循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA 作为液体活组织切片的临床应用

摘要

由于非常适合个性化医疗的临床应用，侧重于癌症患者血液内循环肿瘤细胞（CTC）和循环无细胞肿瘤DNA（ctDNA）分析的“液体活组织切片”已经得到了广泛的重视。CTCs和ctDNA的分析已经为新的诊断模式铺平了道路，到目前为止，已经打下了液体活组织切片诊断的坚实基础。这篇文章着重总结了CTCs和ctDNA临床应用的关键领域，包括癌症检测、患有可治愈疾病患者的预后预测、全身疗法监测和基于治疗目标或耐受性机制检测的患者分层。

意义：CTCs和ctDNA在早期癌症检测中的应用受到了大众的广泛关注，但是这种方法面临着现有试验存在特异性和灵敏度问题等诸多挑战。在一些肿瘤实体尤其是乳腺癌中已经可以对患有可治愈疾病的患者进行预后预测。通过连续进行CTCs或ctDNA测量也可以对全身疗法（例如：化疗、激素疗法或其他靶向疗法）的成功与失败进行监测。需要对基于CTCs和ctDNA分析的治疗分层进行介入性研究来在个性化医疗中实施液体活组织切片。

引言

原发肿瘤（例如乳腺、结肠、肺或前列腺肿瘤）形成和生长的早期，肿瘤细胞释放到血流中。可以利用这些肿瘤的物理和生物学特性，通过不同技术富集并检测这些循环肿瘤细胞（CTC）。可以考虑将CTC分析作为癌症患者的实时“液体活组织切片”。最近，凋亡或坏死肿瘤细胞释放的ctDNA分析已经采用了“液体活组织切片”这一术语。灵敏的分子试验的发展已经可以让研究者们筛查血液中特殊肿瘤畸变产生的ctDNA，因此，ctDNA和CTC已经成为有竞争力的生物标志物。但是我们认为，从CTCs和ctDNA两个来源获得的信息，是互不相同并具有互补性的，而且取决于使用的环境。

CTCs

肿瘤细胞从原发肿瘤和/或转移位点释放到血流中。CTCs存在于血流中的时间很短（半衰期：1-2.4小时；CTCs释放到血流中是一个随机过程还是可以通过特殊生物学程序预先测定仍存在争议。但是，对于上皮细胞瘤而言，血流环境是极其严酷的，很有可能CTCs会经历强大的选择过程。这与观测到的癌症患者外周血中经常会发现凋亡CTCs或片段化CTCs这一事实相一致。存活CTCs的清除通过外渗到附属器官发生。例如结肠直肠癌患者中，肠系膜和外周静脉的CTCs对比分析显示肝脏会捕获原发癌释放的肿瘤细胞，这与该实验大量的动物数据相一致。由于肿瘤细胞扩散到远端器官位点需要通过脉管系统经历危险的旅程，所以它们与活化血小板和巨噬细胞的密切关系起到了促进作用。因此该肿瘤细胞生成能粘附到内皮细胞的异质聚合物来进行转移。不仅如此，血液循环中转移细胞的迁移通常依靠包括CXCR4、CCR4、CCR7和CCR9在内的渐变趋化因子，引导肿瘤细胞通过脉管系统。

在原发肿瘤切除后数月或数年后，患者体内检出CTCs，这表明肿瘤细胞可以从附属转移位点再次进入血流循环。CTCs是否能帮助以及如何帮助癌细胞转移扩散和进展仍然不清楚。先前小鼠模型的研究结果表明肿瘤细胞可以再循环回到原发位点，这个过程称为“肿瘤自播”。据现有知识所知，没有直接的证据证明癌症患者也发生了类似现象；但是要注意乳腺癌患者骨髓中播散的肿瘤细胞（DTC）的检测不仅与癌细胞转移复发有关还和潜在更具侵袭性的癌细胞转移变异有关。未来将相同患者的CTCs和DTC以及原发和转移病灶进行基因组比较分析可能会得到更深刻的理解。

在过去的十年中，现有大部分实验已经可以利用EPCAM和周围间质血细胞未表达细胞角蛋白这样的上皮标志物检测CTCs。但是，上皮细胞会经历导致上皮标志物表达减少、迁移和侵染能力和可塑性升高、失巢凋亡抗性增强的上皮-间质细胞转化（EMT），这标志着CTC存活和扩散。先前已经表明这种转化尤其可能通过类干细胞特征影响肿瘤细胞。因此，可以设想CTCs中明显转移的生成细胞（即“转移性干细胞”）减少了上皮标志物的表达。但是，当前的观点是部分发生EMT的肿瘤细胞，也称为“中间表型”，可能具有最强的可塑性适应现有附属位点环境。这一观点得到了Cayrefourcq和同行的支持，支持者证明在结肠癌患者身上建立第一个结肠CTC系后，结肠CTCs出现强烈EPCAM表达，具有SNAIL、ALDH1和 CD133表达细胞角蛋白同时也出现了表达。不仅如此，Baccelli及其同事表明将乳腺癌患者的CTCs移植到免疫缺陷小鼠身上时，小鼠表达出数量可以检测的EPCAM和与CD44、CD47相近的细胞角蛋白以及MET肿瘤蛋白。

