中具有重要作用。nephrin作为足细胞裂孔膜组成部分，是一种跨膜蛋白，也是足细胞黏附、移动和存活的信号枢纽，nephrin数量减少将导致尿蛋白增加[4]。Irena Kostovska等[5]以2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）患者为研究对象，发现尿nephrin存在于100%大量白蛋白尿T2DM患者，88%微量白蛋白尿T2DM患者，82%正常白蛋白尿T2DM患者，与对照组相比，所有T2DM患者尿nephrin浓度显著增加，尿nephrin与eGFR呈统计学负相关（r=-0.54），受试者工作特征（receive operator characteristic curve，ROC）曲线显示nephrin在DKD的预测概率为96%。Kishore Kondapi等研究显示从正常白蛋白尿到大量白蛋白尿阶段，尿nephrin呈比例升高，差异有统计学意义，ROC曲线显示尿nephrin为97.5ng/ml时，灵敏度为92.5%，特异度为76.7%，推断即使在正常白蛋白尿阶段，尿nephrin排泄增加，nephrin是糖尿病患者早期肾功能损害的敏感标志物[6]。总结见表1。

2. 转铁蛋白（transferrin，TRF）：TRF是一种血浆蛋白，其分子量（76.5kDa）略高于白蛋白，研究显示，即使在没有白蛋白尿的情况下，与健康对照组相比，糖尿病患者的尿TRF排泄量增加[7]。一项研究以T2DM患者为研究对象，以健康人群为对照组，2组患者尿微量白蛋白均为阴性，T2DM组年龄较大，糖化血红蛋白A1c值较高，内皮功能障碍较严重；与健康对照组相比，T2DM组患者尿/血TRF比值有显著差异，提示尿TRF与肾损伤早期的内皮细胞功能障碍有关，在尿微量白蛋白阴性的T2DM患者中可预测DKD发生[8]。另有研究显示，尿白蛋白和血压均正常的1型糖尿病（type 1 diabetes，T1DM）儿童和青少年中，尿TRF水平升高，提示出现白蛋白尿之前，DKD已经出现[9]。总结见表1。

还有其他与肾小球有关的生物标记物，如免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、铜蓝蛋白（ceruloplasmin）、层粘连蛋白（laminin）、Ⅳ型胶原蛋白（type IV collagen）、lipocalin型前列腺素D合酶（lipocalin-type prostaglandin-D synthase，L-PGDS）[10]。研究显示，在尿白蛋白在正常范围内的T2DM患者中，尿IgG、铜蓝蛋白、TRF排泄率明显平行升高，表明其在早期诊断DKD方面具有一定参考价值[11]。另外，laminin是肾小球基底膜的组成部分；IV型胶原是肾小球基底膜和系膜基质的一部分；L-PGDS是与肾小球毛细血管壁病变相关的生物标志物，这些因子在一定程度上均可作为预测DKD的生物标志物[10, 12]。总结见表1。

（二）肾小管损伤相关的肾脏生物标志物

1. 肝脏型脂肪酸结合蛋白（liver fatty acid-binding protein，L-FABP）：尿L-FABP是一种低分子量蛋白，在人近端肾小管细胞细胞质中表达，也在肝脏水平表达[10]。研究结果显示[16]，尿L-FABP水平与eGFR呈显著负相关，尿白蛋白正常的糖尿病组患者中尿L-FABP水平显著高于非糖尿病对照组，ROC曲线分析显示L-FABP的ROC曲线下面积（Area Under Curve，AUC）显著高于ACR的AUC，截点是5ug L-FABP/g肌酐（creatinine，Cr）时，灵敏度为98.1%，特异度为90%，FABP/g Cr截点为4.3ug L-FABP/g Cr时，其灵敏度为100%，特异度为86.67%。另外，尿L-FABP水平升高预示高血压患者不良心血管事件[17]。不论分期，L-FABP是DKD进展的独立预测因子[18]（总结见表2）。

2. 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）：NGAL属于脂质运载蛋白家族的小蛋白（25kD），根据其作为先天抗菌因子的作用，它在活化的中性粒细胞中被发现[19]。尿NGAL是各种急性临床环境中急性肾损伤早期的预测生物标志物[19]。在广泛的年龄范围内，患者高血压前期，由于NGAL与肾功能下降和收缩压升高密切相关，即使在尿白蛋白正常范围的T1DM患者中，NGAL可作为早期肾功能损害的生物标志物[20]。Gudeta D. Fufaa等学者对260名印第安人基线尿样本生物标志物浓度进行测量，随访中位数为14年，NGAL/Cr与ESRD（HR 1.59，95%置信区间CI 1.20，2.11）和死亡率（HR 1.39，95%CI 1.06，1.82）呈正相关，尿液中NGAL和L-FABP的浓度与重要的健康结果相关[21]。一项有关NGAL的荟萃分析[22]结果显示，对于尿白蛋白正常范围内的糖尿病患者，血清NGAL对于诊断肾脏疾病的灵敏度和特异度分别0.90（0.82-0.95）和0.97（0.90-0.99），尿NGAL灵敏度为0.94（0.87-0.98），尿NGAL特异度为0.90（0.81-0.96），提示NGAL对正常白蛋白尿肾病有潜在的诊断价值。总结见表2。

