血液系统恶性肿瘤微小残留病监测技术应用与临床诊疗意义
任健康，研究员、教授。金域医学集团副总裁，陕西省检验学会名誉主任委员。曾任陕西省人民医院检验科主任、陕西省临床检验中心常务副主任。曾任中华医学会检验医学分会常委、临床微生物学组组长、中国医师协会检验医师分会常委、中国医院协会临床检验专委会常委及陕西省检验学会主任委员等。发表论文90余篇，参编、参译专著7部。
颜呈呈，医学硕士，天津金域医学检验实验室血液肿瘤实验研发部。2017年毕业于北京协和医学院内科学专业型硕士；毕业后一直从事血液系统肿瘤NGS数据的分析和研发工作。2018-2021年在美国阿拉巴马大学伯明翰分校血液肿瘤中心实验室负责自体造血干细胞移植前意义未明的克隆性造血在淋巴瘤患者中的临床特征分析与课题研究。
微小残留病（Minimal Residual Disease/Measurable Residual Disease，MRD）是可检测到的残留病（Measurable Residual Disease）的概念，它是指肿瘤患者经过治疗后肿瘤细胞在患者体内的残留。MRD动态监测对于血液系统肿瘤患者的预后、疗效评估、治疗方案的调整和复发监测等均具有重要的临床意义。MRD监测的高深度和精准度的需求促进了新一代MRD监测技术的发展和不断完善，而新技术在MRD监测领域的应用又大大促进了血液肿瘤精准医疗的发展和进步。现将血液肿瘤MRD检测技术的应用进展与临床诊疗价值及临床指导意义进行简要概述。
一、MRD的基本概念
MRD起初被定义为微小残留病，2018年急性髓系白血病（acute myeloid leukemia AML）欧洲白血病网（European LeukemiaNet ELN）在其指南中更新为可检测到的残留病（measurable residual disease，MRD），因此，MRD是否阳性取决于检测方法的灵敏度[1]。
MRD的临床指导意义最早是在儿童急性淋巴细胞白血病（acute lymphblastic leukemia ALL）中发现并应用的，后来逐渐扩展到成人ALL。在成人和儿童ALL中的指导治疗的作用已经达成了NCCN诊疗指南的共识。《成人ALL诊疗规范（2018版）》和《中国临床肿瘤学会（CSCO）恶性血液病诊疗指南2021》中均指出，在急性淋巴细胞白血病整个治疗期间应强调规范的MRD监测，并根据MRD监测结果进行危险度和治疗方案的调整。MRD持续阴性的患者可继续多药联合化疗或考虑自体造血干细胞移植，MRD阳性的患者需优先考虑异基因造血干细胞移植。目前，MRD在急性髓系白血病（AML）和多发性骨髓瘤（mutiple myeloma，MM）等其他多种血液系统恶性肿瘤中的预后或治疗指导意义也日趋显著。
二、MRD监测的主要技术
1. 细胞形态学检测技术：细胞形态学检测MRD是在显微镜下根据白血病肿瘤细胞的形态学（细胞核、细胞质以及颗粒）特点查找并分类幼稚细胞。使用光学显微镜人工计数骨髓涂片中的原始细胞比例是判断形态学是否缓解的、最早用来评估白血病MRD状态的方法，也是目前最通用的检测方法之一。在AML诱导治疗后，检测骨髓涂片中的原始细胞数量，如果＜5%，就认定达到了形态学缓解（mCR）。1956年Bisel首次提出mCR的概念和标准，2012年O’Donnell等进行了修订，随后部分学者又提出血小板未完全恢复的完全缓解（CRp）和血细胞计数未完全恢复的完全缓解（CRi）的概念，前者是指计数200个以上的骨髓有核细胞中原始细胞＜5%，中性粒细胞绝对值计数（ANC）≥1.0×109/L，血小板＜100×109/L；后者是指骨髓原始细胞＜5%，ANC＜1.0×109/L。
mCR与AML的长期疗效密切相关，达到mCR的患者生存期长，没有达到mCR的患者生存期短。由于mCR与远期疗效具有明确的相关性，故各种药物及治疗方案的有效性多以mCR为主要评价指标。因此，mCR也是绝大多数药物Ⅱ期临床试验的主要终点。AML的治疗也是以mCR作为时间节点，分为诱导治疗和巩固治疗。由于该技术的敏感性偏低，同时与评估结果及技术人员的专业背景相关，所以评估结果可能带有一定的主观性。还有些专家认为形态学缓解的预后和治疗指导价值可以被其他的检测技术（如流式细胞学技术）所取代，但目前国内外专家并未就此观点达成一致结论[2]。
