纳米孔测序新技术临床诊疗价值与发展前景

李一荣，免疫学博士，主任技师/教授，博士/硕士研究生导师。现任武汉大学中南医院检验科主任、湖北省首届公卫领军人才。兼任中华检验医学杂志编委、中国医促会基层检验技术标准化分会副主任委员、湖北省医学检验分会副主任委员、国家自然科学基金同行评议专家。先后主持国家重大研发计划课题、国家自然科学基金和教育部留学回国人员启动基金等项目。以第一作者或通讯作者在JAMA、STTT、Molecular Microbiology和Emerging Microbes & infections 等杂志发表论文50余篇。先后获全国创新争先奖牌、湖北省抗击新冠肺炎疫情先进个人和湖北省科技进步二等奖。

李雪寒，硕士，检验技师。现任职于郑州大学第五附属医院检验科检验技师，2020年毕业于武汉大学第二临床学院，临床检验诊断学硕士，以第一作者发表SCI论文3篇、核心期刊论文2篇。

付宇，2022年毕业于武汉大学第二临床学院，临床检验诊断学硕士研究生，以第一作者身份发表SCI论文3篇。

【摘要】纳米孔测序技术是近年来发展起来的第三代测序技术，其最显著的特点是无需对核苷酸进行任何化学标记、边测序边分析、测序读长超长且成本较低，在诸多领域具有广泛的应用前景，但也存在一定的局限性。本文介绍了纳米孔测序技术的原理、特点和临床应用进展，并对其应用前景进行展望。

【关键词】纳米孔测序；病原体检测；分子诊断技术

20世纪以来，随着分子生物学的飞速发展，基因测序等分子诊断技术已逐渐成为检验医学领域和公共卫生的重要检测手段。一代测序即Sanger测序打开了DNA测序的大门，很快成为许多疾病分子诊断的“金标准”，但它昂贵的测序成本和较慢的测序速度限制了其在多样本大规模测序项目上的使用[1, 2]。二代测序的测序通量高且测序成本较低，但文库构建复杂繁琐、测序读长短、序列分析时间长且仪器相对昂贵[3]。近年来，以纳米孔测序为代表的第三代测序技术飞速发展，有望突破第一、二代测序技术的瓶颈，是测序技术史上的又一次飞跃式发展[4]。

纳米孔测序技术采取“边解链边测序”的方法，待测单分子（RNA或解旋成单链的DNA）在马达蛋白的驱动作用下穿过纳米孔，由于不同的碱基结构的差异，导致电流信号发生变化，利用计算机软件可以将电流信号转换为碱基序列，从而得到基因的序列信息[5, 6]。整个测序过程无需进行任何化学标记甚至核酸的扩增、能实现边测序边分析，还具有测序通量高、成本低和读长长等优势，现已逐步应用于病原体的检测、传染病防控、遗传性疾病和肿瘤的诊断及治疗，具有较好的应用前景[7, 8]。

一、纳米孔测序新技术的发展

纳米孔测序技术的开发起源于20世纪80年代，最初使用的纳米孔材料为生物纳米孔—由某种天然存在的蛋白质分子镶嵌在磷脂双分子层上而组成的纳米孔材料，如金黄色葡萄球菌α溶血素、耻垢分枝杆菌孔蛋白A及噬菌体phi29连接器马达蛋白等[9-11]。到20世纪90年代，研究人员通过对生物纳米孔的探索和优化，提高了纳米孔测序的精度。但生物纳米孔因其固有的局限性，如膜的稳定性差、电流噪声较大、不能保持孔径大小均一性等，影响了单分子核苷酸的测序质量。21世纪初，以硅及硅的衍生物为主要材料的固态纳米孔应运而生，固态纳米孔比生物纳米孔具有更高的稳定性和耐用性[12]。2014年英国牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）推出了全球第一台商业化固态纳米孔测序仪MinION，从此纳米孔测序技术逐渐走向成熟。