3. 肾损伤因子1（kidney injury molecule-1，KIM-1）：KIM-1是上皮跨膜糖蛋白，在肾脏近端小管缺血或中毒后表达[23]。荟萃分析结果显示，正常白蛋白尿的T2DM患者尿KIM-1 AUC为0.85（95%CI 0.82-0.88），尿KIM-1诊断早期DKD的灵敏度为0.68（95%CI 0.35-0.89），特异度为0.83（95%CI 0.69-0.92），阳性似然比为4.1（95%CI 1.5-11.0），阴性似然比为0.38（95%CI 0.14-1.06）[23]（总结见表2）。

4. N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D glucosaminidase，NAG）：NAG是一种位于近端肾小管细胞溶酶体中的酶。在近端肾小管细胞损伤的情况下，NAG被大量释放到尿液中，是敏感的肾小管损伤标志物[10]。研究者发现尿NAG独立预测大量白蛋白尿（OR 2.26）和微量白蛋白尿（OR 1.86）[24]。另外，Hae Kyung Kim等发现尿NAG升高与T2DM患者较高的肝纤维化程度独立相关[25]。还有研究验证了尿NAG与无肾病T1DM患者心血管自主神经病变存在和严重程度及心率变异性变化的关联[26]（总结见表2）。

在其他肾小管损伤标志物包括胱抑素C（cystatinC，CysC）、α-1-微球蛋白（alpha-1-microglobulin）、血管紧张素原（angiotensinogen）等[10, 12]。目前一些研究开始探讨一种或多种在DKD过程中具有重要意义的生物标志物，并试图找出它们与DKD之间的联系。然而，迄今为止，这些生物标志物尚未被确定为鉴定早期DKD的金标准。需要大量研究进一步明确这些生物标志物诊断DKD的敏感度和特异度，及与DKD预后的关系（总结见表2）。

二、其他肾脏生物标志物

1. 炎症相关生物标志物：DM是一种全身的慢性炎症过程，包括肾脏。大量炎症介质如细胞因子和趋化因子在这个过程中产生，可作为早期诊断和预测DKD的标志物。有研究显示在T1DM收集的尿样中测量5种炎症标志物，包括细胞介素6（interleukin 6，IL-6），细胞介素8（interleukin 8，IL-8），单核细胞趋化因子蛋白1（monocyte chemokines protein 1，MCP-1），干扰素γ诱导蛋白10（interferon gamma-induced protein 10，IP-10）和巨噬细胞炎症蛋白-1delta（macrophage inflammatory protein-1 delta），在早期进行性肾功能衰竭患者，尿液中这些炎症标志物的浓度显著高于肾功能稳定的患者[28]。总结见表3。

2. 氧化应激相关生物标志物：氧化应激在高血糖引起的细胞损伤中起关键作用。增强的氧化应激可引起内皮细胞功能障碍，促进炎性细胞增生，并增加细胞外基质合成和细胞增殖[12]。目前已有大量研究针对氧化应激标志物如NADPH氧化酶2（NADPH oxidase 2，NOX2）、NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 2，NOX4）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG）进行研究，DKD状态下这些氧化应激指标升高，抑制氧化应激水平可改善DKD[29-32]（总结见表3）。

3. 微小RNA（miRNA，miR）：miR是由18-22个核苷酸组成的非编码单链RNA，其主要在转录后调节基因表达。miRNA通过调节mRNA降解和翻译在调节细胞周期、凋亡和分化中起关键作用[33]。miRNA与肿瘤，肾脏疾病，心血管疾病和糖尿病等各种疾病密不可分[34, 35]。研究显示，与T2DM和健康对照组相比，DKD患者血miR-193a-3p和miR-320c表达升高，miR-27a-3p表达降低，在DKD患者中，升高的miR-193a-3p表达与eGFR水平呈负相关，而与尿蛋白水平呈正相关；miR-193a-3p ROC曲线结果显示miR-193a-3p的AUC为0.876，miR-193a-3p的特异度和灵敏度分别为94.3%和74.5%；这些数据表明miR-193a-3p可用于区分患者是否患有DKD；Kaplan-Meier分析表明，miR-193a-3p高表达的DKD患者无透析生存期缩短。因此，高表达的miR-193a-3p表达不利于DKD患者预后；miR-193a-3p参与DKD发病机制，可能作为DKD的潜在新型诊断生物标志物[33]。另有研究显示，与其他肾脏疾病患者和健康受试者相比，DKD患者血清miRNA-125b-5p水平显著升高，DKD患者的血清miRNA-181b-5p水平较低，这些结果表明miRNA-125b-5p和miRNA-181b-5p可能成为新的诊断生物标志物[36]（总结见表3）。