ctDNA

肿瘤DNA可以由原发肿瘤、CTCs、微小转移或明显转移释放到癌症患者的血液内。这些ctDNA的大部分来自凋亡和坏死的肿瘤细胞，这些细胞会将片段化DNA释放到血液循环内。最近的研究表明有活性的肿瘤细胞会释放包含双链DNA的微泡（外来体），但是该说法仍存在争议。死亡的良性宿主细胞也会释放无细胞DNA（cfDNA），正常的cfDNA会稀释癌症患者体内的ctDNA，尤其是采用手术、化疗或放疗这些组织损伤疗法时。DNA的片段长度可能提供一些cfDNA来源的信息，但是我们仍需要知道更多关于ctDNA释放到血液循环中的生物学知识。不仅如此，我们也不能完全理解cfDNA的清除。cfDNA的半衰期仅为16分钟，肝脏和肾脏会将其清除。肾功能不全影响cfDNA的清除，这可能是一些癌症患者ctDNA浓度调节的混杂因素。

一些报告指出宿主细胞甚至可以吸收ctDNA，这样的摄取影响这些细胞的生物学。癌症患者会不会发生“基因组转移”仍是未来研究的项目。Trejo-Becerril及其同事的报告称观测到了cfDNA具有诱导体外细胞转化的能力，通过使用结肠癌患者的血清和SW480人体癌细胞上清液处理NIH3T3小鼠细胞诱导肿瘤发生。如果血清和上清液去除DNA，则细胞转化和受体细胞肿瘤不会发生，这就支持了如果癌症细胞将具有生物学活性的DNA传播到血液循环内，将促进肿瘤的进展的假设。因此，可以将ctDNA作为抗肿瘤疗法的新目标研究，研究目标为消除这种“致癌DNA”，该想法发表已经有数十年之久了。

CTCs

最近多种CTCs富集和检测设备的开发有了进展，包括新型CTC标志物的发现和确认。值得注意的是CTC侧重于肿瘤扩散生物学，尤其是EMT通过潜在类干细胞特性影响肿瘤细胞。因此，许多经过类型优化的新设备用于出现EMT的CTCs的选择和检测。

最近，CTC试验通常以通过对数单位提高CTCs浓度富集的步骤开始，让单个肿瘤细胞的检测更容易。接着，就可以用不同的方法检测CTC。原则上，可以在生物学特性的基础上阳性或阴性富集CTCs（即蛋白质标志物表达）或基于物理学特性（也就是尺寸、密度、可变型性和电荷）进行富集。在同一设备中结合物理和生物学特性亦可达到阳性和隐形富集CTC的目的。接着，可以使用免疫、分子和功能性试验检测CTCs。过去，许多研究团队侧重使用CTC培养/细胞系和移植的功能性试验。这些体外或体内模型可用于检测药物易感性。但是，出于个性化医疗的目的，需要加强CTC培养和移植的效果。目前，数以千计的CTCs需要建立细胞系或移植，少数疾病晚期患者使用该方法受到了限制。

基于CTC的生物学发现专注于新技术开发已经延缓了将CTCs引入临床诊断的进程。但是，对CTCs新的重要理解结合了多种革命性技术，结合了富集、检测和CTCs特性描述的新技术平台即将出现。

ctDNA

已经开发了高灵敏度和高特异性方法来检测ctDNA，包括BEAMing Safe-SeqS、TamSeq和数字PCR来检测ctDNA单核苷突变或进行全基因组测序确认拷贝数变化。原则上，技术可以分为以检测预定义基因组合突变（抗体阻断EGFR条件下的KRAS）为目标的靶向技术，以及以筛查基因组和发现新基因组畸变为目的的非靶向技术，如包括哪些参照特殊靶向疗法耐受性的方法。这些技术的优势和局限性最近已经经过讨论。总的来说，尽管付出了巨大的努力改进检测限，但是靶向方法还是比非靶向方法分析灵敏度高，最近，能检测正常cfDNA“海洋”中最少量ctDNA的超敏技术已经出现，这癌症早期检测和微小残留病检测非常需要这样的技术。

癌症的筛查研究通常以将癌症患者与对照组（健康个体或良性疾病患者）相比较开始。后续群体研究任务繁重，需要大量研究人群并延长随访时间。侧重于癌症发展高风险患者[慢性阻塞性肺病（COPD）]是一个加速确认过程的绝佳策略。

