严重急性呼吸综合症冠状病毒-2抗原检测技术临床应用与发展方向

杨瑞馥，博士,军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所研究员，国家自然科学基金杰出青年基金获得者。主要从事细菌基因组学、进化与致病机制、微生物法医学基础数据库、人体微生物群培养组学研究和检验新技术等研究。近年来，在NEJM，Science，Nature Genetics，Nature Communications，PNAS，CID等杂志发表学术SCI论文300余篇，被引23,000余次，H因子69（Google Scholar）；获得国家食品药品监督管理局医疗器械注册证15项。主要学术兼职：中国营养学会益生菌益生元与健康分会主任委员，中国微生物学会分析微生物学专业委员会主任委员，国家卫健委食品安全风险评估委员会委员，中国卫生标准委员会传染病标准专业委员会委员，《微生物学学报》，《人兽共患病杂志》和《中华预防医学杂志》副主编等职；《PLOS Neglected Tropical Diseases》 Deputy editor for Bacteria Section。近年来，获国家科技发明二等奖1项；军队科技进步奖一等奖2项。

张平平，军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所，高级实验师，硕士生导师，长期从事与病原微生物检测相关的新技术和新方法的研究。负责和作为课题骨干参与国家重点研发计划等20余项科研课题，以第一或共一作者发表SCI论文和中文核心期刊19篇，获得中华医学科技奖和北京市科技奖等，参与完成包括新冠抗体抗原等在内的医疗器械注册证14项。

严重急性呼吸综合症冠状病毒-2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）导致的新型冠状病毒疾病（coronavirus disease 2019，COVID-19），目前仍在世界大流行，死亡人数超过六百余万。预防传染病的三大途径包括控制传染源、切断传播途径、保护易感人群，及时发现感染者是控制传染病流行的关键，而这主要依赖于检测。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）指出使用侧流免疫层析检测方法，即抗原检测方法，直接在鼻拭子中检测新冠病毒蛋白比核酸扩增检测方法更快、更廉价、操作更简便且试剂更容易大规模制造。实际应用中，新冠抗原检测可以实现对特定人群的筛查，进而提高“早发现”能力，例如2022年初香港三分之一的感染者是通过抗原检测发现的。我国为了优化新冠病毒检测策略，决定在核酸检测基础上增加抗原检测作为补充，并在2022年3月11日发布了《新冠病毒抗原检测应用方案（试行）》。本文从检测靶标、试剂种类、样本类型和操作方法对新冠抗原检测试剂进行概述，从敏感性、特异性、与核酸检测Ct值的关系等方面综述了抗原检测试剂的基本性能，并评述了抗原检测试剂对有无症状、不同感染天数、不同突变株的检测准确率，对其应用范围进行了概述，最后对用于传染病防控的即时检测技术（point-of-care testing，POCT）的发展进行了展望。

一、新冠抗原检测试剂概述

1. 检测靶标：新冠病毒的结构蛋白包括刺突蛋白（spike protein，S）、核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）、膜蛋白（membrane protein，M）和包膜蛋白（envelope protein，E），其中M和E蛋白的序列和SARS-CoV-2相比的同源性分别高达95%和91%，不具备检测特异性[1]。S蛋白与宿主细胞受体血管紧张素酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）结合并参与病毒侵染细胞的过程[2]，由于感染和疫苗接种人数的增加，S蛋白在高压下容易变异以实现病毒对体液免疫的逃逸，即S蛋白不再和抗体结合[3]，所以抗原检测靶标如果使用S蛋白作为检测靶标，会降低

检测灵敏性。因此，抗原检测主要以N抗原为检测靶标，或以N和S抗原共同作为检测靶标。

2. 抗原检测试剂的种类：截止2022年4月，美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）审批了48个抗原检测试剂，我国审批了29种抗原检测试剂。在我国病例较少的2021年，我国抗原检测试剂的国外销售总额高达237亿元。抗原检测试剂的检测方法主要以基于双抗体夹心模式的免疫层析检测为主，阳性样本中的抗原可以和结合垫中标记物-N蛋白抗体复合物结合，进而被分析膜上固定的抗N蛋白抗体捕获，这样在检测带形成信号。目前主要的标记物包括胶体金、荧光微球或乳胶颗粒，在我国已被审批的试剂中应用上述颗粒的试剂分别为19、7和3种。美国FDA审批的试剂里面也包括微流控试剂，该试剂因具有微阀门等精确分配流体的功能部件从而使得检测灵敏度更高，但是我国国内尚不掌握批量化的精确刻蚀技术，所以目前审批的新冠试剂中尚不包括微流控试剂。

