循环肿瘤细胞（CTC）概述

肿瘤患者血液中存在少量循环肿瘤细胞以及由坏死癌细胞释放的少量循环肿瘤DNA。通过检测血液中的CTC和ctDNA对患者肿瘤进行诊断与监测的方法被称为液体活检。在临床实践中，获得肿瘤患者组织样本只有手术活检和穿刺活检两种。相比于传统的检测方法，液体活检该技术能够解决临床取样的难点，满足对患者高频监测的需求，并具有相比于穿刺活检成本低的优点，未来有望应用在肿瘤早期筛查、肿瘤患者动态监测、以及个性化用药指导等领域，市场前景广阔。

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是从主要的癌症肿瘤或转移的肿瘤上脱落下来进入到血液中循环的稀有细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。近年来，随着检测技术的不断改进，CTC检测作为一种新型的非侵入性诊断方式逐渐成为临床研究的热点，大量实验已经证实CTC检测有助于肿瘤的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗方案。

循环肿瘤DNA（ctDNA，Circulating Tumor DNA）是人体血液系统中带有的来自肿瘤基因组的DNA片段。主要来源为坏死的肿瘤细胞、凋亡的肿瘤细胞、循环肿瘤细胞、肿瘤细胞分泌的外排体。这些肿瘤DNA往往含有肿瘤基因组所特有的基因突变，因此也可以被用对患者肿瘤动态及治疗效果的评估，有助于医生制订精准医疗方案。

近几年CTCs在肿瘤诊断、治疗和监控等方面的临床表现逐渐崭露头角，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段，临床应用价值极其显著。与传统的影像学诊断、内窥镜检查以及病理学诊断相比，优势显著，可更加敏感地发现疾病的变化，更加科学、迅速的评价某一治疗方案的效果。此外，分离富集CTCs只需抽取患者少量外周血，对患者没有副作用，因此可以高频度的监测，达到实时监测疾病进展的目的。更为重要的是，CTCs可作为分析患者肿瘤生物学特征的实时样本，可以发现患者的实时生物学变化，并根据结果及时调整治疗方案，实现实时的个体化治疗。

在过去的十年中，新兴的CTC分离技术吸引了科学界和生物技术产业界的极大关注。按照分离机制不同，这些方法可以归类为：

市场上已有多种应用这种原理的检测设备，如CellSearch系统、CTC-Chip、免疫磁性细胞分选仪（MACS）、RARE Cell、AdnaTest癌细胞检测系统，以及CellRich循环肿瘤细胞检测系统等。这种技术集合了免疫磁珠分选技术和免疫细胞化学法的分离检测技术。其主要原理是利用偶联了EpCAM（上皮细胞粘附因子）抗体的磁颗粒与肿瘤细胞表面的抗原相结合，然后结合荧光染料的抗-CD45和抗细胞角蛋白（CK8/18/19），最后采用DAPI染色来鉴定细胞核，EpCAM（+）CK（+）DAPI（+）CD45（-）的细胞被界定为CTC并进行计数。

CellRich循环肿瘤细胞检测系统，采用免疫纳米磁颗粒并结合先进的微流体芯片设计专利技术对微量细胞进行捕获和分析，是一种先进的循环肿瘤细胞检测与分析平台。通过将循环肿瘤细胞上的特异抗原与纳米磁颗粒上的特异性抗体相结合，借助微流控专利技术使得含有肿瘤细胞的生物样本通过梯度磁场，从而将循环肿瘤细胞从血液或其他背景液中筛选出来。

CTC的精准捕获以及生物活性保持是当前面临的重大难题。CellRich采用微芯片技术的免疫磁化检测分离系统在固定模式下已经成功用于CTCs的检测。自动系统在乳腺癌，前列腺癌和肺癌患者中获得高捕获效率而且样品流量大。采用磁流体标记表面结合了EpCAM抗体的CTCs,在筛选过程中，纳米粒子标记的CTCs悬浮在全血样品中被泵入芯片并在通道基板上被抓获。其他细胞，如红细胞（RBCs）和白细胞（WBCs）等阴性细胞不受磁场作用收集到终端废物注射器内，依然留在通道基板上的CTCs将进行免疫荧光染色以及进一步显微镜观察/鉴定，使用该系统在患者样品中抓获的CTCs对临床很有帮助，这在临床上可能很重要。该系统的优势为采用细胞沉降和控制流动程序保持来系统一直处于最佳的工作状态。

