脱落细胞检测在恶性肿瘤诊断中的应用与临床价值
郑磊，教授，南方医科大学南方医院检验医学科主任，国家杰出青年基金获得者，“珠江学者”特聘教授，广东省医学领军人才，南粤优秀教师，羊城好医生。长期致力于医学、化学、生物医学、材料学等多学科交叉医学研究，尤其在临床检验诊断新技术开发及应用方面进行了系统性的深入研究；已在国际知名学术刊物发表论文70余篇，其中影响因子大于10的研究论文20余篇；担任《Journal of Extracellular Vesicles》副主编、《Aggregate》编委、《VIEW》编委、《ExRNA》编委、《Frontiers in Laboratory Medicine》编委。主要研究方向：循环稀有细胞、细胞外囊泡、游离核酸等“液体活检”新型生物标志物的临床应用、生理病理机制及检测技术；生物传感、新型发光分子、DNA纳米技术等先进功能材料与前沿技术的生物医学应用研究；人工智能与大数据的检验医学应用。
叶昕怡，南方医科大学南方医院博士研究生。主要研究方向为循环肿瘤细胞检测新方法开发与人工智能联合肿瘤代谢组学的医学应用。
脱落细胞学检测是经典的检验方法，脱落细胞学检测技术是临床实验室中最基本、最简便、最实用的诊断技术。近年来，我国体液细胞学越来越受到临床和实验室的关注，脱落细胞具有完整的细胞结构，根据细胞独特的结构和形态特征，可以反映不同疾病的相关信息，为疾病诊断找到最直接的证据。通过细胞学检查积极明确病理类型，这有利于采取适当的治疗方式，尽可能控制患者病情的进展。
肿瘤转移是癌症相关死亡的最重要原因。胸腔、腹膜等部位是最常见的肿瘤转移灶。在肿瘤恶性进展中，最常见的临床表现是恶性浆膜腔积液，也常预示患者治疗效果及预后较差。细胞学检查中发现肿瘤细胞是判断恶性积液的最重要的方法之一，尤其对一些病因和性质不明的疾病往往有重要的提示作用。由于恶性肿瘤细胞比正常细胞容易从原位脱落且与良性细胞形态差异较大，故可通过体液细胞形态学检查以简便、无损的捷径鉴定其性质。目前常见的标本类型主要有脑脊液、胸腔积液、腹水、尿液沉渣、肺泡灌洗液等体液。常规脱落细胞学检测指标主要是脱落细胞染色观察细胞形态结构、样本中蛋白含量测定、各类型细胞计数及比例计算等，而随着分子生物新技术的应用，如肿瘤细胞标志物检测、细胞倍体分析及单细胞测序等，通过脱落细胞学的检查获得更多的信息，进一步拓展脱落细胞学检测在肿瘤疾病中的应用。
一、胸腔积液
胸腔积液是癌症晚期常见并发症之一，其中以原发性肺癌最为多见，其他癌症如乳腺癌、肝癌、食管癌、胃癌、结直肠癌等转移侵犯胸膜时也可出现胸腔积液，是癌症晚期的重要特征之一。临床上部分肿瘤患者以恶性胸腔积液作为肿瘤的首发症状。同时，肿瘤患者常伴随免疫功能低下及营养状况不佳的情况，合并感染时也可形成胸腔积液，但此时的胸腔积液多表现为浑浊，有大量白细胞。而发生漏出性胸腔积液时，患者常有纳差等症状。胸腔积液呈浅黄色或者无色，外观透明清亮。需要注意的是临床上患者胸腔积液往往是由多种原因综合引起的，尤其应注意血性胸腔积液中肿瘤细胞阴性的情况。部分良性细胞（如反应性间皮细胞）在形态学上易混淆以及部分样本中肿瘤细胞占比低，因此脱落细胞学诊断恶性胸腔积液的敏感度较低（50%~60%），应至少送检3次以确认患者的胸腔积液中是否有肿瘤细胞，从而准确判断患者的胸膜转移情况，以免造成患者治疗延误。有学者报道联合胸腔积液的DNA倍体分析与mir-21检测，可将良恶性胸腔积液鉴别的准确率提升至90%[1]。单细胞测序是近年来新出现的判断恶性肿瘤细胞的可靠工具，通过比对目标细胞是否携带与肿瘤原位一致的驱动基因突变或全基因组拷贝数变异特征可确定目标细胞的性质和来源。使用单细胞测序对胸腔积液进行全基因组拷贝数改变（CNAs）分析可以确认细胞的肿瘤来源，将检测敏感度提升至91%，诊断性能更高，并可识别与预后相关的位点，为患者治疗提供更精准的信息[2]。
此外，临床上也偶见因胸膜间皮瘤引起胸腔积液的患者。间皮瘤是一种间皮来源的肿瘤，多见于胸膜，主要症状常表现为胸痛及消瘦等。由于缺乏特征性临床表现，较易造成误诊。约60%的间皮瘤表现为弥漫性，恶性程度高，预后差，必须与转移瘤相鉴别。部分患者可出现肿瘤标志物升高而形态学阴性的检测结果。由于形态学制片细胞数量有限，可能会出现假阴性，此时应反复送检，以提高阳性率。研究结果显示，采用流式细胞术检测胸腔积液中脱落细胞的特异性表面抗原，可将诊断敏感度由15%（标准细胞学分析）提升至48%[3]，且流式细胞术易于标准化，受传统形态学制片及诊断的主观因素影响较小，尤其在胸腔积液肺癌脱落细胞诊断时敏感度和特异度可高达90%。结合新型荧光探针、特异性抗体等方法，可充分发挥流式分析速度快、敏感度高等优点，开拓如免疫治疗疗效监测及预后判断等应用领域，进一步提升脱落细胞学的临床诊断价值。