3. 样本类型：新冠检测的取样目标位置主要为前鼻腔、鼻中隔、鼻咽、口咽。PCR检测采用的多为咽拭子，个人自测所用的抗原检测试剂多采用前鼻腔拭子。实际上，不同采样位置的病毒载量不同，前鼻腔拭子的检测敏感性低于鼻咽拭子[4, 5]。Terpos发现抗原检测试剂对于Ct≤33的鼻咽和鼻拭子的检测灵敏度分别为99%和96.12%（n=114）[6]。样本类型的不同也是导致抗原比核酸检测灵敏度低的原因之一。

4. 抗原检测的操作方法：目前抗原检测试剂一般默认为基于免疫层析的检测方法。基于免疫层析的检测环境温度在14~30℃之间，温度过高或过低容易会分别导致假阳性和假阴性的增加，这是因为试剂的阴阳性判定阈值（即cutoff）在生产质控时是在常温下完成的，温度变化会影响抗原抗体的结合程度进而影响信号的强弱。此外，湿度过大也会影响试纸的性能，检测时湿度应小于70%。采样时将鼻拭子在鼻腔内1-1.5cm处每侧旋转4~5圈且过程至少15秒，采样后立即将拭子置于含保存液的采样管内液面之下至少30秒，沿管壁挤压5次后折断拭子将拭子头浸泡于采样液中。水平放置试纸，将液体垂直加入到检测卡样品孔中，在加样后的15分钟后观察结果，超过30分钟则结果失效。在质控带（C带）无信号为无效结果；仅在质控带出现信号为阴性结果，在质控带和检测带（T带）同时出现信号为阳性结果。基层医疗机构就诊人员、隔离观察人员、社区居民检测结果阳性的检测废弃物应密封按医疗废物处理，防止扩散；社区居民自检阴性的按一般垃圾处理。

二、抗原检测试剂的性能

抗原检测试剂的基本性能主要由试纸上抗体的质量决定，如与抗原的亲和力和储存稳定性等。通过工程化改造的单抗，其亲和力和稳定性通常能得到有效提高。除了优良的抗体之外，试纸上颗粒与抗体结合的效率和稳定性，不同成分的样品处理液对阴阳性信号的可区分程度等因素，也可影响试纸的性能。总体来说，抗原试剂制备工艺需要进行精细的优化，才能表现出较好的检测性能。

1. 总体敏感性和特异性：从2020年开始新冠抗原检测试剂的临床评价工作就陆续有报道[6-11]。总体来说抗原检测试剂的特异性均较好。Pickering等评价了六种抗原试剂，特异性评价中除一个为86%外其余均在98%以上[8]。Gans等对903408人进行了新冠抗原筛查，发现在阳性率仅为0.15%（即大部分样本为阴性样本）的情况下，其假阳性率仅为0.05%[9]。抗原检测试剂的敏感性参差不齐。Pickering评价的六种抗原试剂的敏感性范围分布于65%~89%[8]。Azzi等评价的抗原检测试剂在鼻咽（n=28）和唾液样本（n=55）的检测敏感性分别为93%和91%[11]，但Smith等和Turcato等报道的灵敏度偏低，分别为76.6%[7]和80.3%[10]；尤其是Turcato等指出对有、无症状患者的灵敏度分别为89.9%和50%。试剂的灵敏度与试纸的最低检测限的差异、样本总量、样本类型、样本核酸Ct不同分布等因素有关，所以样本量越多、病毒载量分布越广泛和样本种类越多，则抗原检测试剂的评价越客观。WHO推荐在COVID-19疑似病例中使用的抗原检测试剂，相较于核酸检测其性能要达到敏感性≥80%和特异性≥97%[12]。

虽然在敏感性方面抗原检测是低于核酸检测的，但连续检测可以提高检测的灵敏度。文献报道一周两次的频次可以有效提升灵敏度[5, 13]，而《新冠病毒抗原检测应用方案（试行）》规定基层机构就诊人员、隔离观察人员和有症状居民的检测频次为连续5天每天检测一次，这样做就有效的避免了漏检。

