传染性疾病生物标志物POCT快速诊断技术发展与临床应用价值

作者:邹嘉琪 康可人 2022-12-03
作者单位:广州万孚生物技术股份有限公司(邹嘉琪 康可人)

康可人,博士,正高级工程师。现任万孚生物高级副总裁,万孚生物国家企业技术中心主任。曾荣获2017年度国家科学技术进步奖二等奖、2018年度广东省科技进步奖二等奖、2014年度广州市科技进步奖三等奖。近年来负责及参与的国家、省、市级科研课题30余项,发表SCI论文及国内核心期刊论文20余篇,授权专利4项,起草国家标准《新型冠状病毒抗体检测试剂盒质量评价要求》,参与《即时即地检验技术与应用》、《医学检验创新创业教程》、《体外诊断产业技术实验指导》、《即时即地检验》、《中国医疗器械行业发展报告》、《现场监护学》等多部行业教材及专著编写。



邹嘉琪,广州万孚生物技术股份有限公司医学中心主管。2018年毕业于华南农业大学动物科学学院,分子遗传与育种方向农学硕士,硕士期间研究方向为IGF1基因表达调控研究。2021年2月入职万孚,期间曾参与撰写2019-2020年卷《中国体外诊断产业发展蓝皮书》、《新型冠状病毒抗原快速检测专家共识》等。



大多数传染病都是由病原微生物引起的,包括病毒、细菌、寄生虫和真菌等。与其他疾病相比,传染病可以在相对较短的时间内在人群中呈指数级传播,从而威胁公众健康与经济发展。据估计,世界上一半以上的人口面临传染病的风险,传染病也成为对人类最危险的威胁之一[1]。

对传染病的及时诊断,是对其及时进行治疗的关键。灵敏、特异且快速的诊断检测不仅能够为有效治疗提供帮助,而且在预防传染病传播方面也发挥着重要作用。虽然临床中心实验室提供了敏感且特异的检测方法,如血培养、高通量免疫检测、聚合酶链式反应(PCR)和质谱(MS)检测,但这些方法通常耗时耗力,成本高,并且依赖于精密的仪器和训练有素的专业操作人员。而床旁检测(POCT)在医疗服务现场和资源有限的情况下能够提供快速的“现场”结果,为后续治疗提供及时和适当的支持[2]。根据世界卫生组织(WHO)规定,满足传染病控制需求的POCT检测应遵循以下标准:(1)负担得起;(2)灵敏;(3)特异;(4)用户友好;(5)快速且精准;(6)无需设备;(7)可交付给终端用户[3]。


本文主要概述了传染病POCT应用现状、传染病POCT的生物标志物以及传染病POCT技术的最新进展,以期为传染病快速诊断在资源有限的环境中提供更有效的诊断手段。


一、传染性疾病POCT检测临床应用概况


POCT具有操作简单、快速、低成本和易用性强等特点,在传染病快速诊断时不受地点和环境限制而备受青睐。几种主要传染病已经开发出POCT病原体检测:如疟疾寄生虫、人体免疫缺陷病毒(HIV)、人类乳头瘤病毒(HPV)、登革热和埃博拉病毒、结核分歧杆菌(TB)和新型冠状病毒(SARS-CoV-2)等,特别是新冠大流行,极大地推动了POCT技术的发展与进步。

1. 疟疾:在热带地区(如撒哈拉沙漠以南的非洲地区)每年有超过3亿患者患有疟疾[4],而我国已成为WHO认证的全世界第40个完全消灭疟疾的国家,也是目前消灭疟疾最多的国家。根据WHO推荐的《Malaria case management:operations manual》指导,疟疾疑似病例的管理很大程度上依赖于早期诊断和青蒿素联合疗法[5]。长期以来,疟疾的常规诊断方法是以形态学检测为主要内容的血涂片显微镜检查和以病原体核酸为检测目标的PCR法。但这种方法需要精密可靠的设备和训练有素的操作人员,而在疟疾最流行的地区,往往缺乏这些设备以及专业人员。为了解决这一难题,在过去十年间,疟疾POCT快速诊断取得了显著发展,目标就是在临床诊断资源无法常规获取的偏远地区可以实现快速可靠地诊断疟疾。基于分子免疫学原理的疟疾诊断试剂盒由于快速简便,无需大型仪器而广受青睐;基于胶体金免疫层析技术的疟疾诊断试剂盒因其灵敏度和特异性高,性能稳定,操作简便快速,无需专业人员操作,更适合应用于基层医疗机构和现场工作中使用。