CTCs

Ilie及其同事的报告称可以在无临床可检测肺癌的COPD患者中检测到CTCs。该研究包括168（68.6%）名COPD患者和77（31.4%）名无COPD受试者，包括42名对照吸烟者和35名非吸烟健康个体。每年通过低剂量螺旋CT监测COPD患者。在3%的COPD患者（5/168）中检测CTCs。CTC检测后1-4年内，每年通过CT扫描筛查检测肺结节，对CTC 阳性COPD患者进行监测，观察患者病情是否恶化继而需要外科手术或早期肺癌组织病理学诊断，但是对照组吸烟个体和非吸烟健康个体没有检出CTCs。有趣的是，检出CTCs的COPD患者呈现出不同的上皮和间质标志物表达。这些初步发现需要在更大的人群中确认，需要鉴别可能导致非癌症人群中非特异性发现的来源如上皮细胞释放到炎症性肠病患者的血液中。

ctDNA

监测ctDNA进行癌症检测得到了极大关注。其中最大的技术挑战是在cfDNA含量多变的血液样品中鉴别微量ctDNA以及特殊癌症基因组畸变检测卡的选择。最忌，John Hopkins团队在640名多种癌症类型患者中，使用数字聚合酶链反应技术评估了ctDNA检测肿瘤的能力。仅在48%-73%的局限性癌症患者中鉴别出了ctDNA，这些癌症包括结肠直肠癌、胃食管癌、胰腺癌和乳腺癌。尽管很显著，但是这些检测率不能满足早期癌症检测的要求。ctDNA经常在患者不能检出CTCs的情况下出现。但是未富集的CTCs可在庞大的白血球背景中简单地使用血液微球测定，这是一项现代CTC诊断很少使用的低灵敏度方法。

目前，许多团队在更灵敏的ctDNA技术方面展开激烈角逐。例如，Maximilian Diehn团队已经开发出称为“癌症个体化深度测序分析方法（CAPP-Seq）”的新技术。CAPP-Seq是对非小细胞肺癌（NSCLC）实施的，其设计涵盖多种体细胞变异，能鉴别>95%肿瘤的突变，对突变等位基因分数低至约0.02%的特异性达到96%。尽管可在大部分II-IV期疾病患者体内检测到ctDNA，但仅鉴别出50%的早期（I期）NSCLC患者。测得I期肿瘤患者体内cfDNA中ctDNA的丰度大约比疾病更晚期的患者低10倍。出现近10倍的差别并不意外，这种现象在其他肿瘤实体中可能也会观测到。因此，未来需要对技术进行改进，这些改进包括分析较大血量的能力，改进后的灵敏度需要达到能胜任早期癌症检测。

除了灵敏度，结果的特异性也面临着一些额外挑战。个体随着年龄的增长，甚至终生都不会发展为癌症的个体都会出现癌症相关突变。例如10%的65岁以上人群中观测到了具有体细胞突变的克隆造血作用，这种作用是以后出现血液癌症的强大风险因素。但是，从克隆造血作用转化为血液癌症的绝对几率并不高（每年1.0%）。因此，检测cfDNA上的癌症相关突变可能不能表明已检测个体患有癌症或将在其余生中发展为癌症，但是这会产生焦虑和大量有副作用如辐射的诊断程序。

CTCs

大量的研究显示了多种类型实体瘤尤其是乳腺癌患者的CTCs具有预后意义。在这里我们侧重于患有早期疾病但无临床特征或明显远端转移放射特征的患者[肿瘤-结节-转移（TNM）阶段M0]。有趣的是，2010 TNM分类已经包括了新的阶段—cM0（i+），“i+”指的是血液、骨髓和淋巴单个肿瘤检测。但是，这一分类在临床实践中很少使用，部分原因是M0患者的CTC计数非常低，增加了其作为有用可靠标志物的疑虑。但是，越来越多的证据表明M0患者手术前和手术后CTC计数测定是不利预后的可靠指标。

Rack及其同事最近发表了迄今为止最大规模的多中心研究结果。研究分析了2026名辅助化疗前早期乳腺癌患者和1492名使用CellSearch系统的化疗后患者的CTCs。21.5%的患者检出了CTCs，19.6%的结节-阴性和22.4%结节阳性患者显示出具有CTCs（P<0.001）。CTCs的存在与较差的无病存活率（DFS：P<0.001），特殊乳腺癌存活率（p=0.008）和总存活（OS；P=0.0002）有关。多变量分析已经确认CTCs为独立的预后标志物。每30mL血液含有至少5个CTCs的患者预后最差（DFS：HR=4.51）。化疗后，22.1%的患者呈现CTC阳性，CTCs的持续存在对预后产生不利影响。因此，辅助化疗前后的CTC检测与原发乳腺癌风险升高存在关联性。

前列腺癌分析中，新诊断但无明显转移的未选择群组患者预后良好，这需要10年或以上时间进行长期随访评估。为了避免这一问题，一些群组侧重于高Gleason评分或高前列腺特异抗原（PSA）血清水平的高风险患者。Loh及其同事使用CellSearch系统进行了分析了CTCs并发现仅有一小部分高风险患者出现了CTCs。Thalgott及其同事评估了接受新辅助化疗/激素疗法和根治性前列腺切除术的高风险患者并发现切除术后持续出现CTCs的患者出现了生物化学复发现象。