需要注意的是，尽管核酸检测试剂常作为抗原检测试剂的对比试剂，但只有新冠确诊或排除病例才能作为评判抗原检测试剂性能的标准，其原因如下所述。虽然核酸检测非常灵敏，但是有些病人在症状出现后数周内仍为核酸检测阳性，但是在出现症状9天后却无法培养出活病毒，这揭示在传染和传播风险可以限定在症状出现后的8±3天之内[14]。因为抗原检测依赖于抗原蛋白的完整性，出现核酸检测阳性而抗原检测阴性时应当予以考虑这种无法培养的活病毒载量较低或不存在的情况。

2. 抗原检测试剂性能与核酸检测Ct值的关系：由于试剂的本身差异，所以当采用不同的核酸试剂作为参考试剂时，不同Ct值对应的抗原检测灵敏度可能不同。目前国际比较认同的是Ct≤25时，抗原检测试剂的敏感性通常能维持在相对自身来说较高的水平[6, 8]，对于一些敏感性本就比较好的试剂来说，当Ct≤25时敏感性甚至能达到100%。一般来说，Ct≥30时病毒载量和传染性均很低，考虑到由于我国的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第九版）》将Ct≥35作为解除隔离管理和出院标准，所以抗原检测试剂在Ct＞30时敏感性较低可以接受。当25＜Ct＜30时，抗原检测试剂随着各自的最低检测限的不同而敏感性不同。

此外，同一个人的不同样本间病毒载量是不同的，所以对同一人群来说，相同Ct范围内的不同样本之间的抗原检测试剂的敏感性不同。Terpos等人对114个阳性病例进行检测，发现对于鼻咽拭子来说，当Ct≤25、33和40时抗原检测试剂的敏感性分别为100%、99%和89.47%；而对于鼻拭子来说，当Ct≤25、33和37时，其敏感性分别为100%、96.12%和91.74%[15]。

如果某抗原检测试剂对突变体检测效果不佳，而总体样本中含突变株的样本量还比较大时，可能对Ct值和抗原检测试剂性能的关系分析造成影响。

3. 对有和无症状的新冠感染者的检测准确率：抗原检测试剂对有、无症状的新冠感染者检测准确率是否有差异，目前各研究并无一致意见。Azzi等对24名有症状和4名无症状人员的28份鼻咽拭子进行抗原检测，发现敏感性分别是92%和100%；对27名有症状和28名无症状人员的55份唾液样本进行抗原检测，发现敏感性分别为92%和89%[11]。但是Turcato等也采用这两种样本反驳了Azzi的观点，发现对有症状感染者的检测敏感性为89.9%（n=169），但对无症状的仅为50%（n=54）。BMJ杂志上Schuit等人认为样本量过小会影响对有无症状感染者的检测准确率的判断，于是使用两种抗原试剂，对密接5天后的无症状和症状出现前期的大量感染者进行测试，发现抗原检测试剂对这两类人群检测无差异[16]；Deeks等则认为抗原检测试剂漏检率比较高，而对无症状感染者的漏检率尤甚[17]。对无症状感染者的抗原检测评价存在的较大差异，可能与无症状感染者的病毒载量变动较大有关，这与部分无症状感染者提前接种过疫苗等因素相关。

4. 对不同感染天数病例的抗原检测准确性：由于抗原检测试剂的最低检测限比核酸检测试剂差一些，抗原检测的最佳窗口在出现症状前7天左右[14]。Smith等对43位新感染的成年人做了纵向研究，发现在鼻拭子中活病毒可培养时的前几天内，抗原和核酸检测均较灵敏，而核酸检测可在此时间段之前更早的发现感染者；在活病毒培养出一周后鼻拭子中的传染性病毒不再能被检测到之后，抗原检测的敏感性骤降至0.238 [13]。Killingley等开展了对人体主动感染新冠的研究，发现利用PCR方法最早可于接种40小时（约1.67天）和58小时（约2.4天）分别在咽拭子和鼻拭子样本中检出；咽、鼻拭子的病毒载量最高峰分别出现在第4.7天和6.2天，而后者峰值病毒载量高于前者。根据鼻、咽拭子样本检测结果，所有被感染的参与者首次抗原检测阳性的时间分布于接种后的第2-8天，中位时间为第4天[5]，这明显晚于PCR最早可检出时间；抗原检测试剂在疾病前期和后期敏感性偏低。

