血清挥发性有机化合物在食管癌诊断中的临床价值

张义，医学博士、教授、博士研究生导师。现任山东大学齐鲁医院检验医学中心主任，生物标志物与人工智能应用山东省工程研究中心主任。现兼任中华医学会检验分会委员、中国医师协会检验分会委员、中国医学装备协会检验医学分会副会长、中国中西医结合学会检验分会常委、山东省免疫学会免疫技术及标准专业委员会主任委员、山东省医学会检验分会候任主任委员等。美国MD安德森癌症中心访问学者。主要研究方向为生物标志物的筛选、转化应用及机制研究。先后主持国家自然基金及省部级课题16项，第一/通讯作者发表相关研究论文50余篇，其中SCI收录30余篇，获教育部及山东省科技进步奖5项，国家发明专利7项，软件著作权2项。

【摘要】目的 探讨血清挥发性有机化合物(VOCs)在食管癌诊断中的临床应用价值。方法 收集山东大学齐鲁医院2022年3~6月食管癌患者血清标本20例，选择同期健康体检者20名作为对照组，采用气相色谱-离子迁移率光谱法（GC-IMS）对血清VOCs进行分析。结果 经PCA和无监督分层聚类分析显示，食管癌患者的VOC谱与健康体检者不同，并且可以观察到相应的聚类趋势。这与对照组相比，食管癌患者血清中2-ethyl hexanol浓度增高，而（E）-3-hexen-1-ol、Cyclohexanone、Butyl isobutyrate、Hexyl 2-methylbutyrate、Butyl 2-propenoate、2-Heptanone浓度降低。（E）-3-hexen-1-ol 、Cyclohexanone 、Butyl 2-propenoate诊断食管癌的AUC面积为＞0.8。结论 血清VOCs对食管癌的诊断具有较好的临床应用价值。

【关键词】食管癌；血清；挥发性有机化合物；生物标志物

食管癌是消化道系统最常见的恶性肿瘤之一，国际癌症研究机构制定的GLOBOCAN 2020统计数据显示，2020年全球估计有604,000例新发病例和544,000例食管癌相关病例死亡，总体死亡率位于癌症相关死亡原因的第6位[1]。同时世界上近50%的食管癌发生在我国，最新数据显示，食管癌在我国的发病率位居第6位，死亡率位居第5位[2]。虽然近年来有缓慢降低的趋势，但因食管癌对人类健康的危害性很大，总体的疾病负担依然很重。通过内镜检查，对于食管癌的早期诊断和治愈是可能的。但食管癌早期症状隐蔽，缺乏特异的临床特征，当患者因吞咽困难等不适进行内窥镜检查时往往已经错过了最佳治疗时机[3]，最终导致患者总体5年生存率在15%~25%[4]，因此，早期诊断对于提高患者的生存率至关重要。鉴于临床上对食管癌诊断缺乏有效的肿瘤标志物，寻找新型标志物成为当前研究的热点。

挥发性有机化合物（VOCs）作为人体代谢产物的重要组成部分，可以通过不同分泌物产生[5]，这些生成的VOCs可以通过气相色谱-质谱（GC-MS）、气相色谱-离子迁移率光谱法（GC-IMS）、电子鼻（E-Nose）甚至训练有素的嗅探犬来检测[6-8]。研究发现，肿瘤细胞与健康人群所产生的VOCs存在差异，因此探索癌症患者代谢物所产生的差异VOCs显得尤为关键，以此可以用作区分两组人群的诊断工具[9-10]。在本研究采用GC-IMS检测比较食管癌患者与对照组人群血清样本顶空瓶中的VOCs，探讨其作为食管癌诊断标志物的可行性，现将结果报道如下。

