具核梭杆菌作为生物标志物在结直肠癌诊疗中的临床应用价值

作者:王毅峰 陈文丹 张欣 张义 2022-07-22
作者单位:山东大学齐鲁医院检验医学中心

张义,医学博士、教授、博士研究生导师。现任山东大学齐鲁医院检验医学中心主任,生物标志物与人工智能应用山东省工程研究中心主任。兼任中华医学会检验分会委员、中国医师协会检验分会委员、中国医学装备协会检验医学分会副会长、中国中西医结合学会检验分会常委、山东省免疫学会免疫技术及标准专业委员会主任委员、山东省医学会检验分会候任主任委员等。美国MD安德森癌症中心访问学者。主要研究方向为生物标志物的筛选、转化应用及机制研究。先后主持国家自然科学基金项目和省部级重点研究课题16项,以第一/通讯作者发表相关研究论文50余篇,其中SCI收录30余篇;获教育部及山东省科技进步奖5项,国家发明专利7项,软件著作权2项。


张欣,医学博士、副主任技师、硕士生导师。现任山东大学齐鲁医院检验医学中心主任助理,齐鲁卫生与健康杰青人才。兼任中国医师协会检验医师分会青年委员、中华医学会检验医学分会青年教师科研创新联盟委员、山东省研究型医院协会肿瘤液体活检专业委员会副主任委员等。主要从事新型生物标志物发现与体外诊断研究,近年主持国家自然科学基金2项、山东省重点研发计划等省部级课题5项,以第一/通讯作者在“Clinical Cancer Research”等国内外杂志发表论文20余篇,其中SCI收录21篇,授权国家发明专利8项,参与获山东省科技进步一等奖1项,山东省医学科技一等奖1项。


结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)的发病率和病死率均居世界前列,严重威胁人类健康。具核梭杆菌(F. nucleatum)是一种主要定植于口腔的革兰阴性无芽孢厌氧菌,它与CRC的发生、发展密切相关,随着研究的深入,其被发现或可作为生物标志物在CRC的诊断中发挥作用。本文将重点讨论F. nucleatum在CRC诊断中的应用,旨在推进F. nucleatum与CRC相关研究的临床转化。


CRC(Colorectal cancer,CRC)是世界最常见的恶性肿瘤之一。据2020年全球癌症信息网统计数据显示,CRC的发病率和病死率在全球所有癌症中分别位居第三位和第二位,严重威胁人类的健康[1]。早发性CRC(年龄<50岁)的发病率在世界范围内持续增加,将进一步增加CRC相关疾病的负担[2]。


晚期CRC患者的预后并不理想,据统计资料显示,I、II期CRC患者的5年生存率分别为91%和82%,当CRC进展为IV期时,其5年生存率直接降至12%[3]。目前内镜结合活组织病理检查是CRC诊断的金标准,由于其为侵入性检查,耗时长,在大规模的人群筛查中具有局限性。除此之外,血清肿瘤标志物常用作CRC的筛查,如CEA和CA19-9等,采血取样,方便快捷,但对CRC诊断的敏感性和特异性不高,容易造成漏诊或误诊。因而探索一种新的有效的CRC诊断标志物对CRC患者的及时有效治疗和预后判断具有重要意义。


一、F. nucleatum概述


F. nucleatum属革兰阴性无芽孢厌氧菌,菌体中间膨大,两端尖细,呈纺锤形[4]。F. nucleatum是一种常见口腔定植菌,最初被认为是人体的正常菌群,随着在包括乳腺、胃、肝脏、结直肠等人体多个部位的发现,F. nucleatum逐渐被认为是一种机会性致病菌。随着近年来肠道菌群研究的深入,证实F. nucleatum与CRC关系密切,参与CRC的发生、发展,且可作为生物标志物用于CRC的诊断。


