感染性疾病核酸定性和定量检测方法的性能验证与基本要求

沈佐君，医学博士，一级主任技师，教授，博士生导师。中国科学技术大学附属第一医院（安徽省立医院）医学伦理委员会主任委员兼办公室主任。主要研究方向：外泌体中非编码RNA作为肿瘤诊断标志物及其机制研究；外周血中循环肿瘤细胞的捕获、鉴定及其在肿瘤的诊断治疗和监测中应用研究；人体中生物活性物质的结构异构体与疾病的关系研究。学术兼职：中国医学装备协会临床检验装备技术专业委员会副会长；中国医师协会临床检验专业委员会常委；中国医院管理协会临床检验专业委员会常委。承担国家科技部重大专项分课题、国家自然科学基金面上项目和安徽省自然科学基金共7项。获安徽省级科学技术二等奖2项，三等奖4项，在国内外发表文章130余篇。第八届国家卫生计生突出贡献中青年专家，享受国务院政府特殊津贴。

因为新冠疫情的发生，“核酸检测”一词已被大家广为熟知。核酸检测可以分为定性检测和定量检测，例如新冠病毒核酸检测就是定性检测。医疗机构PCR实验室在开展核酸检测之前是要申请国家相关部门的技术审核与验收，实验室只有完成定性和/或定量项目的性能验证等一系列工作，符合医学实验室质量和能力的认可准则要求，才能拿到相应的资质去开展临床检验工作。为了加强对PCR实验室相关国家认证工作的了解，尤其是核酸检测项目的性能验证，本文对核酸定性和定量检测方法的性能验证与基本要求作一归纳。

一、核酸检测性能验证概述

在临床实验室“性能验证”的定义是：性能验证（verification）广义为通过提供客观证据证明特定的要求得到满足；狭义的性能验证指使用某种检测方法的实验室按照所提供的试剂盒或检测系统说明书使用时，能复现生产厂家所宣称的检测性能。在检测系统（方法学）的性能验证指出商品试剂和仪器在用于临床日常标本检测前，必需进行有效的性能验证。而在检查或评审时要求实验室在进行性能验证时，应验证所用检测方法满足其试剂盒说明宣称性能指标；除了性能验证报告外，实验室应提供性能验证的原始实验记录。

二、临床实验室核酸检测性能验证的时机

首先是检验程序常规应用前，如新购置的或重新安装的仪器设备。其次是任何严重影响检测系统分析性能的情况发生后，应在检测系统重新启用前对受影响的性能进行部分性能验证。影响检测系统分析性能的情况可包括但不限于仪器主要部件故障，仪器搬迁，设施、环境的严重失控等。还有就是常规使用期前，实验室可基于分析系统的稳定性，利用日常工作产生的检验和质控数据，定期对检验程序的分析性能进行评审，应能满足检验结果预期用途的要求。新检测系统也包含现用检测系统的任一要素（仪器、试剂、校准品等）变更，如试剂升级、仪器更新、校准品溯源性改变等应按照新系统来进行验证。

三、临床实验室核酸检测性能验证前准备

样本最好来自患者真实样本，尽量与厂家建立性能指标时所用材料一致。当一份样本需进行多次实验时，对样本进行分装保存，避免反复冻融。涉及病理形态学的样本（如组织、细胞学样本等），需经符合资质的病理医师于显微镜下确认符合相应要求后才可进行后续检测。需要时可行肿瘤细胞富集。若涉及核酸提取，应使用试剂盒配套或推荐的核酸提取试剂，并确保其提取效率满足要求。核酸提取效率的评价宜包括：核酸浓度、纯度及完整性。实验室设施及环境符合分析系统工作要求。仪器经过校准，各项性能指标合格。参与实验操作人员应熟悉方法原理与操作，包括样本处理、校准、维护程序、质量控制，确保检测系统工作状态正常。负责实施性能验证人员应了解验证方案，制定验证计划，并组织实施。

四、核酸检测定性项目的性能验证

PCR定性检测选择验证的性能指标宜包括方法符合率、检出限、抗干扰能力、交叉反应等。分子诊断定性检测项目的性能验证参见CNAS-GL039《分子诊断检验程序性能验证指南》。

