氨基酸代谢与2型糖尿病相关性研究与临床诊疗意义
董作亮，主任技师，硕士研究生导师。现任天津医科大学总医院医学检验科副主任。ISO15189医学实验室认可评审员，中国中西医结合学会检验医学专委会青年委员，天津市健康教育协会医师分会副主任委员，天津市医学影像技术研究会第八届理事会理事，天津医师协会检验医师分会委员，天津医学会核医学分会委员等。主要从事免疫学检验、内分泌代谢性疾病的检验与临床工作。作为主要参加者获得教育部科技进步二等奖1项，天津市科技进步二等奖1项，天津市科技进步三等奖2项，天津医科大学科技成果一等奖1项，主持或参与引进新技术填补天津市空白3项，参编1部专著、2个专家共识。发表SCI及核心期刊论文近30篇。
刘艺贤，天津医科大学硕士研究生，医学检验技术专业，熟练掌握PCR、蛋白免疫印迹、流式细胞术、免疫荧光染色、ELISA等实验技术。主要从事糖尿病的基础与临床研究，主攻支链氨基酸与2型糖尿病的关系研究。
【摘要】近年来2型糖尿病的发病率呈明显上升趋势。以往研究显示，T2DM是由遗传、环境和饮食等多种因素综合作用的结果，胰岛素抵抗、糖脂代谢异常、氧化应激、炎症和肠道菌群失调等病理机制与T2DM的发生发展相关。随着代谢组学在糖尿病领域的深入研究,发现氨基酸在T2DM的发生发展过程中起着重要作用。因此,本文拟从氨基酸水平探讨T2DM相关机制的研究进展。
【关键词】氨基酸；代谢组学；2型糖尿病
2型糖尿病（type 2 diabetic mellitus，T2DM）是最常见的糖尿病类型，其患病率和发病率约占所有糖尿病的90%以上，是由遗传和环境因素共同引起的一组以糖代谢紊乱为主要表现的临床综合征[1]。T2DM患者常合并高血压、血脂异常、肥胖等代谢综合征，增加了T2DM并发症的发生风险、进展速度及危害，科学、合理的控制血糖、血压、血脂和体重等因素对T2DM治疗至关重要[2]。根据国际糖尿病联合会发布的《2019年糖尿病地图集第9版》，全球约有4.62亿糖尿病患者。
代谢组学是一种全面表征细胞、器官、生物体液或其他生物系统中的代谢组的方法，其正在成为发现糖尿病及其并发症的生物标志物发现的一个有吸引力的工具，因为代谢物可以提供参与疾病发展和进展的分子途径的信息[3]。T2DM可引起体内许多物质的代谢异常，如糖，脂质，氨基酸等。T2DM的主要特征是糖代谢紊乱、胰岛素抵抗和相对胰岛素缺乏。氨基酸和葡萄糖的代谢以及胰岛素抵抗密切相关。氨基酸是葡萄糖生成的一个主要储存库，并影响T2DM发病早期的两个过程，胰岛素和胰高血糖素的分泌，这使得氨基酸可能成为T2DM生物标志物[4]。本文主要从氨基酸代谢的角度来探讨T2DM相关机制。
一、氨基酸代谢与监测
1. 氨基酸及其代谢：氨基酸是氨基和羧基连在同一个碳原子上的化合物，目前已在生物体内发现了上百种氨基酸。但组成蛋白质的氨基酸主要有20种，其中有9种是人体自身无法合成的，称为必需氨基酸，分别是亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，其余氨基酸可由葡萄糖和相应氮源合成，是非必需氨基酸[5]。
氨基酸在人体内的作用尤为重要，首先，氨基酸是蛋白质和由蛋白质复合物形成的细胞机制成分的组成部分；其次，许多重要代谢物（如嘌呤/嘧啶、神经递质等）是氨基酸代谢产物[6]。氨基酸在代谢时，首先脱氨形成相应的酮酸（如乙酰辅酶a、酮戊二酸、琥珀酰辅酶a和富马酸）之后，进入三羧酸循环，进一步代谢为草酰乙酸；天冬酰胺和天冬氨酸的脱氨作用直接形成草酰乙酸和丙氨酸；半胱氨酸、甘氨酸、丝氨酸和色氨酸的脱氨作用形成丙酮酸，草酰乙酸和丙酮酸可进行糖异生[4]。
