miRNA在心肌重塑中的作用与临床诊疗价值

苏明，博士，副研究员，副教授，硕士生导师，工作单位: 北京大学人民医院，研究方向: 心血管疾病分子生物学机制与分子诊断，主持国家级科研基金4项，省部级课题1项，在Cell death and differentiation，DNA Cell Biol等杂志发表SCI文章多篇。

杨子瑶，本科毕业于北京大学医学检验技术专业，现硕士研究生就读于北京大学人民医院检验科；主要研究方向为心血管疾病的分子诊断和发病机制研究。

【摘要】微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一类高度保守的小分子非编码单链RNA，能够通过降解或阻遏靶基因信使RNA翻译，下调靶基因表达，参与多种生理病理过程。多项研究表明miRNA可调节心肌纤维化、心肌肥厚，与心肌重塑发生发展的关系密切。随着该领域研究不端深入，目前认为miRNA不仅能够作为指示心肌重塑的生物标志物，还可作为心肌重塑治疗的新靶点。

心肌重塑在心血管疾病的发生发展中起关键作用。在生理因素或心肌缺血、长期超负荷等病理因素作用下，心肌细胞及细胞外基质的结构功能及遗传表型改变，导致心肌纤维化、肥厚的发生。心肌重塑的进展可引起心脏收缩和舒张功能障碍，导致心力衰竭。早期对心肌重塑进行干预和治疗可以阻止甚至逆转其进展，是许多心血管事件的治疗靶点。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一类高度保守的小RNA分子。miRNA能够与其他蛋白装配形成沉默复合体，并根据碱基互补原则结合靶基因信使RNA的3'UTR区，降解靶基因mRNA并阻遏其翻译，下调靶基因表达从而参与多种生理病理过程[1, 2]。目前发现多种miRNA在心肌重塑的发展中有至关重要的作用，是调节心脏生理病理过程的关键因子[3]。

一、miRNA调节心肌纤维化

心脏细胞外基质主要是由胶原蛋白和糖蛋白构成的网络结构，能够支撑心肌细胞，整合胞外信号，与心肌细胞共同维护心脏功能的完整性。病理条件下，心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转变，心脏细胞外基质中I型和III型胶原过度表达，导致胶原比例失调，心脏基质网络扭曲，心室壁增厚，组织顺应性降低，导致心功能障碍。miRNA可通过调控纤维化相关信号通路、成纤维细胞的增殖和转化、胶原合成等过程，影响心肌纤维化进展。

1. miR-21：miR-21是一个促进多种组织器官纤维化的miRNA。miR-21与促纤维化细胞因子TGF-β1之间构成正反馈循环，过表达miR-21使心脏成纤维细胞TGF-β1分泌增加，而TGF-β1处理可诱导心脏成纤维细胞miR-21表达上调[4]，二者通过这种正反馈循环协同促进心肌纤维化进展。

目前已发现miR-21可通过调控TGF-β1/Smad、TGF-β1/Spry1、TGF-β1/Jagged1通路发挥促心肌纤维化作用。TGF-β1/Smad是成纤维细胞活化过程的经典途径之一，也是诱导心肌纤维化的关键通路。TGF-β1结合并激活受体，继而磷酸化Smad2和Smad3，形成Smad2/3/4复合物，继而调节纤维化相关靶基因表达。其中Smad7是该途径的负向调控因子，能够抑制Smad2和Smad3活化，起抗纤维化作用[5]。研究发现miR-21通过靶向抑制Smad7基因表达促进心肌纤维化过程。相反，在体外和体内实验中抑制miR-21可使Smad7基因表达上调，阻止心脏成纤维细胞活化、减轻心肌纤维化[6]。miR-21还通过靶向抑制Spry1基因表达促进心肌纤维化过程。Spry1不仅是Ras/MEK/ERK信号通路的抑制因子，还能够负向调节TGF-β1水平，起抗纤维化和心肌肥厚作用[7, 8]。miR-21靶向抑制Spry1基因表达，从而促进ERK/TGF-β1/Smad信号传导，介导TGF-β1/Smad2/3活化，诱导心梗后心肌纤维化发生[9]。此外，miR-21还可以通过靶向下调Jagged1基因表达介导TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转化[10]。