(一)F. nucleatum促进CRC发生发展的主要途径


1. F. nucleatum:F. nucleatum具有黏附、定植和侵袭能力,可黏附并定植于正常的消化道上皮细胞,进一步通过毒力因子改变肠上皮细胞的生物学行为,从而促进肿瘤的发生和发展。F. nucleatum分泌的黏附素FadA(Fusobacterium adhesin A)具有强黏附性和侵袭性,可以侵入正常肠黏膜上皮和内皮细胞以及癌变的细胞,并表达具有功能性的活性毒力因子,激活Wnt/Catenin通路,促进肠上皮细胞和内皮细胞突变以及CRC细胞的增长。FadA还可与E-钙黏蛋白结合,形成FadA-钙黏蛋白结合体,从而使细胞之间的连接松动,为细菌的入侵以及肿瘤细胞的转移创造有利条件[5]。Fap2(Fusobacterium autotransporter protein 2)是F. nucleatum表达的另一种毒力因子,其可促进F. nucleatum与宿主上皮细胞结合,直接对上皮细胞造成损伤,介导F. nucleatum与CRC表面过表达的Gal-GalNc结合,促进F. nucleatum定植的同时进一步诱导促炎因子IL-8和CXCL1的分泌,发挥炎性促肿瘤作用。


2. F. nucleatum诱导促癌性miRNA的过表达:微小RNA(microRNA,miRNA)在肿瘤细胞的异常基因表达中发挥重要作用,且具有细胞类型特异性和疾病特异性。F. nucleatum感染CRC细胞后,其表面的LPS可以被Toll样受体4(TLR4)识别,通过活化一系列信号通路引起miRNA-21过表达,增强CRC细胞的侵袭能力[6]。另外,miRNA-21可以直接靶向RASA1,抑制miRNA-21,增加RASA1的表达,促进RAS癌蛋白的失活,F. nucleatum促进细胞过表达miRNA-21可以使RASA1结合RAS癌蛋白诱导其失活的作用减弱,从而促进肿瘤的发生[7]。另外,Proença等[8]发现CRC组织中miR-34a的表达明显上调,F. nucleatum可能通过miR-34a介导的TLR2/TLR4活化增加炎症介质的表达,从而形成CRC发生、发展的肿瘤微环境。Guo等[9]也发现CRC细胞分泌的外泌体能选择性的携带miR-1246/92b-3p/27a-3p和CXCL16等信号分子,这些信号分子的水平与CRC组织中F. nucleatum的丰度呈正相关,通过外泌体由F. nucleatum感染的细胞到达非感染细胞,实现细胞间的信号传递,促进肠上皮细胞释放促炎因子IL-8和TNF,形成促瘤微环境。这些信号分子在细胞间的传递相当于另一种形式的细胞迁移,影响患者的预后。


3. F. nucleatum通过抑制免疫反应达到促肿瘤效应:F. nucleatum能够通过活化caspases诱导外周血单核细胞和多核细胞的凋亡,还可将T细胞阻滞在G1期,影响其成熟和发挥免疫学功能。随着研究的深入,Kostic等[10]发现F. nucleatum感染可招募肿瘤浸润的骨髓细胞,形成一个促进肿瘤形成和发展的免疫微环境。另外,F. nucleatum的外膜蛋白Fap2除增强黏附侵袭能力外,还可以结合并激活T细胞和NK细胞表达的人抑制性受体TIGIT和CEACAM1[11-12],抑制T细胞和NK细胞的活性,从而抑制机体的抗肿瘤免疫。除了抑制免疫细胞外,F. nucleatum还可通过多种途径促进感染过程中被明显募集的巨噬细胞向M2型极化,通过重构肿瘤微环境来逃避机体的抗肿瘤免疫反应。


4. F. nucleatum通过多种途径引起化疗耐药:化疗常作为晚期CRC患者联合手术治疗或单纯药物治疗抑制或逆转肿瘤进展的治疗方案。研究结果表明,除了直接的促肿瘤作用外,F. nucleatum同样可以通过化疗耐药影响CRC患者的预后。Zhang等[13]观察到高丰度的F. nucleatum与根治性手术后接受5-氟尿嘧啶辅助化疗的晚期CRC患者的化疗耐药相关,发现F. nucleatum感染通过TLR4/NF-κB通路上调BIRC3的表达,促进CRC细胞对5-氟尿嘧啶的化学耐药性。另外,F. nucleatum感染可下调miRNA-18a和miRNA-4082的表达,激活自噬通路,增强CRC细胞对奥沙利铂和5-氟尿嘧啶的化疗抵抗[14]。


目前已经证实,F. nucleatum在CRC发生、发展及化疗耐药中起着重要作用。F. nucleatum在促进CRC发生、发展中的作用及相关机制已被广泛探索,如何将研究成果转化为临床应用是目前工作的重点。在探索F. nucleatum与CRC之间的关系的过程中,研究者发现F. nucleatum可以作为一种生物标志物用于CRC的诊断和预后评估,以此为基础的新的肿瘤标志物探索和靶向F. nucleatum的新型疗法将为CRC的诊疗提供新思路。