2.免疫学检测技术：目前免疫学技术用于MRD监测的为多参数流式细胞术（multiparameter flow cytometry，MP-FCM）。多参数流式细胞术（multiparameter flow cytometry，MP-FCM）是运用不同荧光标记的多种抗体组合对造血细胞表面或胞内抗原的表达状况进行检测，进而对细胞的来源、分化程度、表型异常与否进行分析判断的高通量、高敏感性的检测技术，已成为恶性血液病的诊断分型、治疗监测、预后评估及治疗靶点筛查中必不可少的实验诊断手段。
目前，用来监测MRD追踪白血病肿瘤细胞的方法有3种：（1）白血病相关的免疫表型方法leukemia associated immunophenotypes（LAIP）；（2）区分正常细胞的方法different from normal（DFN）approch；（3）白血病干细胞的方法leukemia stem cell（LSC）。最常用的是前2种，即LAIP和DFN，其中用LAIP监测MRD需要对初诊时的样本进行MRD监测生物标志进行划分，但如果没有初诊样本，也可用DFN的方法进行MRD监测；同时，该方法可减少抗原漂移造成的假阴性。2018年和2021年ELN MRD工作组制定的共识中建议采用初诊-LAIP联合DFN方法进行流式细胞MRD监测[1，3]。不同的血液肿瘤细胞具有不同的表面抗原的表达，可根据肿瘤细胞表面抗原表达特点制定不同的疾病特异性的流式检测panel，对不同血液肿瘤患者进行诊断、鉴别诊断和MRD动态监测[4]（表1）。
表1. 急性白血病CLL和MM中基于MFC进行MRD检测的方法学特征[4]
备注：AML（Acute Myeliod Leukemia，急性髓细胞白血病）；B-ALL（B cell Acute lymphoblastic leukemia，急性B淋巴细胞白血病）；T-ALL（T cell Acute lymphoblastic leukemia，急性T淋巴细胞白血病 ）；CLL（Chronic lymphocytic leukemia，慢性淋巴细胞白血病）；MM（Multiple myeloma，多发性骨髓瘤）；BM（Bone Marrow，骨髓）；PB（Peripheral Blood，外周血）
目前，最常用的流式细胞仪是8~10色流式细胞仪，也是目前应用最广泛的技术之一，可用于90%~99% 的血液系统肿瘤患者，其灵敏度为0.01%。由于该技术的灵敏度较形态学高100倍，因此国内外多项研究结果表明，利用流式细胞学技术监测MRD能够对部分形态学缓解的患者的预后做出更精准的评估并指导治疗。
近几年来精准医学的飞速发展对检测技术的灵敏度提出了更高的要求，所以新一代流式细胞学技术（next generation flow，NGF）应运而生。2016年国际多发性骨髓瘤工作组（IMWG，International Myeloma Working Group）制定的指南中明确指出，可以通过NGF 技术检测治疗后MRD的水平来评估治疗疗效。欧洲流式学会建议MM-MRD应用2管8色抗体组合的二代流式细胞术（Next generation flow cytometry，NGF）进行MRD监测[5]。
尽管NGF检测的灵敏度较高，可应用于99%的白血病或淋巴瘤的患者，但NGF仪器数据产出较大，对于计算机设备要求较高；同时实验流程的操作过程以及数据解读很大程度上依赖于技术员的专业水平；其对样本的质量和数量要求较高等条件限制了该技术在临床检验中的推广应用，但随着计算机等相关技术的不断进步，NGF技术监测MRD的方法将在临床检测中发挥越来越重要的作用。
3. 临床分子生物学检测技术：分子生物学技术监测MRD通常是指PCR技术和NGS技术检测白血病肿瘤细胞相关的异常基因的定量动态变化，其中PCR技术主要是指定量Q-PCR和数字PCR（Droplet Digital PCR）；NGS技术主要是指利用分子标签纠错的NGS（error-corrected NGS with unique molecular identifiers）检测特定的肿瘤相关的靶向基因突变以及IG/TCR免疫组库的克隆性鉴定和MRD监测。
（1）PCR检测MRD：Q-PCR监测MRD是指利用实时荧光定量PCR技术对白血病肿瘤相关的融合基因或者异常基因表达进行定量检测，如AML相关的NPM1、RUNX1-RUNX1T1、CBFBMYH11、PML-RARA、KMT2A-MLLT3、DEK-NUP214、BCR-ABL和WT1。一般来讲，该方法的灵敏度可达10-4。它与流式细胞学检测方法不同，该方法并不能应用于所有的血液肿瘤患者，仅可应用于具有特定基因异常改变的患者，在AML中可以覆盖40%~60%的患者。该方法操作相对简单，结果较为客观，TAT周期（turnaround time）较短，性价比相对较高，因此也是临床应用较为广泛和成熟的方法之一。