2. miR-133：虽然miR-133是一类肌肉特异性miRNA，主要在心肌和骨骼肌表达，但在心脏成纤维细胞中也有少量表达。miR-133具有抑制心肌纤维化的作用。在心肌成纤维细胞中，过表达miR-133能够减少慢性HF大鼠心脏纤维化程度，改善心功能，而miR-133抑制剂则起到相反作用[11]。心肌成纤维细胞中miR-133a能够直接靶向下调胶原基因Col1A1，减少胶原合成[12]。此外，miR-133还通过负调控TGF-β/Smad信号通路拮抗心肌纤维化。研究显示TGF-β1是miR-133的靶基因，转染miR-133a至成纤维细胞能够显著下调TGF-β1的表达，阻止ERK1/2和Smad磷酸化，抑制胶原合成和心肌纤维化的发生[13, 14]。TGF-β/Smad通路的下游分子CTGF与TGF-β具有协同作用，能够促进胶原合成，是一个促心肌纤维化的关键调节因子。在成纤维细胞中miR-133a能够靶向下调CTGF基因表达，减少心脏成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原合成[15]，从而发挥抗纤维化作用。

3. miR-29：miRNA在心肌纤维化中并非只发挥单向作用。如miR-29，靶向突变或特异性敲低miR-29能够促进心肌纤维化的发生发展[16, 17]。但是与上述观察不一致的是循环miR-29a水平与心脏纤维化程度呈负相关[18]。目前对于miR-29作用机制的研究证实，miR-29调控纤维化过程是一个复杂的网络，它能够通过不同的靶标在不同细胞类型中发挥抗纤维化或促纤维化的作用。

TGF-β/Smad是miR-29发挥抗纤维化作用的主要靶点。研究发现成纤维细胞中miR-29受Smad3信号的负调控，并且miR-29能够有效抑制纤维化相关基因的表达。当使用卡维地洛抑制Smad3活化后，miR-29表达水平升高并下调纤维化靶基因Col1a1、Col3a1和α-SMA水平[19]。此外，TGF-β家族的同工型TGF-β2也是成纤维细胞中miR-29靶向负调控的蛋白之一，提示miR-29与TGF-β/Smad之间存在正反馈通路并发挥抗纤维化作用[20]。

miR-29还能下调MAPK信号通路抑制心肌纤维化。MAPK信号是一条向细胞核传导细胞外刺激信号的系统，该通路包括四条主要的亚族：ERK1/2、JNK、p38/MAPK和ERK5通路。研究表明miR-29通过靶向下调MAPK信号通路抑制成纤维细胞增殖[23]。类似地，miR-29b能够阻断ERK1/2的激活，抑制肌成纤维细胞的形成并减弱胶原蛋白的合成，拮抗心脏纤维化[24]。

尽管以上结果显示在成纤维细胞中miR-29能够拮抗多种因素诱导的心肌纤维化。但是Yassine Sassi等人发现，在某些特定的环境中miR-29可以促进心肌纤维化的发生。心脏超负荷下，miR-29缺失小鼠或输注miR-29抑制剂的小鼠心肌纤维化程度降低，小鼠心功能改善。并且体内靶向敲低心肌细胞miR-29也可以防止心肌肥厚和纤维化[25]。这与以往对miR-29抑制心肌纤维化的认知相反。进一步研究发现这种结果可能与心肌细胞miR-29激活Wnt信号有关。Wnt信号通路是诱导心脏成纤维细胞增殖、胶原沉积的机制之一，参与了肾脏、肺等多种组织器官的纤维化过程[26]。miR-29通过靶向下调Wnt信号传导的负调节因子GSK3B、CTNNBIP1、HBP1和GLIS2的基因表达，激活经典和非经典Wnt途径促进心肌纤维化的发生[25]。该结果提示在复杂的心肌组织环境中miR-29并非表现出单纯的抗纤维化作用，而是维持了纤维化的平衡。