1. 方法符合率：选取阴性样本至少5例，阳性样本（宜包括弱阳性/低扩增的样本），一般不少于10例样本。其中罕见或少见病种的项目，可酌情减少样本例数。若弱阳性/低扩增样本不好获取，可用适当稀释阳性样本获得类似效果。对于杂交检测技术，若弱阳性/低扩增样本不好获取，可用不同比例的特定细胞系混合获得类似的效果。阴性样本中应包含与检测对象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状的样本。按照患者样本检测程序，采用参比方法和候选方法平行检测。将所有检测结果汇总，计算阴、阳性符合率以及总符合率。

2. 检出限：所有检验程序在厂家试剂使用说明书等有声明检出限时，检测项目在有标准物质时，或以定量形式表达定性结果时，应进行检出限的验证。（1）验证方案：a）样本：定值标准物质（如：国际参考品、国家参考品、厂家参考品）。对于报告具体基因型的方法，其选用的标准物质需包括所有的突变类型。对于检测对象同时含有不同比例的不同基因型时，应设置多个梯度，主要从扩增反应终体系总核酸浓度和突变序列所占比例两个方面进行评价。b）验证方法：使用定值标准物质的样本梯度稀释至厂家声明的检出限浓度，可重复测定5次或在不同批内对该浓度样本进行20次重复测定（如测定5天，每天检定4份样本）。稀释液可根据情况选用厂家提供的稀释液或阴性血清，该阴性血清除被验证的目标物必须阴性外，所含干扰物质浓度必须在厂家声明的范围之内。新冠病毒核酸可用采样管保存稀释液。C）判断标准：如果是5次重复检测，必须100%检出靶核酸；如果是20次检测，必须检出至少18次靶核酸。

（1）示例1：NGS和Sanger测序对于基因变异类型（如：SNV, indel，CNV, SV）的检测，均应分别进行检测限的验证，以确定不同变异类型各自的检测限。建议使用已知突变丰度的包含所有待检测变异类型的经过福尔马林固定石蜡包埋的细胞系混合物或临床样本，将其稀释至厂家声明的检出限浓度，以及高于和低于该浓度一个梯度浓度，按照厂家声明的测序深度对该系列浓度样本进行测定（样本总数不得少于5个，每个样本检测浓度不得少于3个），如果≥95%检出限浓度以上的样本检测到可靠变异，则检出限验证通过。

（2）示例2：杂交 使用经合格病理医师评估的接近最低检测限的按照一定比例混合的细胞系沉降制片/或组织切片，在不同批内对样本进行测定（如连续测定5天，每天测定4份样本），如果90%以上样本符合细胞系特性或与中心参考实验室结果相同（必要时可原片复核或进行数字切片转化），则测定下限验证通过。需说明的是，此方法不适用原位杂交。

3. 交叉反应：应验证与检测对象可能存在交叉反应的核酸物质对检测的影响。对于病原体核酸检测来说，主要指与检测对象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状的病原体核酸，宜在病原体感染的医学决定水平进行验证。对于报告具体基因型的方法，应在待测核酸浓度水平验证其它基因型对待核酸测定的影响。

对于新冠病毒核酸检测：阳性质控品可用1～2个病毒株为代表，应含有天然的或人工合成的包含试剂盒可检测靶序列（如假病毒）。阴性参考品则主要涉及对交叉反应的验证情况，建议包括冠状病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、SARS冠状病毒（可采用假病毒）、MERS冠状病毒（可采用假病毒）、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。

对于病原体核酸，取一定浓度与待测核酸可能存在交叉反应的病原体加入样本保存液或经确认为阴性的样本中，与常规样本一样处理，至少重复检测3次；对于基因型检测，取一定浓度经其它方法（如测序等）确认为其它基因型的样本，与常规样本一样处理，至少重复检测3次。最终评判标准结果应为阴性。

4. 抗干扰能力：分子诊断常见的干扰物质主要包括血红蛋白、甘油三酯、胆红素、免疫球蛋白G、类风湿因子和药物等。实验室可根据临床需求、厂家声明和样本特点（实际可能存在的干扰物质及达到的浓度）选择需要验证的干扰物质及浓度。需要时，也应评估抗凝剂和样本保存液等对结果的影响。

