尿液细胞外囊泡用于糖尿病肾脏疾病早期诊断指标的研究与临床前景

牛文彦，医学博士、教授、博士研究生导师。现任天津医科大学朱宪彝纪念医院检验科主任，长期从事与肥胖和糖尿病相关的胰岛素抵抗的发病机制和改善机制的研究。主持6项国家自然科学基金资助课题项目、1项天津市科技支撑重大项目、2项天津市科技局重点项目、1项天津市卫健委重点项目等。获天津市科技进步二等奖1项。获国家发明专利1项。发表SCI收录论文50余篇。兼任天津医学会检验分会副主任委员、天津市医师协会检验医师分会副会长、中国老年医学会检验分会常委、天津市医药学专家协会内分泌专业委员会委员等。担任Theranostics和 Diabetologia等20余个SCI杂志审稿人。指导博士后2名、博士研究生9名、硕士研究生40余名。担任国家卫健委“重大新药创制”科技重大专项二审评委、国家自然科学基金重点、优青、面上、青年项目二审评委、国家卫健委“国家重大研发计划”重点专项、教育部优博论文、全军优博论文评委等。

刘瑜，理学博士、主管技师。现任天津医科大学朱宪彝纪念医院检验科主管技师，毕业于南开大学获理学博士学位。从事临床生化和新冠病毒核酸检测；主要研究方向为非酒精性脂肪肝病中糖脂代谢机制。参与国家自然科学基金课题面上项目2项，以第一作者于SCI收录期刊和中华医学系列杂志发表研究论著3篇。兼任天津市遗传学会理事，中国老年医学学会检验医学分会青年委员，天津市医学会检验分会第十届青年委员。

【摘要】糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease，DKD）是由糖尿病患者肾脏微血管病变引起的慢性疾病，表现为持续高血糖所致肾脏损伤。我国约20%~40%的糖尿病患者合并有DKD，现已成为慢性肾脏疾病和终末期肾脏疾病的主要原因。临床上常用随机尿白蛋白与肌酐比值（urinary albumin/creatinine ratio，UACR）作为诊断指标，但临床研究表明，存在尿白蛋白正常的糖尿病肾脏疾病患者，这类患者肾脏更易出现弥漫性病变、缺血性病变及大血管病变，因此需要新的诊断指标以提高对DKD的早期预测和诊断。本文对DKD导致肾小球和肾小管早期病变中尿液细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）发挥的作用进行了介绍和论述，对目前研究较为深入的有望在未来成为新的DKD诊断指标的尿液EVs内容物，例如，CD133、Wilm’s tumor-1、miRNA-221等进行了论述与分析。

国际糖尿病联盟（IDF）报告指出，2021年我国糖尿病患者人数已达到1.4亿。作为糖尿病主要的微血管并发症之一，糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease，DKD）是慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）的主要病因。在我国有20~40%的糖尿病患者会合并DKD[1]。相较与非DKD的糖尿病患者，合并DKD糖尿病患者的死亡率会显著升高[2]。因此，对DKD进行早期诊断对预防DKD发生、延缓DKD病程、降低大血管病变的风险，提高病患存活率、改善生活质量具有十分重要的意义[3]。

一、现有DKD早期临床诊断指标的不足

中国糖尿病肾脏疾病防治临床指南列出的DKD常用临床评估指标是尿白蛋白含量和估算的肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）。但通过对DKD经典模型的研究发现，DKD关于尿白蛋白含量的临床表现为持续渐进性蛋白尿。来自不同国家地区的多个临床研究也发现，存在尿白蛋白正常但肾脏受损的DKD患者，即尿白蛋白正常的DKD（normoalbuminuric diabetic kidney disease，NADKD），2017年，Chen等命名了这种疾病并就其流行病学史、病理生理机制和临床表现进行了阐述，指出这类患者更易出现肾脏弥漫性病变、缺血性病变、肾小管间质性病变及大血管病变[4]。这表明，尿白蛋白作为早期DKD诊断指标存在一定局限性，需要寻找更好的临床评估指标来进行DKD的早期诊断。

二、细胞外囊泡与DKD早期肾脏损伤

DKD的早期病理生理改变为大量葡萄糖滤过和肾小球超滤，引起肾小管对葡萄糖和钠过度重吸收、肾小球基底膜增厚、系膜基质堆积，同时会伴有足细胞的缺失和内皮细胞窗孔的减少、肾小球结节性硬化、肾小管萎缩，最终发展为肾衰[5]。因此，DKD会对肾小球、肾小管结构和功能造成损伤。