2. HIV:全世界有超过4000万人受到HIV病毒的影响,其中约85%的感染者生活在发展中国家,由于资源匮乏,这些地区的临床诊断和抗逆转录病毒治疗(ART)监测平台有限[6]。2020年12月,联合国艾滋病规划署发布了95-95-95目标,即到2025年将HIV检测、治疗和病毒抑制率达到95%-95%-95%。检测是艾滋病防治的第一步,HIV的实验室检测主要包括HIV抗体检测、核酸检测和抗原检测等。其中,HIV1/2抗体检测是HIV感染诊断的金标准[7],常规的抗体检测包括酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫印迹试验,ELISA灵敏度高,因此ELISA阴性通常足以排除HIV感染;但ELISA阳性时,通常需要免疫印迹试验来确认,因为免疫印迹试验具有极高的特异性。尽管过去十年在扩大HIV检测方面取得了成就,但实现95%HIV患者检测自己的HIV状态仍是个巨大的挑战。目前,HIV快速检测显示出与标准HIV检测相当的灵敏度和特异性,不需要先进的实验室资源和训练有素的操作人员,而且越来越多地应用于各种临床场景,可助力HIV检测。市面上有很多HIV快速诊断测试产品,如Alere的Determine HIV 1/2、万孚生物的HIV快速诊断试剂等,均可在POCT环境中检测HIV病毒。目前较为突出的是第四代HIV检测,它在第三代的基础上增加了p24抗原检测,这种组合也称为HIV联合检测,有可能缩短检测窗口期,并可在原发感染期间检测是否存在HIV。近年来,HIV自我检测(HIVST)作为一种创新策略也在逐渐普及,HIVST旨在扩大普通人群获得HIV检测的机会,并覆盖可能无法进行HIV检测的高风险人群[8]。2012年,唾液HIVST获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准;2015年,HIVST获得欧洲认证;2016年,WHO正式建议将HIVST作为HIV检测服务的一种补充方法;2021年,WHO发布《关于HIV预防、检测、治疗、服务提供和检测的综合指南:公共卫生方法的建议》中呼吁各国进一步推广HIV自我检测。为响应这一呼吁,今年7月,MedAccess宣布与CHAI(克林顿基金会)、万孚生物达成合作,携手为中低收入地区提供HIV自测产品,惠及更大范围的人群,以实际行动支持全球艾滋防控。


3. HPV:HPV是最常见的性传播病毒之一,有100多种类型,这种病毒的感染可能会持续存在,最终导致宫颈癌等疾病。根据WHO数据,全球每年新增宫颈癌病例53万,约25万女性因宫颈癌死亡,超过80%的浸润性宫颈癌患者和死亡病例发生在低收入和中等收入国家(LMICs)[9]。宫颈癌是一种可预防、可治疗的疾病,快速准确的HPV筛查对于宫颈癌预防和早发现、早治疗至关重要。HPV的DNA检测、巴氏细胞学检查、阴道镜检查和活检是目前宫颈癌筛查的金标准。得益于巴氏涂片筛查指导的癌前病变治疗,2012年宫颈癌的发病率降至每10万名妇女中仅有7.7例,这凸显了HPV筛查和早期发现在宫颈癌预防中的关键作用。根据WHO最新发布的《宫颈癌前病变筛查和治疗指南》,推荐HPV DNA检测作为首选筛查方法,而不是目前广泛使用的醋酸染色目视观察(VIA)或细胞学检查(也常称为“巴氏涂片”),HPV DNA检测是一种客观诊断,具有更好的灵敏度和特异性。有研究报道,在印度的一项大型随机试验中,30岁以上女性接受一轮基于DNA检测的HPV筛查后,晚期宫颈癌的发病率和死亡率显著降低了50%[10]。因此,对于仍采用VIA检查的地区,WHO建议采取快速转变,以HPV DNA检测取代VIA检查作为宫颈癌的主要筛查方式。