一、研究对象与方法

1. 研究对象：选取2022年3~6月山东大学齐鲁医院胸外科诊断为食管癌的患者20例作为研究组，年龄44~84岁，平均（52.5±7.03）岁。纳入的标准：（1）没有任何其他恶性肿瘤或抗癌治疗史的患者；（2）可提供新鲜血清样本和完整病历的患者；（3）接受根治性切除术并通过病理学检查为食管癌的患者。选择同期年龄相仿的健康体检者20名作为对照组，年龄46~78岁，平均（64.15±7.03）岁。对照组血常规、尿常规、血糖、血脂等生化指标正常，没有发现任何肿瘤及其他重大疾病。研究方案经山东大学齐鲁医院伦理委员会批准，并得到每位患者的知情同意。

2. 样品处理：所有受试者空腹抽取静脉血，血清均在4℃下以6000×g及12000×g分别离心10min，然后取上清等分并立即储存在于-80℃冰箱中。

3. 血清中挥发性有机化合物的分析：使用GC-IMS（G.A.S.Dortmund，Germany）检测胆汁样本中的VOC谱。所有样品均采用相同程序。首先将200μl血清置于每个顶空瓶中并在60℃下孵育10min。随后提取1000μl顶空瓶中的气体进行分析。以氮气为载体。IMS漂移气体始终保持在150ml/min，载气梯度如下：0min：2ml/min；1min：2ml/min；8min：100ml/min；10min：150ml/min；15min：150ml/min。其他主要参数如下：T1漂移管温度为45℃，T2气相色谱柱温度为80℃，T3进样口温度为80℃，T4连接线1为80℃，T5连接线2为45℃。每次分析一式三份进行。

4. 统计分析：软件R（x64 3.6.2）和软件包“ggord”用于主成分分析（PCA）。将每个VOC的水平用Mann-Whitney检验进行比较。在受试者工作特性（ROC）曲线上计算曲线下面积（AUC），使用MedCalc 9.3.9.0进行分析。

二、研究结果

1. 食管癌患者及对照组VOCs谱分析：以分子气相色谱保存指数表征VOC，根据信号峰强度测定和定量分子离子的迁移时间。在2D光谱图中选择VOC，每个点代表一个信号峰值（图1A）。图1A显示可直观地看到食管癌组样品和对照组样品之间VOC的差异。

注：红色代表食管癌组血清中物质浓度高于对照组，蓝色代表较低浓度。图1A为对照组和食管癌患者的2D频谱图，每个点代表一个信号峰值。（B）在对照组和食管癌患者的血清中检测到GC-IMS信号

图1. 血清挥发性有机化合物谱分析

2. 食管癌患者及对照组VOCs谱PCA及聚类分析：使用VOCal软件（v0.1.1）和GC-IMS库，根据所有患者的保留指数和迁移时间手动选择了52个VOC峰。这些物种（峰值）包括30种定义的物质和22种未知物质（图1B）。PCA生成的三维散点图表明，食管癌患者的VOC谱通常与对照组不同，并且可以观察到相应的聚类趋势（图2A和B）。无监督分层聚类分析显示，食管癌患者和对照组VOC存在差异（图2C）。这些数据表明，挥发性有机化合物具有作为食管癌诊断的生物标志物的潜力。

注：图2A为从PCA生成的对照组和食管癌患者中VOCs谱的三维散点图。图2B为从PCA生成的对照组和食管癌患者中VOCs谱的聚类趋势。图2C为对照组（NC）和食管癌（EC）患者GC-IMS挥发性有机化合物特征的热图

图2. 血清挥发性有机化合物谱分析

3. 挥发性有机化合物的定量分析：采用内标法根据VOCs的峰体积进行定量。使用浓度为100 ppm的4-甲基-2-戊醇20μl作为内标，将其加入到每个样品中。图3显示与对照组相比，在食管癌患者中鉴定出7种差异表达的VOCs，包括2-ethyl hexanol、( E)-3-hexen-1-ol、Cyclohexanone、Butyl isobutyrate、Hexyl 2-methylbutyrate、Butyl 2-propenoate、2-Heptanone。

注：2-ethyl hexanol（A）、（E）-3-hexen-1-ol（B）、Cyclohexanone（C）、Butyl isobutyrate（D）、Hexyl 2-methylbutyrate（E）、Butyl 2-propenoate（F）、2-Heptanone（G）。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001（Mann-Whitney检验）。数据表示中位数（四分位距）