数字液滴PCR技术（ddPCR），是荧光PCR新一代技术，通过对常规PCR体系进行极大比例的稀释和分液，使单个液滴/微孔进行PCR扩增，随后读取每个微孔/液滴中的荧光信号，获得绝对定量的结果，其灵敏度可以达到10-5，且只需要很少的模板量，尤其适用于痕量、不易得到的待检样品，弥补了第二代PCR系统难以精确测定基因拷贝数、无法对痕量突变定性和定量、精确度低等的缺点。多项研究结果表明，ddPCR比流式细胞术和传统的荧光Q-PCR技术能够更精准的反应体内MRD的真实水平，更早的提示肿瘤复发的趋势[6-7]。尽管目前该技术的价格较高，限制了临床应用，但更精确，更数字化的特点使得其正在越来越多的进入国内临床检测领域，并发挥着越来越重要的作用。
（2）NGS检测基因突变MRD：NGS技术的发展极大的加速了人们对于肿瘤特别是血液系统肿瘤基因组学发病机制的研究进展。利用NGS技术优势，通过大规模的测序样本发现，AML中几乎所有的患者在诊断时均可检测到疾病相关的基因突变，平均为13个/患者，其中AML相关的重现性基因突变为5个/患者[8]。并且大部分基因突变与疾病的发生发展相关，可作为动态检测MRD的分子标志物。目前的髓系肿瘤可以考虑通过NGS的方法来检测MRD。
NGS可以一次性检测多种肿瘤相关的基因突变（NGS-panel）负荷的变化，同时可以综合评估肿瘤亚克隆、新发克隆以及克隆性造血的因素，因此与单个位点检测MRD的PCR技术比较，NGS-panel监测MRD更有优势。但普通NGS技术的灵敏度只有2%左右，因此近年来人们通过引入利用分子标签（UMI）减少PCR错误率的方法，使得NGS-MRD的灵敏度可高达0.1%。
2018年的AML ELN指南中提出建议用分子标签纠错的NGS panel方法进行MRD的监测[1]。2021年AML ELN指南[3]又对该方法学监测MRD进行了具体的建议，如血液肿瘤易感的一些胚系突变（ANKRD/CEBPA/DDX41/ETV6/GATA2/RUNX1/TP53）以及年龄相关的克隆性造血相关的基因突变（DNMT3A/TET2/ASXL1，(DTA)）不能作为MRD监测的分子标志物；不建议单独将信号通路相关的基因突变（FLT3-ITD/FLT3-TKD/KIT/RAS等）作为MRD监测的分子标志物，可以与其他分子标志物残留水平变化一起进行综合评估。此外，国内外多项研究结果表明，利用NGS方法进行MRD监测具有更好的临床相关性，并且与流式细胞学的方法具有互补协同作用，对患者的临床预后和治疗发挥更精准的指导作用[9-10]。
（3）NGS检测IG/TCR重排MRD：B（T）细胞在发育成熟过程中，IG（TCR）基因通过生理性的V（D）J片段重排和高度体细胞突变等过程[11]产生多达1012~1018种抗体，保证机体应对环境中多种抗原物质（见图1）。生理状态下，人体内的B（T）细胞表面的抗体基因重排呈多克隆状态，但几乎所有的B（T）细胞白血病/淋巴瘤患者体内的IG（TCR）基因重排呈现单克隆的状态，因此IG（TCR）基因体外单克隆重排检测可以作为对患者体内肿瘤细胞进行定性和定量分子标志，用来检测MRD，指导临床预后判断和进一步治疗方案的调整。
图1. B淋巴细胞发育过程中IGH基因重排和体细胞高度突变[11]
IG（TCR）可以分为可变区和恒定区，可变区为4个框架区（framework Regions，FR 1-4）和3个抗原的互补决定区（Complementarity-determining regions，CDR 1-3），其中CDR3是变异性最大的区域，也是识别和结合不同种类抗原的关键区域[12]。利用高通量测序的原理，通过高效的生物信息学分析方法，检测特定的CDR3区域碱基序列来判断和识别不同的克隆序列，用于后续治疗后的MRD追踪和监测，灵敏度可高达10-5~10-6，甚至高达10-7。