1. 纳米孔测序技术的原理：纳米孔测序技术起源于Coulter计数器的发明以及单通道电流的记录技术，其本质是利用电信号进行测序。纳米孔测序是将人工合成的一种多聚物薄膜浸在离子溶液中，薄膜表面镶嵌有纳米级跨膜通道蛋白（纳米孔），也称Reader蛋白。在薄膜两侧电压作用下，离子通过纳米孔从一侧移动到另一侧产生电流。核酸分子可在马达蛋白的作用下解开螺旋成单链分子穿过纳米孔，当不同的碱基通过纳米孔时，电流的振幅和持续时间会不断发生变化产生不同的离子流，通过分析离子流波动峰值就能判断出对应的碱基，从而实现高速实时测序[13]。

2. 纳米孔测序技术的特点：纳米孔测序有如下的技术特点：（1）较长的测序读长：纳米孔测序技术利用碱基穿过纳米孔时电信号的改变实现测序，原则上可检测通过纳米孔的全部核酸序列，因此对测序长度没有限制，目前最长读长可达2.4M[14]。（2）可实时测序：测序文库制备过程简单，无需对样品中核酸进行PCR扩增或逆转录，可以直接对DNA或RNA进行测序，节约了操作时间同时降低了测序成本。可边测序边输出结果，能够实现对测序数据的实时分析。（3）纳米孔测序设备简单便携：目前使用最成熟的MinION测序仪可在极地、海洋甚至太空等各种复杂环境下完成实时测序，可保证对突发疫情处理的时效性。虽然原始数据对单核苷酸的检测准确率有待提高[15]，但组装后经校正，碱基的准确度可达99.8％以上[16]。（4）可直接对RNA进行测序：纳米孔测序可以直接对各类形式的RNA进行测序，能避免目前对RNA病毒进行测序和研究时必须将RNA逆转录为DNA扩增所产生的偏向性及可能引入的突变，这一特点在RNA病毒检测领域具有巨大的吸引力[17]。

二、纳米孔测序技术的临床应用

1. 纳米孔测序技术在病原体检测中的应用：纳米孔测序技术已应用于许多感染性疾病病原体的识别。利用纳米孔测序技术诊断感染性病原体的方法主要有基于细菌16S核糖体RNA（16S ribosomal RNA，16SrRNA）和真菌内源转录间隔区（internally transcribed spacer，ITS）的靶向测序以及基于所有基因进行建库的宏基因组测序。

（1）靶向测序：目前，基于细菌16SrRNA和真菌ITS的靶向测序已成功识别了样本中的细菌和真菌，使用MinION测序仪9.5版测序芯片可实现99%的测序准确性。Moon等[18]利用MinION测序仪通过16SrRNA的靶向测序，从脑膜炎患者血液中鉴定出罕见的胎儿弯曲杆菌。刘晔等[19]通过纳米孔16SrRNA靶向测序从患者支气管肺泡灌洗液标本中检出包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等在内的16种病原体，远高于常规培养法检出的病原体数量。在临床微生物检验中，病原体的耐药性检测与病原体的分离鉴定同样重要，而纳米孔靶向测序在病原体耐药性检测中也有广泛的应用。Gong[20]等对肝脓肿样本进行纳米孔靶向测序，在4小时内识别出样本中的肺炎克雷伯菌的2个亚型，并发现了emrB、macB等7个耐药基因。与普通的培养法相比，极大缩短了鉴定时间，为临床快速病原诊断与早期抗生素治疗提供了重要依据。Zhang等人[21]采用纳米孔靶向测序方法，在12小时内直接从样本中检测出淋病奈瑟菌，同时检测出13种相关耐药基因。纳米孔测序的超长读长特点为病原体鉴定提供了更高的分辨率。Peritz等[22]利用MinION对大肠杆菌7个血清型的混合DNA文库进行纳米孔靶向测序，结果表明纳米孔测序技术对于复杂混合样本的病原体仍具有较高的分辨率。