细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是一类由组织分泌并外排的具有膜结构的囊泡，包裹着多种生物分子，如核酸、蛋白质、多种细胞代谢物等[6]。这些生物分子可以反映EVs来源细胞类型及功能等信息。EVs可以利用这些生物分子进行细胞通讯[7]。鉴于此，人们更多聚焦在将EVs作为疾病诊断和预后的非侵入性生物标志物潜在价值。细胞外囊泡主要包含外泌体（exosomes），微泡（microvesicels，MVs）和凋亡小体[6, 8]。

尿液中EVs主要来源于肾脏细胞。分析尿液中的EVs对了解DKD发生发展中肾脏结构和功能变化有很大的帮助[9]。DKD患者的代谢异常会影响肾脏细胞释放EVs的数量及内容物种类[10]。异常的EVs可作用于传递给周围的细胞，诱发多种生物学效应，造成肾脏损伤。

1. EVs在DKD早期肾小球损伤的作用：肾小球内皮细胞（glomerular endothelial cells，GECs）是肾小球滤过系统的第一层屏障，可以在血流动力学改变时帮助肾小球维持稳态，确保大分子无法通过。因此，GECs功能受损会导致肾小球滤过屏障损伤并出现白蛋白尿，是DKD肾脏早期损害的标志[11]。有研究发现，在体外高糖刺激下，GECs会释放富含促纤维化蛋白TGF-β的EVs，促进足细胞的上皮间质转化和肾小球系膜细胞活化[12]。在体内，给野生小鼠注入高糖诱导产生的GECs-EVs会诱导肾脏系膜扩张、增殖和细胞外基质蛋白过量产生，支持GECs-EVs在肾小球功能受损中发挥的作用[12]。

肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cells，GMCs）也能释放EVs。高糖刺激可以引起GMCs释放EVs数量及生物学效应的改变。实验发现，GMCs与高糖刺激下GMCs释放的EVs与正常GMCs共培养，会使正常GMCs产生更多的纤连蛋白、血管紧张素原、肾素、血管紧张素Ⅱ1型受体和血管紧张素Ⅱ2型受体，表明EVs会引起正常GMCs的病变，造成肾细胞功能障碍[13]。

足细胞对于维持肾小球滤过屏障至关重要，糖尿病诱发的足细胞病会导致肾小球通透性增加和白蛋白尿，被认为是DKD开始的关键事件[11]。高糖对EVs数量和内容物的影响，可反映足细胞早期损伤[13]。

2. EVs在DKD早期肾小管损伤的作用：在糖尿病肾病的病程中，受损的足细胞释放EVs作为信使，将信号传递给肾小管上皮细胞（proximal tubular cells， PTCs），引起肾小管损伤。研究表明，体外高糖环境下，肾小管上皮细胞系HK-2会释放富含miR-192、miR-194和miR-215的EVs，这表明肾小管细胞EVs诱导的生物学变化可能是通过各种miRNAs来介导的[14]。另外的实验表明，PTCs-EVs可以激活包括TGF-β、mTOR、ERK和内质网应激通路等下游信号分子[15]。此外，高糖环境下肾小管细胞释放的EVs会诱导培养的肾成纤维细胞增殖和纤维化标志物表达，提示EVs在肾小管细胞和邻近的成纤维细胞之间的交流中发挥作用[16]。

多种实验证据支持EVs在糖尿病肾小球和肾小管细胞间的交流发挥活化和动力学作用。鉴定特定EVs亚群的来源、内容物中特有的蛋白质和RNA，可能有助于寻找新的DKD生物标志物和治疗靶点[9]。

三、EVs类DKD早期临床诊断指标分析

目前临床常用的DKD诊断指标是尿白蛋白。在DKD病程中，尿白蛋白的出现会滞后于肾脏结构损伤，使患者错过最佳治疗时机。我们需要寻找新的生物标志物来满足DKD早期临床诊断的需求。尿EVs就是一个比较好的选择，Raimondo F等人以Zucker糖尿病肥胖大鼠作为T2DM模型，比较其尿液和尿EV蛋白质组学特征，分析发现，尿EVs中蛋白种类与尿液完全不同，表明相较于尿液蛋白质组，尿EVs内容物更能代表肾小球和肾小管的改变[17]。

在DKD早期，尿EVs主要来源于肾单位和集合管[18]。分析尿液中EVs的数量、种类及内容物，有助于找到新的DKD风险评估生物标志物和治疗靶标，作为肾功能不全和结构损伤的早期诊断指标。