二、miRNA调节心肌肥厚

心肌肥厚是由于压力或容量超负荷等因素引起遗传表型以及心肌细胞形状、大小和功能的适应性改变。尽管心肌肥厚是心脏强有力的代偿形式，但不及时消除病理性诱发因素，将无法长期维持心脏功能，导致顺应性和泵血功能降低。病理性心肌肥厚是由一系列复杂的信号通路驱动的，其中miRNA在病理性心肌肥厚中具有重要的调控作用。

1. miR-1：miR-1是肌肉特异性表达的miRNA，也是人类心脏中最丰富的miRNA之一。心肌细胞中的Ca/CAM信号系统是诱导病理性心肌肥厚发生发展的重要信号通路，也是受miR-1负调控的主要信号通路[27]。体外研究发现miR-1能够靶向负调控上述钙信号通路中的CaM、Mef2a和Gata4基因表达阻断心肌细胞肥大[28]。胰岛素信号转导通路是一种高度保守的促肥厚通路，该通路活性同样受miR-1抑制。该通路中IGF-1是miR-1的靶基因，在心肌细胞中过表达miR-1能够下调IGF-1基因表达，从而拮抗心肌细胞肥大[29, 30]。此外miR-1还可通过调控细胞骨架蛋白的表达发挥抗心肌肥厚作用。肌动蛋白结合蛋白Twf-1是miR-1的靶基因之一。在去氧肾上腺素诱导心肌肥厚时，心肌细胞miR-1下调可引起Twf-1的蛋白水平增加，而过表达miR-1能够通过调节细胞骨架，维持心肌细胞的形态，下调肥大标志物水平，表现出抗心肌肥大活性[31]。

虽然miR-1表现出抗心肌肥厚作用，但近期研究发现位点特异性氧化修饰miR-1能够通过影响碱基互补配对，改变miR-1的调控靶基因反而促进了心肌肥厚的发生。Seok等人发现虽然异丙肾上腺素（Isoproterenol，ISO）诱导心肌肥厚时miR-1表达下调，但是8-氧代鸟嘌呤（8-oxoguanine，o8G）修饰的miR-1增加。由于鸟嘌呤氧化后产生o8G可以与腺嘌呤配对，当o8G富集于miR-1的种子区域时，能够使o8G与腺嘌呤配对从而识别结合新的靶基因。对过表达o8G-miR-1的心肌细胞进行转录组分析，结果显示在下调差异表达基因中心脏肥大相关生物途径基因富集，进一步验证显示o8G-miR-1能够通过靶向下调抗肥大因子Gata4和Gsk3b以及钙调节剂Serca2基因表达，从而驱动心肌肥厚的发生[32]。

2. miR-133：miR-133位于三个双顺反子基因簇上，其中两个基因簇在心肌中特异性表达，研究显示miR-133具有抗心肌肥厚作用。Alessandra等人通过腺病毒载体感染使新生小鼠心肌细胞过表达miR-133，并检测了包括心肌细胞表面积、胎儿基因、肌球蛋白重链基因等肥厚标志物，结果显示miR-133能够靶向下调RhoA、Cdc42基因表达，抑制促肥厚信号传导[33]。此外，miR-133和Ca2+CaM依赖的钙调神经磷酸酶（CaN）之间存在正反馈调节回路。在体内和体外心肌肥厚模型中CaN活性上调能够抑制miR-133的表达。而被抑制的miR-133通过释放CaN或NFAT，直接或间接激活NFAT途径，介导肥厚进行性发生[36-38]。