4. 登革热和埃博拉病毒:登革热是一种通过受感染蚊子的叮咬传播给人类的病毒感染。传播该病的主要病媒是埃及伊蚊,其次是白纹伊蚊。登革热病毒属于黄病毒科黄病毒属,具有单链、正向的RNA基因组。全球登革热发病率急剧上升,目前世界上大约一半人口有患病风险,每年估计有3.9亿新感染者[11]。然而,目前没有治疗登革热/重症登革热的特效药。早发现、早治疗是降低登革热死亡率的有效手段。诊断登革热感染可采用多种方法,根据患者就医时间,可能适合不同诊断方法。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)是诊断登革热感染的金标准,然而这种方法需要专业设备及操作人员,因此应用场景受限。血清学方法,如ELISA,可通过检测抗登革热抗体来确认是否存在近期或既往感染,IgM的存在表明最近发生了登革热病毒感染;IgG的存在表明以前有过感染。登革热的实验室诊断并不困难,困难在于临床一线医师对疾病的警惕性和医院登革热检测技术的可及性[12]。而且登革热防疫的黄金窗口期仅2周左右,因此,迫切需要快速、准确的诊断方法来确认登革热感染。商业化生产的快速诊断试剂盒是通过检测病毒产生的蛋白质(称为NS1)来检测登革热,这种方法只需20分钟就能确定结果,而且不需要专门的实验室技术和设备。此外,TaqMan探针实时荧光PCR检测登革热RNA,是一种灵敏、特异、快速、低污染的登革热RNA检测方法,可定性或定量检测登革热患者早期血清中的DENV。


埃博拉病毒病引起的病毒性出血热与登革热相似。埃博拉病毒病是由感染属于丝状病毒科的埃博拉病毒所致,病死率高达90%,是世界上最凶猛的疾病之一。埃博拉病毒可通过密切接触感染动物的血液、分泌物、器官或其他体液而传到人类,随后通过人与人之间的传播而在社区蔓延。因此,及时诊断对于确保实施防疫措施和优化医疗尤为重要。目前的实验室检查主要包括病原学检测和血清学检测。病原学检测是采用分子杂交、RT-PCR等方法直接检测埃博拉病毒核酸;血清学检测是采用ELISA捕获法和ELISA间接法检测患者血清中病毒特异性IgM和IgG抗体。虽然RT-PCR是诊断埃博拉病毒感染的金标准,且具有高灵敏度和特异性,但POCT诊断工具在埃博拉疫情期间显得尤为重要。目前已开发出抗原快速检测产品(Ag-RDT),Broadhurst等人比较了ReEBOV抗原快速检测试剂盒与金标准RT-PCR检测埃博拉病毒的现场性能,Ag-RDT的灵敏度显示为100% [95% CI 87.7-100][13]。Brangel等人开发了一种基于横向流动的POCT检测,通过定制的智能手机应用程序来检测苏丹病毒,以收集检测结果和地理信息。与标准ELISA相比,该POCT检测糖蛋白单链抗体的灵敏度为100%,特异性为98%[14]。在刚果民主共和国持续爆发埃博拉病毒病的背景下,埃博拉的诊断依赖于赛沛公司的Gene Xpert平台[15],有效控制了疫情。一种新的策略将RDT与确认性PCR测试相结合被认为优于单独使用PCR测试或RDT测试,并将使爆发规模减少三分之一。