二、F. nucleatum检测在CRC诊断研究中的应用价值


目前对于F. nucleatum的检测主要基于以下几类标本:组织标本、粪便标本、唾液标本和血清标本。


1. F. nucleatum在CRC组织中的表达及意义:目前,在F. nucleatum与CRC的研究中应用最广泛的样本是组织样本,依托组织样本,可以直接分析F. nucleatum的丰度与肿瘤的病理特征以及表观遗传学改变之间的关系。CRC组织的全基因组测序发现了CRC中存在丰富的F. nucleatum,随后大量的基于qPCR、免疫组化等方法的研究证实了F. nucleatum在结直肠癌发生、发展以及转移中的作用。研究发现,肿瘤组织中F. nucleatum的丰度与CRC的部位、侵袭深度、转移等相关;在表观遗传学方面,F. nucleatum的丰度与CRC的CpG岛甲基化表型、BRAF突变以及微卫星不稳定状态等相关;另外,F. nucleatum与CRC患者的化学耐药以及化疗后的复发相关,这些均直接或间接地影响CRC患者的预后。并且多项研究结果表明,组织中F. nucleatum丰度高的患者其预后明显差于F. nucleatum丰度低的患者。综上所述,组织中F. nucleatum的检测可作为CRC诊断、分子分型、疗效评价及预后评估的重要手段。


2. 粪便中F. nucleatum检测在CRC诊断中的应用:肠道菌群与CRC的关系一直是近年来研究的热点,由于细菌约占粪便干重的60%,因此粪便成为了研究肠道菌群的主要对象之一,无创取样的粪便F. nucleatum检测在CRC诊断中得到广泛应用。Yachida等[15]通过对616例受试者的粪便标本进行宏基因组学分析,发现CRC患者的微生物群组成与多发性息肉样腺瘤患者有很大差异,并且从黏膜内癌到CRC晚期,患者粪便中F. nucleatum的丰度不断升高。Liang等[16]采用qPCR方法检测203例CRC患者和236名健康对照的粪便样本后发现,CRC患者粪便中F. nucleatum的丰度明显高于对照组,F. nucleatum诊断CRC的敏感度为77.7%,特异度为79.5%。Huang等[17]基于汇总的多项研究数据进行的meta分析结果显示,粪便F. nucleatum诊断CRC的合并AUC为0.80,敏感度和特异度分别为0.68和0.78,对于CRC有较好的诊断价值。Liang等[18]的研究结果显示,粪便F. nucleatum诊断CRC的AUC为0.850,在无症状CRC中这一诊断效能不仅没有降低,反而有轻度提升(AUC=0.856),提示粪便F. nucleatum对于无症状CRC也有较好的诊断能力,有助于早期无症状CRC患者的筛查。


3. 唾液中F. nucleatum检测在CRC诊断中的应用:口腔和肠道是通过胃肠道连接的解剖学连续区域,由于唾液和消化后的食物通过这两个位置,也是一种化学相连,因而口腔微生物组可能与肠道微生物组的内容和变化有关。F. nucleatum在口腔中广泛存在,全基因组测序发现CRC组织中与匹配的同一患者唾液中的F. nucleatum具有高度的同源性,这一结果也在F. nucleatum任意引物多重PCR中得到证实。口腔F. nucleatum可通过消化道下降或在咀嚼、日常卫生活动或牙科手术引起的频繁短暂菌血症期间通过血行途径转移到CRC。


2016年的2项研究专门评估了CRC患者口腔菌群中F. nucleatum的存在及其数量,在这2项研究中CRC患者和健康对照组中F. nucleatum的检出率无明显差异[19-20]。在Guven等[21]的研究结果显示,CRC患者唾液中F. nucleatum的丰度明显高于对照组,但缺乏诊断价值。我们课题组基于多重qPCR的方法对CRC患者、增生性肠息肉患者、腺瘤患者和健康对照者唾液中的F. nucleatum进行系统分析,发现CRC患者唾液中F. nucleatum水平明显升高,唾液中F. nucleatum诊断CRC的ROC曲线下面积可达0.841,敏感度和特异度分别为71.5%和82.1%,其诊断价值明显优于血清CEA、CA19-9及其二者的联合。同时发现,唾液中F. nucleatum是CRC患者OS和DFS的独立预后危险因素。