此外，纳米孔测序技术可以直接对各类形式的RNA进行测序，更适宜用于RNA病毒的检测。2015年巴西暴发寨卡病毒疫情，研究者通过多重PCR进行富集扩增，建立基于纳米孔靶向测序的现场测序方法，在2天内获得病毒全基因组序列。该方法在病毒拷贝数低至50时仍能检测到病毒[23]，为病原体的发现提供了及时精准的信息。在2019年年底爆发的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情中，纳米孔靶向测序技术亦发挥了巨大作用。来自武汉大学的团队[24]开发了基于纳米孔靶向测序的检测方法，首次实现6-10小时内同时检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）和其他40余种呼吸道病毒。Todd Treangen团队[25]以纳米孔测序技术为基础开发了Variabel系统，该系统可准确识别SARS-CoV-2感染者体内的SARS-CoV-2突变株，从而及时控制突变株的传播。

（2）宏基因组测序:纳米孔宏基因组测序可直接从患者样本中检测全部核酸，与其他测序技术相比，其在检出未知病原时可获得较多基因组信息，对基因组中存在重复序列和复杂结构的病毒研究具有独特的优势。目前已被应用于鉴定临床中难以确定传染源的病原体及部分病毒的检测。Cheng等[26]人对7例感染性心内膜炎患者的心脏瓣膜组织进行纳米孔宏基因组测序，结果显示所有样品中均能检出链球菌，而传统的微生物培养法则为阴性。研究者[27]通过混合组装Roche 454和MiniON的reads，成功获得了152kb的结构复杂的单纯疱疹病毒Ⅰ型的基因组。Greninger等[28]利用纳米孔宏基因组测序技术仅耗时6小时就从血液样本中检出埃博拉病毒和丙肝病毒，大大缩短了感染性疾病的前期诊断时间。然而，在研究人类疾病与微生物之间的关系时，由于宿主DNA的污染，宏基因组测序在实验上面临巨大挑战。Justin O'Grady团队[29]采用基于皂苷的宿主DNA去除方法，结合纳米孔宏基因组测序开发了一种用于细菌性下呼吸道感染诊断的方法，该方法与传统的培养法检测结果一致率为96.6%，并且能检测到抗性基因，检测周期仅需6小时，便于尽快确定感染的病原体并指导早期的抗生素治疗。有研究报道[30]，研究人员使用MinION测序仪检测大肠杆菌的耐药元件，宏基因组测序数据的长读长能确定可移动耐药元件的存在，并能发现位于同一耐药元件上的不同耐药基因的组合。这有助于更好地阐述多重耐药大肠杆菌中位于同一耐药元件上的不同耐药基因的传播规律。

2. 纳米孔测序技术在传染病防控中的应用：鉴于纳米孔测序设备操作简单，携带方便的特性，对资源的需求相对较少，可在疫区现场对样本进行实时检测，非常适用于流行病的现场测序和基因分析。此外，纳米孔测序有助于动态分析病毒进化从而研究病毒的流行规律及传播特征，这些信息对疫情发展不同阶段制定有效的防控措施非常重要。目前该技术已在传染病防控领域中有诸多应用。Naveca等[31]在2014-2018年巴西亚马逊地区暴发的基孔肯雅病毒疫情中，使用MinION测序获得了20例基孔肯雅ECSA基因型病毒株的基因组，从而分析出了基孔肯雅病毒的起源以及优势亚型的更替规律。研究人员[32]使用纳米孔测序技术对感染人类和非人灵长类动物的黄热病毒分离株进行宏基因组测序，发现引起疫情的病毒株在感染人类之前便已在非人灵长类动物中传播，揭开了2016年巴西黄热病疫情暴发的源头。在埃博拉疫情期间，科研人员[33]利用纳米孔测序技术现场对埃博拉病毒进行基因组测序，实现了对疫情的实时监测，并通过系统进化分析，揭示病毒进化来源，为疫情溯源及防控提供了重要的科学依据。在2020年的COVID-19疫情中，研究人员[34]通过宏基因组测序、多重PCR以及纳米孔测序完成了广东省53株SARS-CoV-2的全基因组序列测序，根据序列分析结果和流行病学信息，发现广东省该轮COVID-19疫情为输入性传播，而非本地传播。这对随后广东省实施的针对输入性传播的防控措施具有指导意义，对疫情发展不同阶段所需采取的干预措施，以及对其它地区开展SARS-CoV-2测序分析并科学解释测序结果具有较大的参考价值。