5. 对不同突变株病例的抗原检测准确性：由于N抗原的突变发生率低，因此当检测靶标只为N抗原时，抗原检测试剂能维持较高的准确性。S抗原较多的突变已造成了比较严重的免疫逃逸[3, 18]，所以检测靶标含有S抗原的抗原检测试剂对突变株的检测准确性会受较大影响。各种抗原检测试剂对突变株病例的检测准确性参差不齐。Bayart等测试了6种抗原检测试剂分别对Delta和Omicron（BA.1和BA.1.1亚系）突变株进行检测，检测敏感性涵盖了较广的Ct值，即从13.5到35.7，中位数为21.3；对两种菌株的敏感性分别为70.0%~92.9%和69.6%~78.3%[19]。美国FDA联合美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）的RADx计划，对诊断为Omicron突变体的患者样本进行抗原测试性能的评估，发现对热灭活样本的检测性能不变，但检测活病毒时灵敏度会下降[20]。Drain等发现在有症状的成年人中FDA批准的两种抗原检测试剂对Omicron（B.1.1.529/BA.1）、Delta（B.1.617.2）和野生型毒株（USA-WA1/2020）的最低检测限或针对不同突变株的临床检测中均无显著差异[21]。目前对突变株检测的临床数据尚待进一步完善，才能实现对突变株检测准确率的准确分析。

三、抗原检测试剂的应用范围

WHO推荐了抗原检测试剂优先在以下人群、机构、时段和目的中使用，包括：（1）有症状的疑似个体和高风险的无症状个体的检测；（2）有接触史的人群；（3）暴发调查阶段；（4）在社区中降低疾病发生率。满足最低限度性能要求（80%的敏感性和97%的特异性）的抗原检测试剂可以在临床机构或实验室外的社区使用。根据WHO的推荐，抗原检测试剂可以用于有症状疑似人群、密接者、暴发地区中感染者的筛查。

我国的《新冠病毒抗原检测应用方案（试行）》，明确了抗原检测可用于不具备核酸检测能力的基层卫生机构对出现症状5天内的呼吸道症状的人员、隔离观察人员和有抗原自我检测需求的社区居民的检测。

免疫层析一贯是传染病监测的利器，因此对某些重点场所和人群的定期筛查也依赖于抗原检测试剂。定点隔离机构和医疗机构的医务工作者、国际机场和海关的工作人员，物流、公共交通和酒店餐饮的服务人员，以及冷链食品的销售者和仓储搬运工，都需要定期筛查。鉴于国外的严重疫情情况，2022年1月28日，交通运输部、外交部和海关总署联合发布的《关于做好国际航行船舶船员新冠肺炎疫情远端防控的公告》（2022年第14号）中规定在不具备核酸检测的条件下可选用抗原检测。此外，抗原检测试剂的应用范围在某些特殊紧急情况下还可以考虑适当的加以扩大，如在急诊无核酸报告时做抗原筛查可以同时实现对危重患者的及时抢救和对医护人员的保护，对有病例的医疗机构做抗原检测筛查可以防止其突然停摆并对大范围的人员进行保护。

四、SARS-CoV-2检测技术发展方向

目前，新冠抗原检测试剂确实已在防控中辅助发现了大量阳性感染者，有效的为阻断病毒传播提供了有利的支撑，这其中反映的是即时检测（point-of-care testing，POCT）在防控传染病过程中的巨大作用。目前抗原检测的主流技术仍是基于免疫层析反应，主要依赖于肉眼观察进行定性检验，不仅灵敏度和准确性有待提高，而且不能给出定量结果使得很多数据无法得到深入剖析，这实际上给传染病的研究和精准防控带来困扰。发展能够广泛应用于传染病防控的更准确的能定量的新型POCT技术，是目前重要的研究方向。从广义上讲核酸检测试剂也是检测抗原的一种手段，因此发展基于核酸检测的POCT技术也是可行的。POCT未来发展的方向包括不限定于借助于酶的高效反应提高信号值、借助于更强的刻蚀技术提高反应液体的精准分配、借助于扩增技术提高检测灵敏度、借助于普通大众的手机发展即插式小型仪器辅助结果读取与分析等方面。未来的POCT肯定能够发挥更可靠的作用，辅助减少传染病大流行给人类带来的巨大负面影响。

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