另外,Hanie Morsi等[22]提出了一种从唾液中检测F. nucleatum亚种的蛋白质组学方法(基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱技术),该方法可更好地了解F. nucleatum亚种的可能个体生物学作用,这或可成为一种以特定亚种为目标的筛查、预防或治疗CRC的方法。


4. 血清中F. nucleatum抗体检测在CRC诊断中的应用:通常微生物可作为抗原在体内引起免疫反应,评估肿瘤相关微生物抗原的免疫反应是感染相关癌症的早期诊断方法之一,如针对人乳头瘤病毒(HPV)和幽门螺杆菌(Hp)抗体的血清学检测分别用于宫颈癌和胃癌的筛查。有学者报道,F. nucleatum感染的患者和慢性口腔感染F. nucleatum的小鼠体内可产生明显的体液免疫反应[23-24]。Gemmell等[25]发现F. nucleatum诱导产生的抗体与口腔其他微生物不具有交叉免疫反应,这为基于F. nucleatum抗体血清学检测的CRC诊断提供了一种可能。


临床检测发现早期CRC患者血清抗F. nucleatum抗体IgG和IgA效价均与良性结肠疾病患者和健康对照者相比显著升高[26],但与晚期CRC相比仅略有升高,说明在CRC早期即可检出抗F. nucleatum抗体,并且该抗体水平在相当长一段时间内可保持相对稳定。另外,与抗F. nucleatum-IgG相比,抗F. nucleatum-IgA对CRC表现出更好的诊断价值。通过ELISA方法检测血清抗F. nucleatum抗体并评估其诊断性能,发现抗F. nucleatum-IgA诊断CRC的敏感度为36.43%,特异度为92.71%。将其与CEA联合,诊断CRC的效能进一步提升(敏感度为53.10%,特异度为96.41%,AUC=0.848)。抗F. nucleatum-IgA与CEA和CA19-9联合检测可进一步提高对早期CRC的诊断能力,敏感度可达27.27%,这在不影响特异度(96%)的情况下很大程度弥补了CEA(9.09%)和CEA联合CA19-9(16.36%)诊断早期CRC敏感性低的不足。因此,抗F. nucleatum-IgA在早期CRC的大规模筛查方面具有重要价值。


三、需要解决的问题与前景


综上所述,F. nucleatum在CRC诊断方面具有一定的应用价值。不同类型样本中F. nucleatum的检测由于标本类型与检测方法的不同在CRC的诊断价值方面存在差异。细菌学方法由于其特异性高,一直被认为是细菌检测与鉴定的金标准,但由于其对样本取材、转运、培养等的要求高,培养周期又长,因而不宜作为F. nucleatum的常规检测方法。组织样本中F. nucleatum的检测较其他样本不同的是可以进行免疫组化检测,除了定性、定量外,还可以进行定位,其敏感性和特异性均高于传统检测方法,但因其对实验条件及实验人员的较高要求,以及组织标本需要侵入取材等,难以推广于临床。基于血清样本的F. nucleatum抗体检测,取样方便,检测快捷,但其敏感性低,容易漏诊,主要与其他血清学指标联合检测。可对多种标本类型进行检测的qPCR技术是目前常用的检测F. nucleatum的分子生物学方法,F. nucleatum的16S rRNA是常用的检测靶点,qPCR方法不受样本类型的限制,可对组织、粪便、唾液等多种类型的样本进行大样本量检测,在此基础上选择合适的样本类型,可提高F. nucleatum对CRC的诊断效能。


对于检测F. nucleatum诊断CRC推广于临床应用,确定一种合理的检测方法是目前需要解决的问题。一方面F. nucleatum的检测方法需要相关行业标准,不同的方法在样本采集、运输、保存、操作方面均有所区别,使得研究结果之间存在差异。另一方面,多数研究样本量较少,缺乏多中心、大样本量的研究,使得研究结果到临床应用的推广受到一定限制。目前,F. nucleatum促进肿瘤发生、发展的机制被广泛探索,F. nucleatum在肿瘤诊断方面的价值也逐渐被挖掘,相信随着现有技术及研究方法的不断进步,F. nucleatum的检测可以广泛应用于临床,在CRC的诊疗方面发挥重要作用。


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