2. 氨基酸的检测方法：目前常用的检测氨基酸的方法有分光光度法、毛细血管电泳法、色谱法、核磁共振光谱法（Nuclear magnetic resonance，NMR）和质谱法（mass spectrometer，MS）。毛细血管电泳法具有速度快、分辨率高、重复性好的特点，广泛应用于氨基酸、多肽和蛋白质的分析[7]。色谱法中的柱后茚三酮衍生化的离子交换色谱法是氨基酸分析的“金标准”[8]。MS可直接分离大多数氨基酸（分离不同分子量或不同片段模式的代谢物），但它的一个缺点是需要样品制备，可能会导致代谢物与添加的底物发生反应而损失，或在物理条件发生变化时发生降解，且电离效应会损害化合物定量，因此，MS主要用于与其他分离方法，如色谱法相结合[4]。NMR具有非侵入性和非破坏性的特点，几乎不需样品制备、色谱分离或化学衍生，特别适合评估蛋白质结合的代谢物，且具有高度的自动化和重现性，可用于大规模代谢组学研究，但其灵敏度不如MS[3-4]。
二、2型糖尿病与氨基酸代谢
氨基酸可通过与雷帕霉素靶点(mechanistic target of rapamycin，mTOR）复合物相互作用，参与胰岛素信号通路，并影响成纤维细胞生长因子-21（Fibroblast growth factor 21，FGF21），调节葡萄糖摄取、脂联素分泌和解偶联蛋白1的表达[9]。氨基酸可促进胰岛素和胰高血糖素的分泌[10]。一项纳入14131名健康受试者和3499名T2DM患者数据的meta分析[11]，发现T2DM患者血清和血浆中支链氨基酸（Branched-chain amino acids，BCAAs）和芳香族氨基酸（Aromatic amino acids，AAAs）的浓度明显高于对照组，而甘氨酸的浓度较低，脯氨酸、谷氨酸和赖氨酸的浓度高于对照组，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸和赖氨酸可以被认为是T2DM的生物标志物，其中前五个可能是最重要的生物标志物。
1. 支链氨基酸：BCAAs是人体的必需氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，是T2DM的潜在生物标志物。BCAAs首先在支链转氨酶（Branched-chain aminotransaminase，BCAT）的作用下，脱氨基生成相应的支链酮酸（branched-chain keto acid，BCKA），之后在关键酶支链酮酸脱氢酶（branched-chain ketoacid dehydrogenase，BCKDH）的作用下发生不可逆的氧化脱羧[12]，进入三羧酸循环。
Wang等[13]对4964名国人（包括434糖尿病患者）进行的病例对照研究发现，T2DM患者的循环BCAA水平较正常人明显升高，且补充BCAA可以增加T2DM的风险。通过无偏倚的整合基因组分析揭示了BCAA分解代谢途径和肥胖相关的IR之间的特异性和强大的关联性[14]。在肥胖动物模型中，BCAA分解代谢基因表达异常，脂肪组织的BCKDH活性降低，骨骼肌中BCAT和BCKDH表达下降，虽然肝脏中BCAA分解代谢途径也可能在血糖调节中发挥作用，但遗传证据比脂肪组织中的要弱[14，15]。有人认为可能是由于遗传异常，脂肪酸、或促炎症细胞因子、或胰岛素水平升高的影响，导致了BCAT和BCKDH的功能受损[15]。此外，肠道微生物的改变，以及下丘脑胰岛素信号传导受损导致肝BCAA分解代谢的减少，也导致了肥胖和胰岛素抵抗中BCAA的升高[15-16]。BCAAs和BCKAs可通过mTORC1依赖的胰岛素受体底物磷酸化阻断胰岛素介导的Akt磷酸化，以及通过mTORC2失活诱导Rictor下调，从而导致Akt2的泛素化和降解，从而增强糖异生，抑制脂肪生成，增加肝TG输出，同时，因BCAT和BCKDH受损而导致BCKA及其它代谢物如二酰基甘油和神经酰胺的积累，将进一步加剧以上过程[15, 17]，导致胰岛素抵抗，是糖尿病发病机制的重要因素。Yu等[18]通过分别限制肥胖小鼠膳食中的三种支链氨基酸，发现亮氨酸对于支链氨基酸在人体的负面影响中至关重要。