最早用来检测IG/TCR克隆性重排的技术是在一代测序基础上的毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）方法，但因该技术的灵敏度偏低（5%），且不能区分单个大小的峰下面的多个重排及区分片段大小一致而序列不同的克隆，不能有效区分测序错误和突变，不能监测疾病过程中的免疫组库的变化等，因此人们开始探索利用NGS技术进行IG/TCR免疫组库克隆性监测的方法。2018年美国食品药品监督管理局（FDA）批准了美国Adaptive Biotechnologies公司生产的ClonoSEQ用于急性淋巴细胞白血病（ALL）和多发性骨髓瘤（MM）患者的IG重排MRD检测，又于2020年8月6日批准其用于慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的IG重排MRD检测。FDA的这一举措认可了NGS IG/TCR免疫组库克隆性检测技术在临床中的重要意义，使得IG/TCR重排检测进入了NGS检测的时代。
目前国内外的多个专家共识和多个研究结果均肯定了NGS IG/TCR克隆性检测和MRD监测的临床指导意义。国际多发性骨髓瘤工作组（IMWG，International Myeloma Working Group）2016年制定的指南和中国多发性骨髓瘤诊治指南（2020年修订）中指出可以通过NGS方法检测IGH/K/L克隆性重排的方法进行MRD监测。中国儿童急性淋巴细胞白血病2018年版和中国成人急性淋巴细胞白血病诊断和治疗指南2021年版中指出，MRD评估方法中NGS基于IG/TCR重排的MRD监测是一种高度敏感的检测方法，适用于95%以上的病例，可以克服RT-PCR的某些局限性；同时NGS提供了治疗期间和治疗后的与预后相关的B/T细胞的信息，可用于分析免疫系统的多样性及免疫重建等。Michael等[13]的研究结果表明，在ALL中，高度灵敏度的NGS-MRD比常规的MFC-MRD阴性的结果更能够准确预测患者的复发风险和移植后的总体生存。2021年11月中国国家药品监督管理局药审中心发布的《多发性骨髓瘤药物临床试验中应用微小残留病的技术指导原则》中对NGS MRD监测方法的临床试验规范要求进行了详细说明，从而肯定了NGS MRD在临床试验中的重要指导作用。
但是ClonoSEQ产品试剂盒并未进入国内市场，目前国内应用较多的成品试剂盒为Lymphotrack。虽然Lymphotrack产品自带数据处理的自动化分析软件，可以达到一键处理数据的强大功能，大大减少了NGS时代下对生物信息专业人员的依赖性，但因该试剂盒的灵敏度偏低（约为10-5左右），因此国内多家自建体系的NGS方法都在不断的探索和完善中，灵敏度可达10-6甚至10-7。因该技术在临床的应用处于早期阶段，很多标准和数据解读还未形成规范化和统一化共识，具体的临床指导意义仍在不断的探索中。2019年欧洲NGS克隆工作组就NGS IG/TCR克隆性检测和MRD检测的实验检测和数据分析进行了多中心的结果比对和标准化的统一建议，大大促进了NGS IG/TCR检测在欧洲的发展和实验室应用[14]。我们相信随着数据和经验的不断积累，国内相关领域的专家学者也会就NGS IG/TCR克隆性检测和MRD监测达成一致共识，最大程度的发挥这种高精准度、高灵敏度的技术对临床患者预后、疗效评估、治疗的指导作用，改善患者的生存质量，改善患者的预后。
4. 其他监测技术应用：影像学/代谢组学：影像学在MRD中的监测主要体现在多发性骨髓瘤中。目前MRD监测常用的方法有MRI/PET-CT等。影像学监测MRD的特点在于可以一次评估全身的肿瘤残留的情况，对于及时发现肿瘤远处转移具有较大的优势。缺点在于敏感性偏低，近年来也有关于利用CD38单克隆抗体靶向多发性骨髓瘤细胞PET-CT用来更精准的监测MRD的报道[15]，但因于影像学检查的费用较高，限制了其在临床MRD中的广泛应用。其他的如利用代谢组学相关的技术检测循环蛋白片段作为MRD监测的生物标志物也在科研阶段。
三、MRD监测技术展望
随着更多高科技技术的迅速发展，越来越多的新技术从实验室走向临床，为临床带来切实的帮助，但应意识到目前应用的每项检测技术都不是完美的，都会有自己的优势和缺点，所以也都是不可替代的。如何对多个平台检测数据进行正确的注释，结合临床信息进行综合解读，更好的发挥临床指南的作用是目前MRD监测的一个难点，也是最重要的一点。2021年版ELN AML MRD共识中，首次提出“两种不同技术，检测结果一个MRD阳性和一个MRD阴性的患者，比两个MRD阴性的患者有更高的复发风险，但比两个MRD阳性患者的复发风险低”，这一概念给MRD综合检测指明了方向。相信在不久的将来，我们可以通过多种MRD检测工具，高效精准的帮助临床医生把握患者MRD的真实状况，提前预知复发风险，及时关注和干预，有效的改善患者的生存质量。
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