有前景的研究证明CTC技术与转移复发存在显著关联，已经在其他肿瘤实体如结肠直肠癌、膀胱癌、肝癌和食管癌中观察到了这一现象。总之，需要在更大的群体内使用更灵敏的CTC试验进行分析进一步探索局部癌症患者中CTCs的临床相关性。尤其是，手术和复发期间的纵向血液分析似乎能发现微小残留病的动力学，对癌症休眠生物学产生价值的理解。

ctDNA

一项令人激动的挑战是从ctDNA高载量晚期患者转到使用有效方法治疗的早期患者。在辅助疗法发挥临界效果的按病理学进行分期的人群中或者目前尚无辅助疗法的低风险人群的癌症类型中，前景是靶定具有可检测ctDNA（或CTCs）的患者，将其补充到试验中确定使用辅助疗法介入的受益情况，这与等待出现明显转移截然相反。这可能扩大辅助疗法的受益面，与按照现有标准仅在已经准备接受辅助疗法的人群中进行实用性监测的做法截然相反。当然，需要进行随机对照试验证明其实用性，但是这仅仅是液体活组织切片测量最有效的使用环境之一。

在成对ctDNA和原发乳腺癌样品中，Shaw及其同事鉴别出了聚集在大量染色体臂中的局部高水平DNA扩增。其中一些受保护的基因如USP17L2（DUB3）、BRF1、MTA1和JAG2具有潜在致癌性。诊断之后12年，一些随访血浆样品中仍然可以检测到这些扩增，表明存在“隐蔽”微转移疾病。雌激素受体（ER）阳性乳腺癌中，PIK3CA突变是常见的基因组改变。应用数字PCR试验，Oshiro及其同事检测出23%的PIK3CA突变患者的血清样品该突变呈阳性。突变体PIK3CA ctDNA突变状态是乳腺癌患者显著而独立的预后因子。

Reinert及其同事的术后监测研究中，从6名复发患者和5名非复发结肠直肠癌患者身上采集了151份血浆样品，使用液滴数字PCR进行ctDNA量化。与传统随访相比，可以提前几个月检测复发。最近，Tie及其同事利用ctDNA分析评估肿瘤负荷并预测早期结肠直肠癌患者对标准化疗的疗效反应。通过对结肠直肠癌频繁发生变异的15个基因进行测序，报告强调了血液中突变水平预测疗法反应的机制。

CTCs

CTCs研究提供了大量蛋白质、RNA和基因组层面上的关于治疗目标和耐受性机制的信息。

蛋白质层面

ER是乳腺癌的关键目标，根据分析的片段中免疫染色细胞1%临界值，原发肿瘤被分为ER阳性和ER阴性，根据该结果也能对激素疗法进行分层。但是，ER阳性乳腺肿瘤可能含有ER阴性CTCs，这会让其逃脱内分泌疗法的治疗。最近，Paoletti及其同事开发了一种多参数CTC内分泌疗法指数（CTC-ETI），该指数能预测HR阳性转移乳腺癌患者对内分泌疗法的耐受性。CTC-ETI将数量和4个标志物ER、BCL2、HER2和Ki67的CTC表达相结合。CTC-ETI的临床应用正在接受前瞻性试验的评估。

另一个目标HER2致癌基因会在大约20%的原发癌中扩增或过表达，这使其成为乳腺癌的关键目标。越来越多的证据表明，与多达30%的原发肿瘤病例对比，明显远端转移和CTCs的HER2状态并不相同。尤其是HER2阴性原发肿瘤患者身体中存在HER2阳性CTCs的现象已经促使了多中心试验的出现，该试验旨在研究这些患者是否会因HER2靶向疗法受益。

最近，免疫检查点调节因子如PD-L1已经成为令人兴奋的新疗法目标，该方法能让晚期恶性肿瘤患者出现长期持续性缓解。但是，鉴于这些疗法耗费巨大、毒副作用严重，急需能够区分疗法反应者和非反应者的预测性标志物。Mazel及其同事首先提供证据表明PD-L1在激素受体阳性、HER2阴性乳腺癌患者中频繁表达（>60%患者）。PD-L1表达的免疫对CTCs亚群进行了分类。现有ETC/PD-L1试验可以用于未来接受免疫检查点阻断患者的液体活组织切片临床试验。

前列腺癌PSA和前列腺特异性膜抗原（PSMA）水平在雄性激素受体（AR）活化和AR抑制后分别出现升高。Miyamoto及其同事的一项有意思的报告指出CTCs中PSA/PSMA测量可以替代AR 信号测量，该信息可能有助于预测AR疗法的治疗效果。

RNA层面：信使核糖核酸（mRNA）和微小核糖核酸（microRNA）

一些研究小组已经开发了CTCs特异靶向基因或特征mRNA表达RT-PCR分析协议。近来，侧重前列腺癌的研究证明CTCs mRNA分析能揭示灵敏度和耐药性方面的大量信息。大多数激素依赖前列腺癌在治疗1-3年后对药物产生耐药性，尽管采用了激素疗法，但肿瘤重新开始生长。尽管采用了化学去势疗法，还是得通过疾病进展定义去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。最近出现了一些药物用于CRPC的治疗（例如恩杂鲁胺或阿比特龙）。但是，一定比例的人群不能从这些药物中受益。对药物耐药性机制的更清楚的理解将有助于这些患者的替代药物的选择。最近的研究表明ARv7 mRNA 的表达截断了缺乏配体结合域的AR的形成，但其仍具有活性，CTCs能预测使用恩杂鲁胺和阿比特龙的抗性激素疗法的失效。ARv7阳性患者会保持对紫杉烷的灵敏度，ARv7因此成为转移CPRC治疗标志物的选择。除了ARv7，最近通过转移CRPC CTCsRNA测序发现了额外的耐药性机制，测序具有单一CTCs表达分析的潜在能力。