5. 结核病:结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。结核杆菌可能侵入人体全身各种器官,但主要侵犯肺脏,称为肺结核病。据WHO估计,2016年约有1040万新发结核病(TB)病例,其中诊断出的病例不到64%,无法及时进行治疗干预。因此,尽管TB在很大程度上可治疗,但它仍然是全球主要的传染病一大死因。如果没有改进结核病诊断工具来提供及时的治疗干预措施,到2035年将发病率降低90%和死亡率降低95%的“终止结核病”战略目标将无法实现。目前结核分枝杆菌诊断主要检测方法有结核菌素皮试、涂片、镜检、分枝杆菌培养、组织病理、结核抗体检测、结核PCR检测等。其中,结核分歧杆菌培养仍是诊断结核病以及药物敏感性检测所必需的,且为金标准方法。但是,准确、快速的POCT诊断将是实现结束结核病战略的关键。近年来,结核病的POCT诊断领域也取得了一定的进展。2010年12月,WHO批准了由Alland等人开发的POCT产品Xpert® MTB/RIF检测[16]。该方法使用基于试剂盒的集成微型PCR系统,无需专业操作人员,可在90分钟内从未处理的痰液样本中获得检测结果。目前还有其他被WHO认可的检测工具,如尿侧流脂阿拉伯甘露聚糖(LF-LAM)和环介导等温扩增(TB-LAMP)等。最近,陈心春教授团队首次将蛋白芯片检测技术应用于结核病诊断并筛选出了八个蛋白(I-TAC、I-309、MIG、颗粒溶素、FAP、MEP1B、Furin和LYVE-1)作为最后的蛋白标志物[17],该研究有望为结核病早期、快速、准确的临床诊断提供新方法。


6. 新冠病毒:新冠病毒(SARS-CoV-2)自2020年爆发以来,已在全球范围内持续蔓延。感染SARS-CoV-2的患者通常会表现出咳嗽、发烧和呼吸困难等症状,这些症状与甲型流感的症状非常相似。为准确诊断SARS-CoV-2感染,急需精确的诊断测试来进行确认。新冠检测有三大类:抗原、核酸和抗体,适用于不同目的。抗原和核酸检测属于诊断检测,检查当前是否感染,抗体检测查的是感染史。其中,RT-PCR是SARS-CoV-2感染检测的金标准,但在资源匮乏的地区很难普及,且为缓解新冠负担,急需POCT产品来辅助诊断SARS-CoV-2感染。SARS-CoV-2抗原快速诊断测试被视为对抗病毒传播的重要诊断工具,市面上Ag-RDTs的数量也不断增加,Ag-RDTs的应用也越来越普及。目前,经我国NMPA批准的Ag-RDTs共34款,系统综述和meta分析显示,抗原快速检测对SARS-CoV-2核酸扩增循环数(Ct)<20、<25、≥25、和≥30样本的总体灵敏度分别为96.5%、95.8%、50.7%和20.9%[18]。此外,市面上还有快速核酸和检测产品助力新冠检测,如赛沛公司的Xpert Xpress SARS-CoV-2、雅培的ID NOW快速检测系统等。


二、传染性疾病生物标志物POCT快速检测


生物标志物(Biomarker)是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标,具有非常广泛的用途。目前,生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。几乎所有参与传染病感染过程的分子或细胞都可以作为生物标志物,如核酸、蛋白质和抗体等。


1. 病原体核酸:由于几乎所有的传染病都是由携带核酸的病原体引起的,因此病原体核酸(DNA或RNA)可作为诊断传染病的生物标志物。而事实上,用于检测病原体特异性核酸序列的核酸检测(NAT)已广泛在临床中心实验室应用。病原体基因组核酸的多少也直接反映了感染过程中病原体的病毒载量。使用病原体核酸作为生物标志物的唯一缺点是无法区分病毒感染和定植。此外,传统的基于PCR的NAT设计多个样品纯化和制备的步骤,并且需要昂贵的仪器,使其不适合作为POCT使用。然而,由于技术不断进步与发展,目前已开发了多种方法对核酸检测进行优化,使其更适合作为POCT使用,比如恒温扩增法代替传统PCR,或使用集成微流控装置简化实验程序等,有效简化了繁琐的步骤,缩短了结果报告的时间。


2. 抗体:抗病原体抗体的存在可以作为评估感染状态的生物标志物。在感染过程中,免疫系统会产生大量抗体,抗体水平可能远高于病原体水平。在整个感染过程中抗体水平可能保持较高水平,而在感染后期抗原水平可能会显著下降。例如HIV感染的晚期,抗p24抗体仍然可以检测到,而p24下降到检测不到的水平[19]。因此在这种情况下,抗体对传染病的诊断更有用。从技术角度看,构建检测抗体的免疫测定通常比检测抗原更容易,后者需要昂贵的抗体生产和制备。但当抗体水平与感染阶段没有很好的相关性时,抗体检测不适合用于传染病的诊断。如未感染HIV病毒的婴儿可能会在产前和通过母乳获得母体抗体,此时通常会检测出抗体阳性。