2. 芳香族氨基酸：AAAs包括酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，在糖尿病患者的血浆中升高[19]。Sun等[20]对46篇相关文献进行meta分析后发现，酪氨酸和苯丙氨酸的增加，与T2DM的发生风险呈正相关。目前，对AAAs诱导IR的细胞机制研究较少，但大量的横断面和队列研究已经报道了AAAs与T2DM发病率呈显著的正相关。对于AAAs，有人认为酪氨酸和苯丙氨酸的增加是由于胰岛素抵抗引起的酪氨酸转氨酶活性的降低所导致[4]。
3. 甘氨酸：甘氨酸是一种“非必需”氨基酸，Yan-Do等[21]在胰腺细胞上发现了甘氨酸受体，它可以激活氯离子电流并促进膜去极化打开电压依赖性的Ca2+通道，促进胰岛素的分泌。因此，低水平的甘氨酸不利于胰岛素的分泌。
甘氨酸与T2DM的发生呈负相关，其下降可能是T2DM的早期标志，但甘氨酸水平的下降可能是继发的，而非代谢障碍[22]。甘氨酸的下降可能与BCAA的升高相关。BCAA经BCAT作用后脱去的氨基转移到酮酸受体a-酮戊二酸上，生成谷氨酸。在肥胖组织中，BCAA水平的增加使上述反应增加，导致组织氮负荷增加，利用谷氨酸驱动其他转氨反应产生离开肌细胞的产物，如丙氨酸转氨酶由丙酮酸形成的丙氨酸，被消耗了的丙酮酸可通过丝氨酸脱氢酶和丝氨酸羟甲基转移酶的作用从甘氨酸中补充，导致甘氨酸的水平降低[9]。在肥胖大鼠模型中，BCAA限制饮食喂养可使循环甘氨酸浓度增加，证明循环BCAA水平可影响循环甘氨酸水平[23]。
同时，也有研究显示甘氨酸的降低与游离脂肪酸（FFA）的增加有关。FFA代谢可导致氧化中间体（如酰基辅酶a酯）的积累，它们通过酰基辅酶a的活性与甘氨酸结合：甘氨酸-乙酰基转移酶，它负责酰基辅酶a酯与甘氨酸的酯交换产生酰基-甘氨酸，通过尿液排出[22]。
4. 其它氨基酸：日本成年人前瞻性巢式病例对照研究[24]证明，BCAAs、AAAs、糖异生氨基酸（丙氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺）和其他氨基酸（鸟氨酸和赖氨酸）与T2DM的风险相关，但在进一步调整HOMA-IR后，仅亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺-谷氨酸比率与T2DM的风险相关，其它氨基酸与T2DM的关联减弱，不再具有统计学上的显著意义。
BCAAs分解的增加会加快谷氨酸的合成，将升高的BCAA浓度与谷氨酸水平的升高联系起来。在β细胞中，亮氨酸变构可激活谷氨酸脱氢酶，催化谷氨酸转化为α-酮戊二酸释放ATP，ATP/ADP比值增加，导致胰岛素释放，β细胞中合成的谷氨酸被运输到胰岛素分泌颗粒中随胰岛素一起释放，将高胰岛素血症与高水平的谷氨酸联系起来[4]。谷氨酸通过激活β细胞上的NMDA受体和α细胞上的AMPA/Kainate受体来降低胰岛素并增加胰高血糖素的分泌，导致胰岛素抵抗加剧[4]。谷氨酸也可通过下丘脑调节食欲，影响肥胖[9]。
三、临床诊疗应用前景
随着代谢组学的发展，对T2DM的发生发展认识越来越深入，并发现了大量与糖尿病有关的生物标志物，如碳水化合物、氨基酸和脂质等。若将这些生物标志物应用到临床诊疗中，将有助于T2DM的预测、早期诊断、预后判断以及疾病的精准治疗。本文主要就氨基酸在T2DM中的作用进行了讨论，氨基酸在多种病理生理过程中起着重要作用，包括血糖的介导，氨基酸的代谢紊乱与T2DM的发病机制密切相关[25]，尤其是甘氨酸和BCAAs是T2DM的重要生物标志物。但使用单一的生物标志物诊断疾病缺乏特异性，未来的研究应集中在更广泛的代谢组学分析上，包括其他代谢物类别，以及代谢物之间的相互作用。
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