MicroRNA（miRNA）是基因表达的关键调节因素，具有作为抗癌疗法重要诊断标志物和目标的潜力。最近，Gasch及其同事开发了一种稳健的原位分子杂交（ISH）协议，与CellSearch CTC检测系统合并能够对miR-10b这样的重要miRNA进行逐小区临床研究。在原理验证研究中，该方法用于证明乳腺癌、前列腺癌或结肠直肠癌患者CTC之间miR-10b的异质性。

DNA层面

基因编码治疗目标或目标信号蛋白质下游的突变能影响靶向药物的治疗效果。例如，EGFR的突变影响肺癌抗EGFR疗法，KRAS突变—一种EGFR蛋白质下游突变—阻断结肠直肠癌抗EGFR疗效的效果。最近，从结肠直肠癌患者体内获取的数千个CTCs的分析结果揭示KRAS患者内和患者间的异质性。具有KRA基因突变的CTCs将逃脱抗EGFR疗法，其早期检测有助于个别患者的疗法指导。

CRPC患者CTC富集外周血样品中鉴别出了前列腺癌基因编码AR的突变。AR扩增能让肿瘤细胞从接受药物诱导去势疗法患者体内大量残余雄心激素中受益，AR突变能让肿瘤细胞对雄心激素阻断产生耐性。

HER2靶向疗法耐受性是乳腺癌的关键问题，PI3K通路的活化—PI3CA基因突变，在这一过程中发挥关键作用。Schneck及其同事使用SNaPshot方法分析了CTCs并发现从15.9%的转移乳腺癌患者中富集的CTC中出现了PIK3CA突变。其他研究者分离了单个CTCs，并报告称单独患者CTCs中的PIK3CA突变状态具有很强的异质性，但是仍迫切需要更多当前疗法研究环境中出现的突变信息。

尽管大多数患者仍会迅速出现耐受性，但是黑素瘤靶向疗法糟糕的转移癌预后已经开始出现起色。BRAF已经成为特殊抑制剂疗法的主要目标，BRAF基因中的突变是疗法灵敏度的重要预测因素。最近，已经在CTCs和ctDNA中检测出BRAF突变的动态变化，这在将来能指导BRAF导向疗法。

结肠直肠癌治疗中，Heitzer及其同事也通过对68个结肠直肠癌相关基因大量平行测序执行了CTCs药物可控突变筛查。在相应的CTCs中也检测出原发肿瘤和转移部位发现的已知癌症依赖驱动基因的突变（例如APF、KRAS或PIK3CA）。有意思的是，一些CTCs揭示出高水平CDK8扩增，其可以作为CDK抑制剂的新型潜在治疗目标。

总之，这些研究证明DNA、RNA和蛋白质层面的CTC分析可能对未来产生重要影响，有助于对癌症患者疗法的耐受性机制形成更深刻的理解。

ctDNA

治疗目标通常蛋白质，但是ctDNA分析能揭示如肺癌EGFR基因突变、结肠直肠癌KRAS基因突变、乳腺癌TP53和PIK3CA这些影响靶向药物效价的基因组畸变的重要信息。我们将在下文中讨论这些ctDNA分析，其中大多数已经用于癌症患者的监测。

CTCs

化疗监测CTC定量（CellSearch方法）的临床确认已经在转移乳腺癌患者中通过单独患者数据分析得到了评估。这一具有里程碑意义的分析建立在17个国际研究中心的20项研究中1944名合格患者提供数据的基础上。引人注目的是，在引入全临床病理预测模型后，CTC计数改进了转移乳腺癌的预测，尽管这些血清标志物经常用于临床实践，但是血清肿瘤标志物并未得到改进。

同样，Scher及其同事在先前使用多西他赛治疗的转移CRPC患者中使用醋酸阿比特龙加强的松或单独使用强的松进行COU-AA-301跨国随机双盲III期试验的背景下，评估了CTC计数（通过CellSearch评估）是否能成为转移CRPC患者存活率检测的个体水平替代指标。在基准、第4、第8和第12周测量该生物标志物，12周测量是主要的衡量标准。研究显示包含CTC计数和LDH水平的生物标志物可以作为个别患者存活率水平的测量替代品，但是常用于临床实践评估治疗效果的PSA血清水平的变化却没有相关性。

ctDNA

结肠直肠癌中，EGFR特异抗体获得性耐药与RAS通路突变的出现有关，这些在疾病恶化前通过ctDNA检测出来的突变可以被标准图像记录下来。有趣的是，对EGFR抗体产生耐药性的结肠直肠癌患者显示出KRAS、NRAS、BRAF和EGFR多种突变模式。ctDNA可以用于跟踪克隆进化和靶向药物反应。值得注意的是，KRAS突变等位基因比例在存在抗EGFR药物时动态增加，不存在抗EGFR药物时动态减少。使用相同的方法，Mohan及其同事在使用抗EGFR疗法治疗的结肠直肠癌患者中对ctDNA进行了全基因组测序，发现了全部样品中一些拷贝数的变化，这些变化包括含有APC基因的染色体5q22区缺失，染色体臂17p和18p缺失，还发现涉及EGFR阻断耐药的已知基因扩增，如MET、ERBB2和KRAS。因此，这些研究表明ctDNA分析可以检测出靶向疗法期间的克隆进化。