采用免疫磁化检测法分离出来的CTCs依然保持其生物活性可用于细胞培养。采用该设备从老鼠转移性乳腺癌M6C细胞中抽样检测结果显示较好的分离效率（87％）。收集到的CTCs和红细胞一起经过裂解RBC之后进行进一步分子生物学鉴定（RT-PCR）。为满足各种临床需要样品处理平台可以根据临床标本量的大小，多种不同类型的CTCs以及不同生物分子标记等进行调节。  

这种方法是基于CTCs与大部分血细胞存在明显的尺寸差别以及CTCs较正常血细胞不容易变形。研究表明运用8微米的滤孔分离CTCs效果最佳。富集到的CTCs可再通过光学染色或免疫染色（免疫荧光或免疫细胞化学）从形态学特征或分子特征等方面来确认肿瘤细胞。ISET优势在于不依赖CTCs的表面抗原，不破坏CTCs的形态，保持了CTCs的活性，有利于利于后续对单个CTC进行形态学、免疫细胞学及遗传学特征的研究，而且这种方法的整个过程易于操作和控制，只是这种方法可能会漏检某些直径较小的CTCs。

CTCs的某些基因或表达的mRNA不存在于正常的血细胞中，可通过对这些DNA或RNA的检测来判断CTCs的存在。这种RT-PCR的方法非常灵敏，可分析极微量RNA，然而因为该技术是以信号放大为基础的，稍有污染就容易造成假阳性的结果出现，目前，其在临床应用中最大的限制就是，缺乏特别明确的特异性标志物，发现明确的肿瘤细胞特异性mRNA对于促进CTCs检测的特异性及准确性至关重要。

目前，尽管CTCs检测分离的技术很多，但是不同实验室之间没有统一的标准和依据，同时不同检测方法敏感性和特异性不同，这在一定程度上限制了循环肿瘤细胞应用于临床，但是已经完成及正在进行的大量研究已经显示出CTCs在临床上具有很大的应用价值。

目前，CTCs在临床上的应用主要包括以下几个方面：

研究发现在部分早期的肿瘤患者中，利用影像学还未发现病灶时已经可以在外周血中检测到CTCs，因此CTCs可以用于肿瘤的早期诊断，2007年ASCO就将CTCs纳入了肿瘤标志物。血液系统是肿瘤转移的重要途径，是否发生远处转移是判断临床分期的标准之一。近年来，CTCs检测在临床上的应用使之成为了TNM传统分期系统的有效补充，从而指导下一步的治疗。

目前研究已经证实血液中检测到CTCs可以作为乳腺癌、前列腺癌和结肠癌等肿瘤的独立预后因素。CTCs监测数目越高，提示患者预后较差。在转移性乳腺癌患者接受系统治疗之前，每7.5 ml血液中CTC计数超过5个，提示更短的无进展生存时间和总生存时间。在转移性结肠癌患者中，每7.5 ml血液中CTC计数超过3个，患者中位总存活期和无进展存活期都明显缩短。与传统的影像学方法相比，CTC计数能更早的反映患者的疾病状态及判断疾病预后，更能准确的预测患者的总体生存时间。

目前肿瘤治疗的方式越来越多，如何评估患者的治疗效果显得尤为重要，研究表明患者在治疗前后CTC的数量的变化与标准的疗效评价体系有很好的对应关系。在肿瘤治疗过程中，通过动态监测CTCs数目变化，能够更加准确评估肿瘤治疗的效果。

CTCs作为“液体活检”弥补了临床上获取患者肿瘤组织的不足，临床专家可以通过外周血富集分离CTCs，甚至可以在体外进行CTCs的培养，分析CTCs的分子表观遗传学特征，进行CTCs一系列的基因检测，筛选出适合患者的化疗和靶向药物，以期进一步指导个体化治疗。

此外，CTCs也有助于研究人员更加清楚地理解肿瘤发展、复发、转移的分子机制以及肿瘤干细胞在EMT、肿瘤转移、耐药性方面所起的作用，对于指导抗肿瘤药物的研发也有很大的意义。

尽管目前在CTCs研究方面已经取得了很大的进展，但是多种检测与分离方法在临床上的顺利实施仍然是今后待解决的问题，每种检测技术的结果并不一致，这就要求尽快制定行业的标准。同时可以结合体外动态检测系统、体内血液中残留基因分型的循环肿瘤DNA来加强CTCs的检测及对肿瘤进展的连续检测。相信在不久的将来CTCs一定会成为肿瘤治疗中一项常用的检测指标来指导患者实施个体化治疗。