1. 尿EVs中反映肾小球早期损伤的标志：CD133是肾祖细胞表达的一种蛋白，也可用于评估DKD进展。从微量蛋白尿和大量蛋白尿分析看，随着DKD的发展，尿液中含CD133的EVs数量逐渐减少，尿EVs中CD133的含量可以反应肾小球损伤情况[19]。Burguer等人通过流式细胞术检测了四种糖尿病模型中足细胞来源的EVs量，发现尿中含足细胞标志蛋白podocalyxin的EVs数量在蛋白尿出现之前就会增加，这表明足细胞来源的尿EVs数量增加可能是糖尿病患者足细胞损伤的早期敏感指标[20]。Wilm’s tumor-1（WT1）是一种出现在尿液中的蛋白质，与DKD肾功能损伤相关[21]。但尿液中WT1的检测会因受到白蛋白尿的干扰而不易实现。体外细胞实验表明，高糖环境下足细胞会产生富含WT1 mRNA的EVs[22]。临床实验也发现，DKD患者尿EVs中WT1 mRNA明显增加，这类EVs对评估DKD发展程度有一定意义[22]。

体外研究表明用糖基化终末产物处理足细胞后，细胞分泌的EVs中上皮特异性转录因子3（epithelium-specific transcription factor 3，Elf3）的量增加，Elf3的水平可作为足细胞的标志物用于评估T2DM患者的肾损伤，作为DKD足细胞损伤早期标志物[23]。

2. 尿EVs中反映肾小管早期损伤的标志：高糖刺激下，足细胞释放的EVs中的miRNA-221通过Wnt/β-catenin信号通路诱导PTCs去分化，以及通过增加纤连蛋白、IV型胶原、p38和Smad3的磷酸化来激活PTCs的纤维化反应[24]。此外，还有实验表明这类EVs中的5个miRNA（miR-1981-3p, miR-3474, miR-7224-3p, miR-6538和let-7f-2-3p）参与了PTECs凋亡[25]。

在健康对照组、无肾损伤的糖尿病患者组和DKD患者组发现，尿EVs中的水通道蛋白1（PTECs标志物）在三组没有差异，DKD患者组尿EVs富集促纤维化TGF-β信号通路的早期靶标CD73，这表明尿EVs中CD73可用于评估eGFR下降之前的糖尿病肾小管损伤[26]。

3. EVs中miRNAs表征DKD病程：RNA测序发现T1DM患者尿液和尿EVs中miRNAs存在明显差异，有些miRNAs在尿EVs含量较为丰富[27]。在对明显、间歇性或持续性微量白蛋白尿的患者进行随访中发现，在DKD发展过程中存在不同阶段尿EVs中特有的miRNAs[27]。目前，增加的miRNA有miR-145、miR-192、miR-194、miR-215、let-7i-3p、miR-24-3p、miR-27b-3p、miR-362-3p、miR-877-3p、miR-150-5p、miR-21-5p和miR-26a，降低的miRNA有miR-15b-5p和miR-30b-5p[14, 28-32]。

此外，有生物信息学分析研究推测尿EVs中let-7i-3p、miR-24-3p、miR-27b-3p和miR-15b-5p可能参与Wnt/β-catenin信号通路、激活素受体信号通路和细胞分化增殖等，而miR-362-3p、miR-877-3p和miR-150-5p与p53、mTOR和AMPK信号通路相关[29]。

Park等人使用三种方法比较了来自DKD患者尿液EVs的miRNAs。发现尽管获得的尿EVs量存在差异，但有22个miRNAs表达相似[33]。

此外，一些研究通过细胞和动物模型探讨了某些miRNA的生物学作用。例如，Zheng等人观察到用TGFβ1处理肾脏TPECs会释放富含miR-26a的EVs[32]。Barutta等人报道高糖培养的系膜细胞释放富含miRNA-145的EVs[28]。miR-145表达于糖尿病小鼠的肾小球，糖尿病小鼠尿液中含miR-145的EVs是非糖尿病小鼠的2倍，这表明miRNA-145可作为DKD生物标志物，同时也是DKD调节因子[28]。

四、临床应用前景

流行病学预测，随着人们的生活方式改变和人口结构老龄化的加速，代谢类疾病和肾脏相关疾病的患病率将大幅增加。目前，临床检验中缺乏灵敏度和特异性足够好的评估糖尿病患者发展为DKD风险的早期诊断指标。尿EVs的出现使这方面成为可能。就目前的研究而言，它与尿白蛋白相比，尿EVs能更好地反映糖尿病刺激下肾小球和肾小管细胞的早期病变。但仍需要大量的临床研究来筛选与DKD病程表型密切相关的具体生物标志物，如蛋白质、mRNA或miRNA等。此外，成熟的EVs分离纯化技术也是尿EVs分析能否应用于临床检验的一个必备条件。随着研究的深入，尿EVs作为糖尿病肾脏疾病诊断指标的前景必然会更加明朗，成为DKD的早期诊断的良好指标。

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