3. 病原体蛋白:所有引起传染病的病原体都携带蛋白质,如衣壳蛋白和包膜蛋白。这些蛋白质可作为传染病诊断有价值的生物标志物。如SARS-CoV-2的核衣壳蛋白(N蛋白)是理想的抗原检测靶标,市面上大多数抗原检测试剂以N蛋白为靶标,具有较高的检测敏感性和特异性。它与可以使用PCR扩增的核酸不同,超低水平的病原体蛋白不易被检测到,因此在病毒感染期间通常病原体蛋白与核酸检测要晚一些。


4. 循环microRNA:MicroRNAs(miRNAs)是具有小尺寸(约20nt)的非编码RNA分子,具有转录后调节基因表达的功能。超过60%哺乳动物的mRNA受相应miRNA的调控。miRNA在感染期间的宿主免疫反应中也发挥着关键作用,已知miRNA作为细胞间通讯的信使通常被释放到细胞外环境,尤其是免疫细胞。2008年首次报道在血浆和血清样本中检测到循环miRNA。虽然细胞外miRNA网络的确切功能仍在研究中,但利用循环miRNA表达特征作为生物标志物监测病理状态的潜力已引起越来越多的关注。例如,傅等人利用miRNA微阵列平台(Exiqon miRCURY™ LNA)检测了TB感染患者血清样本中92个差异表达的miRNA,结果发现,与健康对照相比,结核病例血清样本中循环miR-93*和miR-29a的水平显著上调[20]。


三、传染性疾病POCT快速检测技术的最新进展


传染病检测是POCT产品的重要应用领域,POCT传染病检测产品主要是针对各类常见传染病及重大传染病等基层现场筛查、快速检测的产品。目前,应用于传染病诊断领域的POCT产品主要有抗原快速检测(RDT),快速核酸检测和快速免疫诊断(如抗体检测)等。过去几十年中,开发用于传染病诊断的POCT取得了重大的技术进步,如侧向免疫分析、微流体、等离子体技术等。其中,微流体被认为是最有前途的解决方案之一,它可以将中心实验室诊断中使用的大部分模块小型化并集成到便携芯片中[21]。同时,等离子体技术,包括表面等离子共振(SPR)、局域表面等离子共振(LSPR)和表面增强拉曼散射(SERS)等,为POCT提供了高灵敏度、无标记和实时监测等理想的读出模块。等离子体技术和微流体技术的整合可能成为开发POCT的理想平台,用于开发廉价、稳定和便携的解决方案。


1. 微流体技术:微流体技术是研究可以通过使用微小尺寸的微小通道(通常为几十到几百微米)来处理少量流体的技术。通过微流体技术,样品和试剂可以在特定的微腔室中以精确控制的方式进行运输、混合和反应,是POCT测试开发的理想平台。目前已开发出多种基于微流体技术的传染病POCT诊断方法。Li等开发了一种集成微流体装置,通过检测特异性IgG和IgM抗体来灵敏地诊断登革热病毒感染[22]。Watkins等开发了一种微流控芯片来计数CD4+和CD8+淋巴细胞,用于HIV感染的监测[23]。


纸基微流体被认为是一种低成本且用户友好的 POCT传染病检测技术。此外,比色读数的方式也使得它在许多资源有限的环境中尤其有用。Whiteside等人研发了一种纸基微流控分析装置(μPAD)[24],用于检测HIV-1包膜抗原gp41的抗体。这种装置使用简单、出结果快(1小时内),并且只需要少量样本(1-10μl)。