实验室可根据实际情况选择验证方案。方案一：实验组为在弱阳性样本中加入干扰物质溶液（对照组加入等量的溶剂），使得干扰物质的终浓度与厂家声明的浓度相同，与常规样本一样处理，至少重复测定3次以上。（弱阳性样本：干扰物质=9:1）则评判标准为弱阳性样本检测认为弱阳性结果，经验证通过。方案二：选取含待验证的高浓度水平干扰物质且确认不含被测物质的临床样本作为实验组，选取含低浓度水平干扰物质且经确认不含被测物的临床样本作为对照组。分别在实验组和对照组中加入弱阳性样本（量小于10%），与常规样本一样处理。每组至少重复检测3次。最终评判标准为：如果对照组和实验组结果均为弱阳性，说明在验证浓度下，干扰物质对测定无显著影响。如果对照组结果为弱阳性，实验组为阴性，说明在验证浓度下，干扰物质对测定有显著影响，该项性能验证未通过。

5. 原位杂交技术分析敏感性和特异性：要求至少200个与探针特定对应的基因组目标序列应被用来进行分析敏感性和特异性验证。则样本至少来自5个不同个体，至少50个（用于验证远离着丝粒探针）含有与探针相对应的基因组目标序列的肿瘤细胞进行原位杂交检测。则判断标准为敏感性和特异性均不低于90%。

五、核酸检测定量项目性能验证

目前进行感染性疾病定量分子诊断常见的病原体包括乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。定量检测项目验证内容至少应包括：精密度、正确度、线性、测量或可报告范围、抗干扰能力等。分子诊断定量检测项目的性能验证参见CNAS-GL037《临床化学定量检验程序性能验证指南》。

1. 精密度：验证要求为应同时验证重复性和中间精密度。用于精密度验证的样本应具有很好的稳定性和均一性。样本浓度至少含两个浓度水平，应尽可能与厂家精密度评价时所用样本浓度一致，宜确定医学决定水平处的精密度。

（1）验证方案1：样本每个浓度测定的最低要求是每批次测3次，测定5天。获得的数据按照《WS/T 420-2013临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证》 或《WS/T 492-2016临床检验定量测定项目精密度与正确度性能验证》或EP15-A2的要求进行分析，使用浓度对数值计算重复性和中间精密度，并与厂家声明比较。

（2）验证方案2：①重复性：每个浓度样本批内重复测定20次，使用浓度绝对值计算不同浓度时的测量精密度；②中间精密度：每个浓度样本连续测定20天，每天测定1次，使用浓度对数值计算不同浓度时的测量精密度。

（3）验证方案3：①重复性：每个浓度样本批内重复测定10次，使用浓度对数值计算不同浓度时的测量精密度；②中间精密度：每个浓度样本连续测定10天，每天测定1次，使用浓度对数值计算不同浓度时的测量精密度。参考YYT 1182-2010核酸扩增检测用试剂（盒）说明书，如果实验室测定的重复性和中间精密度小于厂家声明，则通过精密度验证。

2. 正确度：对测量正确度评价，首选方法是分析定值参考物质。验证要求为推荐的参考物质具有互换性的有证参考物质及具有溯源性及互换性的正确度验证物质。参考物质至少选择2个浓度水平，至少其中一个水平为医学决定水平。

方案一：根据厂家说明制备参考物质，在3天-5天内每批进行2次测定，按照《WS/T 492-2016临床检验定量测定项目精密度与正确度性能验证》方法计算均值、标准差和置信区间，并与参考物质的数值进行比较，如果参考物质实测数值落在置信区间内，则正确度验证通过。

方案二：根据厂家说明制备参考物质，在3天-5天内每批进行2次测定，计算均值，并与参考物质的数值进行比较，如果实测均值对数值落在参考物质数值数±0.4范围内，则正确度验证通过；如果实测均值对数值落在参考物质允许浓度范围内，则正确度验证通过。

其次是方法比对：在无法获得参考物质时，可使用患者样本与其他检验方法/试剂盒进行比对验证正确度。验证要求为参考方法不易获得时，可选择已得到临床验证时的常规方法，如果是更新试剂盒，则应与现在使用的试剂盒进行比较。