Bettegowda及其同事通过乳腺癌全基因组测序在75%的晚期癌症患者以及50%的乳腺癌患者体内检出了ctDNA。此外，Dawson及其同事在对转移乳腺癌患者进行连续采样获得的血浆中鉴别出了体细胞基因组胞性改变。大部分鉴别出体细胞胞性改变的乳腺癌患者检出了肿瘤相关cfDNA。CellSearch系统检测的ctDNA水平的动态范围比CA15-3或CTCs广，与肿瘤负荷相关变化的关系比CA15-3或CTCs强。但是，ctDNA的中断率值得注意而且分析仅限于较小的患者人群。最近，Madic及其同事在三阴乳腺癌患者中执行了另一项CTCs和ctDNA比较评估。超过80%的肿瘤和ctDNA样品中发现了TP53突变。使用CellSearch系统检测出来的CTC技术与总体存活率有关，然而ctDNA水平没有预后影响。Murtaza及其同事也跟踪了对疗法有反应的转移乳腺癌患者的ctDNA基因组评估，并证明ctDNA突变水平与获得药物耐药性之间关系增强，这包括紫杉醇治疗后PIk3CA中突变活化；三苯氧胺和曲妥单抗治疗后ER辅激活物中介复合物亚组1（MED1）内截断突变；以及后续拉帕替尼治疗后，GAS6出现剪接突变，酪氨酸蛋白激酶受体AXL配体出现。总之，这些令人兴奋的原理验证研究需要在更大的群体中使用更现代的CTC试验进行进一步确认。

前列腺癌中研究明显侧重与抗性激素疗法耐受性有关的畸变。Heitzer及其同事开始展示转移前列腺癌患者ctDNA全基因组分析的可能性ctDNA的全基因组图谱揭示了多倍拷贝数畸变，包括先前前列腺肿瘤中报告过的8p缺失和8q增长。在CRPC患者中观测到了AR基因座出现高水平拷贝数。最近，Aazd及其同事发现使用恩杂鲁胺治疗的患者中的AR扩增普遍性显著高于使用阿比特龙和其他药物治疗的患者。除了AR基因扩增，Joseph及其同事的研究显示在使用ARN-509治疗出现疾病进展的CRPC患者中可检出AR F876L突变体—AR配体结合域错义突变，这表明该突变的可选择性外生长可能与可使用下一代抗雄激素靶定的第二代抗雄激素的耐药性有关。使用相同的方法，Romanel及其同事开发了一种经得起血浆DNA检验的下一代基因测序靶向方法，该方法涵盖全部AR编码碱基和前列腺癌高信息性基因组区域。鉴于AR拷贝数从治疗前到进展后不发生改变，而且无突变体AR等位基因显示出获得性增益（gains），在13%的使用阿比特龙治疗但出现进展的肿瘤中观测到T878A或L702H AR氨基酸变化出现。使用阿比特龙治疗前出现AR增益或T878A或L702H的患者PSA水平下降的可能较小，并会有显著较差的总体和无进展存活率。总之，这些研究表明ctDNA检测到的AR基因畸变预测抗雄激素疗法的治疗效果。

根据血液情况对临床介入靶向疗法进行分层是将液体活组织切片分析引入临床实践的关键。但是需要注意的是诊断方法受到疗效效价的限制。下文中我们会讨论一些基于CTC和ctDNA的分析展示这一问题的研究。

基于CTC数量的化疗切换

在SWOG0500（NCT00382018）临床试验的筛查部分，使用一线化疗（结合或不结合靶向疗法）治疗的转移患者在第一期和第二期之前测定了CTC计数。一期之后CTCs持续升高的患者（≥5CTCs/7.5mL）早期癌症进展的风险较高。这样的患者可以选择继续进行一线化疗（直到临床经典证据出现或进行放疗）或在进行放疗前切换其他化疗方法。该研究确认了在接受一线化疗的MBC患者中CTCs预后的显著性。对于一线化疗21天后CTCs仍持续水平仍持续升高的患者，提早切换到备选细胞毒素疗法不能有效延长总存活率。这类人群需要比标准化疗更有效的治疗。Georgolias及其同事进行的随机II期研究指出曲妥单抗降低了出现化疗耐药性CTCs早期乳腺癌患者的临床复发率。