3. miR-208：miR-208是最重要的富含于心脏的miRNA之一，也是目前研究较为广泛的促肥厚miRNA之一。过表达miR-208能够从表观上增大心脏大小，使心室壁增厚，降低心功能[39]，提示miR-208有潜在的促心肌肥厚及心肌重塑作用。在体内和体外的心肌肥厚模型中发现，miR-208a和miR-208b能够通过抑制肥厚负调节因子Thrap1和Myostatin的基因表达，间接促进肥厚标志物β-MHC的活性，促进心肌肥厚的发生[39]。尽管在基础状态下敲低小鼠miR-208并不能诱导明显的表型，但在多种应激刺激下miR-208缺失的小鼠心肌细胞肥大程度降低[39, 40]。类似地，通过全身递送miR-208抑制剂能够防止高血压诱导的心肌重塑，改善心脏功能[41]。

4. miR-155：尽管非心肌特异性miRNA在肥厚过程的研究较为分散，但是不可否认的多种非心肌特异性miRNA也参与调节心肌肥厚，miR-155就是其中之一。miR-155在组织中普遍表达，并在淋巴细胞和巨噬细胞中富集。尽管miR-155在心肌细胞中的表达水平较低，但是仍然表现出促心肌肥厚作用。与胚胎和幼年小鼠相比，成年小鼠心肌细胞具有更高的miR-155表达丰度。敲除miR-155的成年小鼠能够拮抗压力过载或CaN转基因诱导的心肌肥厚，在体外抑制内源性miR-155也具有类似的抗肥厚作用。Jarid2能够抑制细胞周期蛋白D1表达从而抑制心肌细胞增殖[42]。Jarid2是miR-155的靶基因，敲除Jarid2能够消除miR-155下调诱导的抗肥厚作用，提示miR-155依赖负调控Jarid2基因表达促进心肌肥厚[43]。

位于淋巴细胞和巨噬细胞中的miR-155能够通过靶向肥厚相关通路基因以旁分泌形式促进心肌肥厚的发生。JAK/STAT3是调控心肌肥厚的信号通路之一，过表达STAT3可诱导左心室壁增厚[44]，相反使用STAT3抑制剂能够减轻由Ang II诱导的心肌肥厚[45]。Stephane等人发现压力超负荷可诱发巨噬细胞向心肌浸润，并且巨噬细胞中的miR-155能够靶向下调Jak/STAT抑制剂Socs1基因表达，介导STAT3磷酸化并将促肥厚旁分泌信号转导至心肌细胞，从而促进心肌肥厚和HF发展[46]。此外，巨噬细胞miR-155还能够通过靶向下调FoxO3a基因表达促进心肌肥厚的发生。研究发现尿毒症心肌病中浸润的巨噬细胞能够分泌富含miR-155的外泌体，并通过直接靶向下调FoxO3a基因表达，调节心肌细胞焦亡和肥大。相反在尿毒症心肌病小鼠模型中特异性敲低miR-155可诱导更高水平的FoxO3a蛋白表达，下调细胞焦亡标志物caspase-1、IL-1β、IL-18和焦亡的执行分子GSDMD蛋白表达；显著降低心重体重比、减少心肌肥厚区域，改善心脏功能[47]。对于miR-155的研究提示非心肌特异性的miRNA在心肌细胞中的少量表达也能够影响心肌重塑过程。即使非心肌或心肌间质细胞中的miRNA通过旁分泌的形式也可参与调控心肌重塑。

三、循环miRNA可作为心肌重塑生物标志物

由于miRNA在调节心肌重塑过程中扮演重要角色，而且miRNA能够通过与微泡、脂蛋白颗粒及蛋白质结合，从而稳定存在于循环中，具有可检测性[48, 49]。因此循环miRNA有望作为新兴的生物标志物，用于心肌重塑相关疾病的诊断。一项对于150名急性心肌梗死患者的研究中建立了两个多变量模型来预测心室重塑情况。模型一包括NT-proBNP在内的临床测量参数，模型二包括模型一的临床测量参数和四种miRNA（miR-16/27a/101/150）。统计分析证实，四种miRNA提高了模型一的预后价值，说明循环miRNA能够以组合的形式对当前的心肌重塑标志物加以补充[50]。