方案一：在3天-4天内使用试验方法和比对方法测定至少20份患者样本，样本浓度水平应覆盖检测方法的可报告范围。按照《WS/T 492-2016临床检验定量测定项目精密度与正确度性能验证》的方法进行配对t检验，确定两种方法间的平均差值以及差值的标准差，计算置信区间和（或）验证限，将测量的差值与厂家声明进行比较。如果实验计算的差值在厂家声明差值的验证限内，说明试验方法与对照方法的差异与厂家声明一致。

方案二：在3天-4天内使用试验方法和比对方法测定至少20份患者样本，样本浓度水平应覆盖检测方法的可报告范围。按照配对t检验计算t值，与临界值tα（α=0.05）比较。如果t值小于临界值tα，试验方法和比对方法无显著差异。

3. 线性区间：验证要求为所用标本应尽可能与所测标本相似，不含有说明书上指出的干扰，患者标本是进行线性试验理想的标本。可通过高、低浓度的标本来配制进行线性试验所需的不同浓度标本，高、低浓度值应在厂家声明的线性范围上下限附近。若不易获得高浓度标本，可通过向患者标本中添加测定物（加入量小于总体积10%）获得；若不易获得低浓度标本，可通过已验证不含被测物的患者标本稀释获得。

使用高、低浓度（最好阴性）的标本配制进行线性试验所需的不同浓度标本，应至少配制5种不同浓度（高：低浓度样本比例=10:0；8:2；6:4；4:6；2:8；0:10）。各浓度（取对数值）间间距宜基本相等。应在一批内完成各浓度标本检测，每份标本至少测定2次。以稀释度为横轴，每个稀释度的测量值均为纵轴作线性回归图。肉眼观察有无离群值，计算线性回归方程式y=ax+b和相关系数r，计算各浓度的理论值与实测值对数值的差值。如果r不低于厂家声明（厂家无声明时，r值应≥0.98），且各浓度的理论值与实践值对数值的差值≤±0.4，则通过线性范围验证。如果r值低于厂家声明（厂家无声明时，r值＜0.98）或浓度的理论值与实测值对数值的差值＞±0.4时，判定为未通过线性范围（区间）验证。

4. 可报告区间：只有经验的线性范围上限不能满足临床需求时，才进行可报告范围验证。可报告范围验证的基础是已完成线性范围验证。选择在线性范围内高值标本，用试剂盒配套或指定的稀释液分别做10、100和1000倍等倍比稀释，稀释后的理论值不应低于定量检测下限，每份标本至少测定2次取平均值，计算各稀释度的理论值与实测值对数值的差值。

5. 抗干扰能力：应验证说明书中涉及的干扰物质对测定的影响，干扰物质主要包括血红蛋白、甘油三酯、胆红素、免疫球蛋白G、类风湿因子、抗核抗体和药物等。需要时也应评估抗凝剂和标本保存液等对结果的影响。宜在病原体感染的医学决定水平进行验证。例如：用相应溶剂溶解干扰物质，配制浓度尽可能为厂家声明浓度的10倍以上。在含一定浓度待测物质的样本中加入干扰物质溶液，使得干扰物质的终浓度与厂家声明的浓度相同，在另一份样本中加入等量的溶剂作为对照。这两份样本分别重复测定2次以上，取平均值，计算其测定值对数的差值。如果这两份标本测定值对数的差值≤±0.4，说明在厂家声明浓度下，干扰物质对测定无显著影响。

6. 特定性能验证：对于商品化的诊断试剂，一般情况下不需要验证核酸提取效率。在样本来源有限、样本组成复杂、目的基因在样本中含量低或怀疑提取试剂有质量问题时需要进行核酸提取效率验证。核酸提取效率包括核酸纯度、核酸提取产率和完整性。扩增效率包括样本和标准品的扩增效率两部分，只有二者扩增效率良好且一致时，定量结果才准确。如果怀疑PCR扩增系统有问题，则应进行扩增效率验证。对于NGS，为保证结果的可靠性，避免因测序深度过低导致的结果假阴性或测序深度太高引起的假阳性，应进行测序深度参考区间、上机测序的性能和数据分析系统的性能验证。

综上所述，性能验证是为了确保实验室开展的检验项目，所应用的检测系统的分析性能或检验方法学能够满足检测及临床要求，从而保证患者标本检测结果准确可靠。