基于CTC数量接受化疗或激素疗法的患者分层

STIC CTC METABREAST临床试验（NCT01710605）中，大约1000名HR+M+乳腺癌患者随机按照医师自选或CTC计数进行疗法选择。CTC组中，具有高CTCs水平（≥5CTCs/7.5mL）的患者接受化疗，但是低CTCs水平（<5CTCs/7.5mL）的患者接受内分泌疗法作为一线治疗。CTC和标准组唯一的区别是激素疗法VS化疗治疗的比率。这一关键的试验设计是为了显示CTC组的无进展存活率（主要临床终点）并不差以及CTC在医疗经济学研究（联合主要终点）方面的优势。该研究开始于2012年目前还在持续招募患者，到2015年12月已经有超过660名患者参与了该研究。

基于CTCsHER2-表型的患者分层

下文中的研究在文章投稿时仍在进行，因此我们简略讨论一下实验的设计。

DETECT III研究中，1426名接受多达3条化疗线的转移乳腺癌患者接受了HER2+CTCs试验。所有患者中，原发肿瘤和转移病灶的HER2状态必须为阴性。这些患者的每7.5mL血液中必须检测到一个HER2+CTC。符合入选标准的228名患者随机分为2组接受标准疗法和标准+拉帕替尼疗法。标准治疗包括化疗或内分泌疗法，这两种疗法与拉帕替尼联合使用或在临床试验中进行研究。两组中的骨转移患者使用狄诺塞麦治疗。DETECTIII其研究的主要终点是无进展存活，次要终点是总体存活、总体反应率、临床受益率和CTCs动态。

根据在HER2-原发乳腺癌转移阶段可以在CTCs中“获得”HER2的事实，CirCE研究是一项次要介入性II期研究。研究使用FISH HER2扩增评估测得的HER2/CEP17比率。在这项单组研究中，具有HER2扩增的CTCs的患者接受抗HER2药物治疗但是不联合化疗，反应率是研究的主要终点。

最终，治疗CTC试验是一项随机II期试验，试验的参与者是HER2非扩增原发乳腺癌患者，患者的在手术和（新式）辅助化疗完成后血液CTC水平为≥1CTC/15mL。在随机化之前，对原发肿瘤和CellSearch CTC图像的两种HER2状态执行中心审查。合格的患者按照1:1的比率随机分入曲妥单抗治疗组或观察组。随机分入曲妥单抗治疗组的患者每隔3周接受总计6次注射。随机分入观察组的患者被观察18周。在18周结束时主要终点将比较两组的CTC检测率，但是次要终点将比较无复发间隔。

基于ctDNA EGFR突变分析的患者分层

最近，NSCLC已经批准了第一种ctDNA EGFR突变试验，这是液体活组织切片进入临床应用的重要一步。批准基于一项旨在评估白种IIIA/B/IV期，EGFR突变阳性NSCLS患者中一线吉非替尼效价和安全/耐受性的IV期、非盲、单组研究。该研究包括匹配肿瘤和血清样品中EGFR突变分析并推断（i）一线吉非替尼在白种EGFR突变阳性NSCLC患者中治疗效果和耐受性均良好；（ii）如果不能得到肿瘤组织，可以考虑将ctDNA用于突变分析。

CTCs和ctDNA分析已经为新的诊断方法铺平了道路，迄今为止已经为液体活组织切片诊断打下了基础（图1）。至于未来这二者能在多大程度上替代肿瘤活组织切片仍是一个需要思索的课题。对于不易取得活组织切片的原发肿瘤如肺癌的诊断，以及转移病灶的再分层/分子诊断，液体活组织切片可以作为备选方法。不仅如此，液体活组织切片有助于集中现有高风险人群肿瘤筛查方式，降低副作用（如乳房X光摄影放射）以及医疗费用。但是，尽管取得了一些有前景的成果，诊断设备公司和大众也对该方法产生浓厚兴趣（“用一滴血进行癌症检测”），癌症的早期诊断仍面临灵敏度和特异性方面的诸多挑战。相反，癌症患者全身疗法期间的CTCs和ctDNA的监测是易于达到目标并更有可能引入临床实践的应用领域。已经证明晚期癌症患者靶向疗法耐药性或突变响应的ctDNA和CTCs的分析是可行的。更多的基因编码治疗目标突变和/或相应的耐药性基因试验在不就的将来即将陆续出现。由于在对治疗有反应的小型群体中鉴别出多种引导特异靶向疗法的突变，NSCLC是一种有望应用该方法的肿瘤实体，尤其对于数量可观的、不易获得活组织切片的患者。

从晚期癌症患者切换到低ctDNA浓度的早期患者的挑战已经以有前景的结果开始。使用具有更高灵敏度的先进基因组方法鉴别匹配ctDNA和肿瘤组织样品中的罕见突变，可以改进通过更早的研究进行的ctDNA突变不连续检测。在CTC领域，已经在一些肿瘤实体中使用EPCAM CellSearch系统观测到了CTC计数和复发之间的有前景的相关性。未来，更灵敏的CTC试验将在临床试验中接受测试，使用更有效的捕获系统和扩大标志物范围，有望在不损失试验特异性的情况下改进精密度检测最小残余癌症。在这种情况下，应该强调除非联合其他标志物，排除血细胞来源，如波形蛋白这样的间质细胞标志物在血细胞中存在不同水平的表达，不适合用于CTC检测。有趣的是，波形蛋白存在肿瘤细胞表面表达，在这种情况下，波形蛋白可以用作CTC标志物。