尽管研究支持循环miRNA的临床价值，但是目前对于特定循环miRNA作为生物标志物仍存在争议。部分miRNA在相似研究中的重复性较差，是阻碍其进入临床应用的一大原因。以心肌重塑过程的关键因子miR-1为例，前文已叙述过miR-1在心肌肥厚中的重要作用，但是目前对于循环miR-1作为心肌重塑生物标志物的意义仍未达成统一。在一项对80名ST段抬高心梗患者的观察中发现，患者入院时循环miR-1水平与左心室舒张末期容积和左心室收缩末期容积的变化百分比呈正相关。并且通过受试者工作特征曲线评估发现miR-1的预测能力与目前普遍认可的心肌重塑预测标志物NT-proBNP水平相当，支持了miR-1作为生物标志物的潜力[51]。但是在另外一项对于44名急性心肌梗死患者的研究中发现循环miR-1水平与左心室舒张末期容积的绝对值未见相关性[52]。

这或许与研究队列的纳排标准、样本量、以及对心室重塑的定义及计算方法（百分比与绝对值）的不同有关。此外miRNA提取及反转录的方法不同，以及分析后相对定量内参的选择也不同，这也会对最终结果产生影响[53, 54]。因此对于循环miRNA走入临床视野除了需要更大样本量的研究以消除个体异质性，还需要建立标准化的检测规范，从而提供更具有说服力的证据。

四、基于miRNA治疗心肌重塑

随着miRNA在心血管领域研究的不断深入，基于miRNA的抗心肌重塑治疗也在不断发展。该治疗导入特定miRNA类似物或小分子抑制剂至心脏，从而影响miRNA的表达水平，干预心肌重塑的关键信号通路，发挥改善心功能的治疗作用。

虽然miRNA治疗心肌重塑的体外和动物实验较多，但是目前进入临床试验的仅有miR-132。在扩张型心肌病、肥厚型心肌病和缺血性心肌病患者的心脏组织中miR-132表达均上调[55, 56]，miR-132可以下调FoxO3基因表达，抑制CaN降解，激活NFAT信号途径[57]。心肌特异性过表达miR-132可导致心脏体积增大，心脏重塑标志物心钠肽（Atrial natriuretic peptide，ANP）、脑钠肽（Brain natriuretic peptide，BNP）和Myh7表达上调，而敲除miR-132具有抗心肌重塑作用。以上研究结果提示miR-132可能是干预HF发展的分子靶点。CDR132L是人工合成的miR-132反义抑制剂，Foinquinos等人在猪慢性HF模型中注射CDR132L能够减少心梗后的不良心肌重塑，改善心肌收缩和舒张功能[58]。近期CDR132L单中心Ib期临床试验也已完成，结果显示CDR132L可以显著降低NT-proBNP水平[59]。虽然这项临床试验的患者例数较少，但是CDR132L表现出改善心肌重塑的正向作用，为进一步的临床转化提供了良好的基础。尽管在这项临床试验中CDR132L的安全性和耐受性良好，但是考虑到miR-132具有多个靶点，并且在不同组织器官均发挥生物学作用，因此采用全身递送仍有可能导致不良反应。因此采用细胞特异性靶向递送miRNA从而减少对非靶器官的影响尤为重要。目前基于腺病毒、脂质体、纳米颗粒和外泌体的药物靶向递送系统的研究也正在展开，为miRNA治疗提供了一种更为安全的方式，有望取代目前的全身递送形式。

五、总结与展望

随着miRNA在心肌重塑过程中功能的研究不断深入，不仅帮助解释了心肌重塑的发生发展机制，也为心肌重塑诊断与治疗提供了新的工具。尽管目前miRNA作为心肌重塑生物标志物具有良好的应用前景，基于miRNA递送的心肌重塑治疗也进入到临床阶段，但是仍需要进一步的深入探索，以筛选出更具特异性的生物标志物，降低治疗所带来的不良反应，助益心肌重塑的预防、诊断和治疗。

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