3. 纳米孔测序技术在遗传性疾病诊断中的应用：遗传性疾病是指由遗传物质发生改变而引起的或者是由致病基因所控制的疾病，具有病种多、发病率高等特点，基因组变异主要分为单碱基变异、插入或缺失及结构变异三大类。其中结构变异通常指基因组上大的序列变化和位置关系变化。结构变异的检测技术有很多种，但是以短读长测序为基础的检测方法（如全基因组测序等）检出率有限，这是由于短读长测序技术无法可靠地鉴定重复区域或难以覆盖到高GC含量的区域，而纳米孔测序具有超长读长，无GC偏好性，实时分析，简单便携等优势，能够跨越重复序列鉴定遗传病的结构变异，目前该技术用于检测基因组变异的案例已有很多。如纳米孔测序技术可用于血友病A倒位的基因变异分析，并为基因倒位导致相关遗传疾病的诊断提供可选择的方法[35]。Kloosterman团队[36]使用MinION测序仪和一种新的计算流程-NanoSV分析了两名先天染色体异常患者的基因组。研究发现纳米孔测序技术在检测染色体重排方面略显优势，测序结果能确定所有染色体重排断裂点的亲本来源并解析这些重排的结构。Roeck等[37]分别用二代测序和纳米孔测序技术检测了大量阿尔茨海默症患者ABCA7基因的提前终止密码子突变情况，发现纳米孔测序技术比二代测序技术多检测出7个突变，解释了不同程度无义介导的mRNA降解和转录调控影响ABCA7基因的表达，进而影响疾病的严重程度。这一发现有助于实现对阿尔茨海默症的干预性治疗。

4. 纳米孔测序技术在肿瘤诊断中的应用：随着分子生物学技术的发展，基因测序逐渐演变成为探索实体肿瘤标志物和实现精准治疗的重要手段，已被纳入中国临床肿瘤学会等指南。目前，纳米孔测序技术已被用于部分肿瘤的检测与治疗中。William R Jeck等[38]利用MinION测序系统的长读长和实时数据生成的特征，通过使用改良的锚定多重PCR方法构建文库，在24小时内检测出急性白血病患者血液样本中的BCR-ABL1融合基因，有助于快速诊断急性白血病，及时周转需要治疗的患者。此外，有研究者[39]使用MinION测序仪对脑脊液中肿瘤释放的游离DNA（cf-tDNA）进行测序，检测其基因突变来诊断儿童高级别胶质瘤（pHCG），同时对pHCG患者脑脊液cf-tDNA多时间点连续测序，并与相应的临床症状、影像学表现作对比分析，用于监测肿瘤对于治疗药物的多基因分子反应，实现对治疗效果的动态监测。

三、纳米孔测序技术的局限性与展望

纳米孔测序技术突破了第一、二代测序技术的限制，以其高通量、长测序读长、设备简单便携等特点在很多领域具有巨大的潜力和应用空间。但其也存在一些局限性：（1）测序数据信噪比低，导致碱基测序错误率高[40]。它与二代测序技术联合使用,将纳米孔测序的长读长和二代测序高准确率结合，可以提高测序准确性。（2）生物信息软件不足。由于纳米孔测序原始数据的计算需要大量的数据存储和计算成本，数据的分析需要更完善的生物信息软件，这也使得纳米孔测序技术在优势领域的进一步推广受到限制。近年来，随着测序平台及分析工具的不断发展，纳米孔测序技术有着极佳的应用前景：①基于电化学技术的纳米孔已成为实现蛋白质测序的有力选择，使蛋白质分析具有较高的时空分辨率和灵敏度[41]，未来可用于对蛋白组学的研究。②纳米孔测序技术可缩短患者获取报告的时间，能在第一时间给感染及肿瘤的诊断提供信息，还可在一定程度上替代药敏实验，尽快获得病原微生物抗生素耐药特征，使抗菌药物治疗变得及时有效，未来可引入临床用于对感染性疾病的诊疗。

相信随着纳米孔技术的深入研究，与各相关学科融合发展，基于纳米孔测序技术的基因组学研究能够获得更高质量的测序结果，将使其在公共卫生和临床医学中的应用范围越来越广泛，进而推动公共卫生和医学领域的全面发展。

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