4. 组学分析：在过去几年中，几种非侵入性方法被提出，主要基于用于评估尿液或血清生物标志物的“组学”技术。测量尿蛋白质组是非侵入性的，定量测定尿蛋白和肽是区分疾病阶段或监测治疗反应的平台[37]。大量学者已进行许多努力帮助DKD患者进行风险评估。在尿白蛋白正常范围的T2DM患者中，尿蛋白质组学分类CKD273的高风险评分与使中位数为2.5年内进展为微量白蛋白尿的风险增加[38]（总结见表3）。

5. 风险预测模型：年龄、血糖控制情况、糖尿病病程等是DKD进展的危险因素，然而，很少有人使用这些临床数据来建立风险预测模型。Wenhui Jiang等学者纳入了20个队列，其中包括41271名T2DM患者进行荟萃分析，发现年龄、体重指数、吸烟、糖尿病视网膜病变、糖化血红蛋白A1c、收缩压、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、UACR和eGFR均有统计学意义。除了eGFR之外，所有这些风险因素都包括在模型中，所有危险因素均根据其权重进行评分，最高分为37.0分，该模型在外部队列中验证，中位随访时间为2.9年；该研究谨慎地选择16.0作为临界值，灵敏度为0.847，特异性为0.677。该预测模型AUC为0.765，为检测DKD高危患者提供了简单工具[39]（总结见表3）。

三、肾脏生物标志物在糖尿病肾病早期诊断中的临床应用

临床病例：男性患者，65岁，既往T2DM 10年，平素口服二甲双胍治疗，血糖控制欠佳，糖化血红蛋白为7.5%，eGFR为88.74mL/（min·1.73m2），常规复查示24小时尿蛋白为20mg/24小时，尿KIM-1升高，如何考虑患者的诊断？

（1）初步诊断：患者男，65岁，既往2型糖尿病，化验示24小时尿蛋白正常范围，尿KIM-1升高，初步考虑为糖尿病肾病早期。

（2）查阅文献：T2DM患者患DKD的概率为40%（验前概率）[40]。荟萃分析显示，正常白蛋白尿的T2DM患者尿KIM-1 AUC为0.85（95%CI 0.82-0.88），尿KIM-1诊断早期DKD的灵敏度为0.68，特异度为0.83，阳性似然比为4.1，阴性似然比为0.38[23]。

（3）验后概率计算：验前概率=40%；验前比=验前概率/（1-验前概率）=0.4/（1-0.4）=0.67；验后比=验前比×似然比=0.67×4.1=2.747；验后概率=验后比/（1+验后比）=0.73。故该患者患DKD的验后概率为73%，即该患者患DKD概率为73%。

（4）诊疗思路：当验后概率超过某个阈值的时候，医生会建议开始治疗，该阈值为治疗阈值[41]。当验后概率低于某个阈值的时候，医生会排除这个诊断，该阈值为检验阈值[41]。当诊断概率处于检验概率与治疗概率之间时，则需要进行进一步检查[41]。尽管DKD是ESRD的主要原因，但肾穿刺是有创的，存在并发症的可能性大。研究显示，恩格列净作为一种降糖药，对DKD具有保护作用，延缓DKD进展，降低全因死亡率[42-44]，且与安慰剂对照组相比，不良事件发生比例无类似。加用恩格列净疗效好，安全性高，容易开展，考虑暂不采用进一步有风险的肾穿刺检查，加用恩格列净药物后密切监测疗效。

（5）治疗方案：加用恩格列净，密切监测KIM-1、UACR和肾功能。

尽管目前已涌现出大量生物标志物（图1），但仍无法代替传统UACR、eGFR、病理检查，成为诊断、预测进展及预后的金标准，仍需大量研究为这些生物标志物应用提供更多循证学证据。对新生生物标志物的研究将有助于临床对DKD进行早期诊治，对防治DKD具有十分重要的意义。

注：nephrin，肾病蛋白；TRF，转铁蛋白；IgG，免疫球蛋白G；L-PGDS，lipocalin型前列腺

素D合酶；L-FABP，肝脏型脂肪酸结合蛋白；NGAL，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白；KIM-1，肾损伤因子1；NAG，N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶；CysC，胱抑素C；IL-6，白介素6；IL-8，白介素8；MCP-1，单核细胞趋化因子蛋白1；IP-10，干扰素γ诱导蛋白10，NOX2，NADPH氧化酶2；NOX4，NADPH氧化酶4；ROS，活性氧；miR：微小RNA。

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