二、尿液
目前使用膀胱镜结合组织活检是膀胱癌患者诊断的“金标准”。膀胱镜检查侵入性强，患者往往要承受较大的痛苦且对长期监测的依从性较差。尿液是实验室最容易获得的无菌体液之一。尿液脱落细胞学检查以无创、特异性较高、假阳性率较低等优势成为膀胱肿瘤筛查、诊断和监测的最佳方法[4]。目前临床上的尿液有形成分检测主要以光学显微镜为主，通过尿路上皮的核质比、核染色情况等进行判别。人工智能识别系统有望在未来得到进一步发展，通过对数据进行分析自动判别细胞类型，助力肿瘤的精准检测[5]。也有学者利用肿瘤代谢相关标志物HK2对尿液中参与糖酵解增高的播散性肿瘤细胞进行荧光标记。在检测低级别膀胱癌和早期膀胱癌（Ta期）的灵敏度仍能达到86%和88%，且不受样本血尿的影响，该技术将有望用于膀胱癌的无创筛查[6]。
三、宫颈细胞
宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，也是女性健康的第一杀手。当子宫内膜或宫颈交界处发生癌变时，脱落细胞往往发生形态学变化。基于液基细胞学的宫颈癌筛查方法是目前最有效的癌症筛查方法，可准确检测出宫颈异常细胞。上海纺织系统55万人次宫颈癌普查结果显示，利用脱落细胞检查的宫颈癌阳性率下降了72%。在其他10省、市宫颈癌普查检测报告中，细胞学检查诊断宫颈癌的阳性率超过95.5%，可疑病例的确诊率接近70%[7]。宫颈液基薄层细胞学检测技术（TCT）的应用提高了宫颈癌和癌前病变的诊断准确率，同时也有文献报道利用时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）检测宫颈细胞中p16INK4a蛋白，对宫颈异常或肿瘤性病变与宫颈炎的鉴别敏感性和特异性较高，尤其对于细胞萎缩、核质比增加的老年患者检测特异性更好，或可利用仪器及商业化试剂盒开发实现大规模自动化检测，有利于癌前病变的早期发现与治疗，可有效阻断疾病病程，减少宫颈癌的发生率和病死率[8]。
四、腹水
腹腔是人体最大的体腔，含纳了多个重要脏器及大血管。肝脏、卵巢等主要器官的肿瘤发生腹壁转移时常形成腹水。若能通过腹水的细胞学检测，及时提示腹壁转移，可有效减少患者手术痛苦，争取治疗时间。有研究者将纳米检测系统引入脱落细胞学样本的检测，通过纳米粒子靶向结合到肿瘤表面，结合拉曼光谱分析方案，有效提高检测通量及敏感度，并可用于体外化疗药物敏感性的检测[9-10]，对实现癌症的早期诊断和个性化治疗，提高癌症患者的生存率具有重要意义。
五、其他体液
支气管肺泡灌洗液细胞学检查是临床常用的肺癌诊断方法之一。通过肺泡灌洗对肺部支气管上皮细胞进行获取，在肺泡灌洗液中查见肿瘤细胞，对活检困难的周围型肺癌有较好的诊断效果。在形态学的基础上，结合上清液中肿瘤标志物的检测，或联合异倍体检测、EGFR、KRAS和Her-2/neu等药物靶点基因突变测序及蛋白分型等分子生物学技术，有望为患者提供更精准的用药指导与预后判断[11]。脑脊液中恶性细胞的检出对中枢神经系统肿瘤的诊断也具有一定价值，尤其对不明原因占位的患者结合高通量测序等肿瘤相关灵敏检测，可有效提升诊断的准确性[12]。近年来，也有学者对口腔癌患者唾液中的口腔上皮进行肿瘤相关早期检测及发病机制研究[13]。基于粪便中脱落结肠癌细胞的检测及其衍生的DNA、RNA和蛋白质等生物标志物的鉴定也是消化道肿瘤新的诊断和筛查方向[14]。
脱落细胞学检测与组织活检相比，脱落细胞学检查侵入性更小，患者对重复检查的依从性更高，有利于在治疗过程中监测患者的疗效。目前常规体液检查的内容和方法难以满足临床检查和疾病诊断的需要。作为检验基础的一部分，实验室工作者应重新回归对细胞的关注，积极与临床医生沟通，充分展现其特异性高、方法简单、快速等优势，进一步联合单细胞测序、纳米技术等手段，可有效提升肿瘤检测的敏感性与特异性，有望为患者提供更多精准的疾病信息，为个性化医疗提供有效的实验手段及依据，提升诊疗水平，助力精准医学的不断发展。
参考文献
Liu C, Huang L, Zhang X, et al. Combination of DNA ploidy analysis and miR-21 or miR-24 in screening malignant pleural effusion[J]. Interact Cardiovas Thorac Surg, 2017, 26(3):1-6.DOI: 10.1093/icvts/ivx327.