图1. CTC和ctDNA作为个性化医疗液体活组织切片的临床应用。可重复采集血样预测M0患者复发或M1患者肿瘤转移进展。疗法效价监测、理解潜在耐药性机制。治疗前，可对患者进行分层，使患者得到最有效药物的治疗，治疗开始后CTC/ctDNA的持续存在可表明对疗法的耐药性，这些信息可以让患者在肿瘤负荷过于严重前，在早期切换到更有效的方法达到治愈的目的。mt：突变；BC：乳腺癌；PC前列腺癌；CRC：结肠直肠癌。

图2. 有效和无效疗法对CTCs和ctDNA的影响。A. 如果疗法有效，患者出现良好反应，原发肿瘤和/或转移瘤的许多敏感肿瘤细胞被疗法摧毁。作为疗法的直接结果，对疗法敏感的肿瘤细胞（橙色）出现细胞凋亡并释放肿瘤DNA（ctDNA）到外周血中。但是，活肿瘤细胞出现小的耐受性亚克隆（紫色）会增殖并释放CTCs到血液中，但不会释放DNA。这些细胞中的一小部分最终可能会凋亡并释放少量DNA（紫色）到血液循环中。B. 如果疗法无效，患者对疗法无反应，并会含有极少量疗法敏感肿瘤细胞（橙色），但是治疗前出现许多对疗法产生耐受性的肿瘤细胞。疗法会消灭疗法敏感肿瘤细胞，存在耐受性的细胞会存活、增殖并散布到血流中出现数量增多，但不会释放大量肿瘤DNA（紫色）。

尽管现有试验中ctDNA通常会显示出比CTCs更高的动态范围，但是并不会总是表现出肿瘤细胞负荷。无论如何，因为目前正在开发更灵敏的CTCs和ctDNA试验，可用于分析的总CTCs和ctDNA量可能不会是限制因素。关键问题是CTCs和/或ctDNA分析获取的信息能否在临床环境中预测对疗法的反应以及癌症存活率。目前，ctDNA研究包括的患者数量比CTC研究的数量更少。例如，Dawson及其同事从事的ctDNA乳腺癌研究仅有30名患者，但是最近Rack及其同事从事的CTC研究却有上万名乳腺癌患者。不仅如此，CTCs分析可以表明DNA、RNA和蛋白质层面的肿瘤异质性，ctDNA计算分析结果也可以表明肿瘤异质性但限于基因组畸变层面。先前的研究显示一些药物目标或药物耐药性机制只能通过mRNA或蛋白质表达分析检测（如ARv7或PD-L1）。CTCs单细胞RNA测序目前已经可行，我们有信心它将成为定义新药物目标的重要工具。但是，RNA不如DNA稳定，需要采取一些注意事项保持血液样品中可用CTCsRNA的完整性。

由于我们仍对CTC和ctDNA释放动态生物学知之甚少，这可能会阻碍临床结果的判读。ctDNA主要代表死亡肿瘤细胞的基因组，但是，可用肿瘤细胞促使了癌症进展并导致了疗法耐受性（图2A和2B）。因此，选择ctDNA筛查适当的时间点是检测耐药性肿瘤细胞克隆ctDNA的关键。在这种条件下，可用CTCs的平行测定可以为癌症患者中需要单独选择合适疗法的个体提供额外信息。

除了肿瘤中的原发突变，CTCs和ctDNA需要对次级、获得性药物耐药性和突变进行检测，这些耐药性机制和突变比原发突变具有更高的异质性。一些发表的ctDNA研究侧重于次级获得性耐药机制，并证明造影或传统肿瘤标志物分析（如KRAS或EGFR突变）可以在进展前检测这些机制。同样，CTC研究能证明最初并未观测到耐药性克隆（HER2扩增/过表达或PIK3CA突变）。但是不能忽视在一些情况下“获得性”药物耐药性不是由于新突变而是由于忽视了原发肿瘤非常小的亚克隆造成的。

未来临床试验应该侧重于介入性研究证明液体活组织切片的临床实用性。需要强调的是即使对疗法目标和耐药性机制进行最佳的液体活组织切片分析，也不能保证患者对治疗药物出现长期持久的良好反应。液体活组织切片分析（像其他诊断方法）的临床实用性在随机临床介入性研究中得到证明，在这些研究中，疗法的决策基于液体活组织切片分析并使用如出现进展的时间或总存活率这样的既定终点。但是，需要国际实验确认的更可靠的CTC和ctDNA试验作为这些试验的伴随诊断。包括超过35个学界和业界组织的欧洲IMI财团（CANCER-ID）目前侧重于液体活组织切片试验的确认工作。除了CTCs和ctDNA，循环外来体或血液血小板可能会成为新型血液生物标志物的选择。未来的研究需要在任意特殊指标中直接比较这些技术的利弊。

（摘自CANCER DISCOVERY，版权归其所有，仅供内部学习）

编译：张凯

审校：王小茜