图3. 差异挥发性有机化合物的定量分析

分析ROC曲线后发现，2-ethyl hexanol、（E）-3-hexen-1-ol、Cyclohexanone、Butyl isobutyrate、Hexyl 2-methylbutyrate、Butyl 2-propenoate、2-Heptanone在鉴别食管癌患者和对照组方面具有显著性，其中（E）-3-hexen-1-ol 、Cyclohexanone 、Butyl 2-propenoate 的AUC面积为> 0.8（表1及图4)。

表1. 各种VOC诊断的AUC、敏感度及特异度

图4. 差异VOCs的ROC曲线分析

三、分析与讨论

目前，食管癌的准确诊断仍面临着诸多挑战。本研究主要得出了以下几个结论：（1）在食管癌患者及健康人群中收集和检测VOCs是可行的。（2）食管癌患者与健康人群相比，某些血清VOCs的表达存在差异。（3）血清VOCs检测是筛查人群中食管癌患者的一种有前景的无创性诊断工具。

多项研究对呼气中的VOCs进行了分析，以筛选可靠的肿瘤标志物[11-13]。内源性VOCs是在体内通过代谢和疾病过程产生的。由于VOCs具有较高的蒸汽压，大量分子进入气态。这些VOCs扩散到血液中并被带到肺泡膜，再扩散到肺部[14]。分析呼气中VOCs的局限性在于可能会被食物、细菌和周围环境等外部来源改变[15]。血清因为其收集过程的密闭性，排除了外界干扰，并且含有高浓度的挥发性代谢物质,因此，血清顶空分析所检测出的差异VOCs更有可能代表疾病过程中内源性产生的VOCs，其中潜在的生物标志物有助于癌症的早期诊断。

在此之前，已有研究结果证明了GC-IMS在肿瘤诊断方面的可行性。我们团队已经证明胆汁中的VOCs有鉴别胆囊癌与良性胆道病变患者的潜力[16]。基于尿液VOC谱，GC-IMS和GC-TOF-MS方法均可以在膀胱癌、前列腺癌和非癌性样本之间建立相互依赖性[17]。Daulton等[18]采用气相色谱-离子迁移率光谱法（GC-IMS）测试了45例胰腺导管腺癌和33名健康人尿液的代谢组学后发现4种VOCs在这两组间的显著差异。Bannaga等利用GC-IMS和GC-TOF-MS分析尿液VOCs谱，结果显示可以很好的将肝细胞癌与非癌患者区分出来[19]。在本研究中，我们进行了初步分析，以评估GC-IMS在食管癌诊断中的使用。GC-IMS具有很强的复杂组分分离能力，离子迁移光谱的超高灵敏度可检测10-9的痕量挥发物。同时，与传统方法比较检测时间明显缩短，显著提高了检测操作的简单性、检测的时间和效率。

本研究中鉴定出7种与食管癌相关的特异性VOC分子，其中有些也被建议作为其他疾病潜在的生物标志物。其中2-ethyl-1-hexanol在肺癌[20]、结直肠癌[21]和前列腺癌[22]患者中检测到的VOCs与对照人群存在差异。另有研究发现，Cyclohexanone与结直肠癌[23]、乳腺癌[24]和肺癌[20]有关，但具体的VOC产生机制尚未明确。由于研究样本量很小，因此很难避免偏倚，应进行大样本量和多中心研究，以进一步证明现有数据。

目前，食管癌的诊断主要取决于疾病的临床表现、内镜及影像学检查，缺乏有效的肿瘤标志物进行筛查。本研究鉴定的挥发性有机化合物中，（E）-3-hexen-1-ol在食管癌诊断方面AUC曲线下面积达到0.923，敏感度和特异度分别为85%、95%。我们认为血清中的VOCs有潜力成为食管癌早期诊断的新型标志物。

综上所述，本研究为VOCs分析在食管癌中的应用提供了依据，使其可用于食管癌的早期诊断，具有极为广阔的应用前景。

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