Chen J, Yang Y, Wang Z, et al. A Multicancer Malignant Pleural Effusion Diagnostic Test Using Hexokinase 2 and Single-Cell Sequencing[J].Clin Che,202，68(5):680-690. DOI: 10.1093/clinchem/hvac003.
Beije N, Kraan J, Bakker MD, et al. Improved diagnosis and prognostication of patients with pleural malignant mesothelioma using biomarkers in pleural effusions and peripheral blood samples – a short report[J]. Cell Oncol, 2017, 40(Suppl 5):511-519. DOI:10.1007/s13402-017-0327-7.
张瑞钰, 梁斯晨, 王志启, 王建六. 卵巢上皮性癌的淋巴结转移规律及前哨淋巴结检测技术在早期患者中应用的研究进展[J]. 中华妇产科杂志, 2021, 56(9): 656-659.
Xing J, Reynolds JP. Diagnostic Advances in Urine Cytology[J]. Surg Pathol Clin, 2018, 11(3): 601-610. DOI: 10.1016/j.path.2018.06.001.
Wang Z, Chen J, Yang L, et al. Single-Cell Sequencing-Enabled Hexokinase 2 Assay for Noninvasive Bladder Cancer Diagnosis and Screening by Detecting Rare Malignant Cells in Urine[J]. Anal Chem, 2020, 92(24):16284-16292. DOI: 10.1021/ acs.analchem.0c04282.
杜延茹, 尹贞子. 关于胸腔积液、腹水中脱落细胞在诊断肿瘤方面的评价[J].中华现代临床医学杂志,2006,4(24).
Ding L, Chen Q, Fan W, et al. Application of a time-resolved fluoroimmunoassay for detection of p16INK4a in cervix[J]. Ann Diagn Pathology, 2017,7-10. DOI: 10.1016/j.anndiagpath.2017.04.004.
Chen XJ, Zhang XQ, Liu Q, et al. Nanotechnology: a promising method for oral cancer detection and diagnosis[J]. J Nanobiotechnol, 2018, 16(1):52. DOI: 10.1186/ s12951-018-0378-6.
Traynor D, Behl I, O'Dea D, et al. Raman spectral cytopathology for cancer diagnostic applications[J]. Nature Protocols, 2021,1-20.
Ariba Z, Harpreet K, Parikshaa G, et al. Role of bronchoalveolar lavage in diagnosing pulmonary infections and malignancies: Experience from a tertiary care center[J]. Diagn Cytopathol, 2020,1-10. DOI: 10.1002/dc.24574.
禹金良, 闫兆月, 盛致远, 孙勇, 高玉帅, 步星耀. 脑脊液ctDNA液体活检在脑恶性肿瘤中的临床研究[J]. 医药论坛杂志, 2020, 41(6): 75-79.
孙岩, 程磊, 彭显. 唾液外泌体与口腔疾病相关研究进展[J]. 口腔疾病防治, 2022, 30(4): 300-304.
Loktionov A. Cell exfoliation in the human colon: Myth, reality and implications for colorectal cancer screening[J]. Int J Cancer, 2007, 120(11): 2281-2289. DOI: 10.1002/ijc.22647.