2. 等离子体技术:等离子体学研究光与金属纳米材料导电电子之间的相互作用。常见的等离子体金属包括金、银和铝,各种等离子体纳米材料因其无标记性、光学可调谐性和对周围介质的高灵敏度而被设计和用于POCT产品的制作。Peng等利用工程噬菌体诱导的金纳米颗粒聚集,开发了一种库仑法POC检测方法来检测细菌病原体[25]。高灵敏度光学传感器的发展进一步推动了等离子体应用的快速发展。在各种光学传感平台中,等离子体纳米材料独特的表面等离子体共振特性使其成为一种极具前景的化学生物传感和临床诊断方法。

LSPR依赖于等离子体纳米材料对折射率变化的高灵敏度,目前已用于使用未经处理的全血进行无标记、无荧光和可重复的HIV病毒载量检测[26]。该技术能够以高灵敏度、高特异性检测和定量多种HIV亚型,且检测时间相对较短 (捕获1小时,检测和分析10分钟)。此外,用于SPR激发的棱镜耦合配置已被用于无标记的临床蛋白检测,在这种配置中,通过折射率的变化来监测生物样本的捕获,折射率的变化导致反射光的变化[27]。等离子纸LSPR装置也被证明可选择性且敏感地检测蛋白质生物标志物,这使其非常适合在资源有限的情况下用于POCT诊断感染性疾病。


四、展望


POCT检测以其操作简单、周转时间短和广泛的可及性迅速为传染病诊断提供新方法,特别是在资源有限的环境中,POCT能够及时有效地以患者为中心进行治疗和管理。虽然一些生物标志物已作为传染性疾病POCT检测的靶点,但仍需要挖掘灵敏度和特异度更高的生物标志物。对单一传染性疾病的一组生物标志物进行系统表征可能是未来生物标志物筛选的有用方法。由于许多传染病可能具有相似的临床症状,因此也非常需要具有多重功能的POCT检测产品。在过去的十年中,传染病POCT检测的新技术发展取得了重大进展,包括微流体和等离子体技术。要将这些技术从研究转化为临床实践,仍然需要严格的临床验证。许多实际问题,包括感染控制、受限环境中的检测、信息技术连接和临床路径优化,也是成功实施以应对临床挑战的重要考虑因素。


参考文献


Hwang H, Hwang B Y, Bueno J. Biomarkers in infectious diseases[J]. Disease markers, 2018, ( 2018) 8509127.

Chen H, Hagström A E V, Kim J, et al. Flotation immunoassay: masking the signal from free reporters in sandwich immunoassays[J]. Scientific reports, 2016, 6(1): 1-8.

Tay A, Pavesi A, Yazdi S R, et al. Advances in microfluidics in combating infectious diseases[J]. Biotechnology advances, 2016, 34(4): 404-421.

Talapko J, Škrlec I, Alebić T, et al. Malaria: the past and the present[J]. Microorganisms, 2019, 7(6): 179.

Kim S, Nhem S, Dourng D, et al. Malaria rapid diagnostic test as point-of-care test: study protocol for evaluating the VIKIA® Malaria Ag Pf/Pan[J]. Malaria journal, 2015, 14(1): 1-8.

Tay A, Pavesi A, Yazdi S R, et al. Advances in microfluidics in combating infectious diseases[J]. Biotechnology advances, 2016, 34(4): 404-421.

中华医学会感染病学分会艾滋病丙型肝炎学组, 中国疾病预防控制中心. 中国艾滋病诊疗指南(2021年版) [J] . 中华传染病杂志, 2021, 39(12) : 715-735. DOI: 10.3760/cma.j.cn311365-20211030-00378.

Grésenguet G, de Dieu Longo J, Tonen-Wolyec S, et al. Acceptability and usability evaluation of finger-stick whole blood HIV self-test as an HIV screening tool adapted to the general public in the Central African Republic[J]. Open AIDS J, 2017, 11: 101.

Mohammed S I, Ren W, Flowers L, et al. Point-of-care test for cervical cancer in LMICs[J]. Oncotarget, 2016, 7(14): 18787.

Sankaranarayanan R, Nene B M, Shastri S S, et al. HPV screening for cervical cancer in rural India[J]. New England Journal of Medicine, 2009, 360(14): 1385-1394.

Bhatt S, Gething P W, Brady O J, et al. The global distribution and burden of dengue[J]. Nature, 2013, 496(7446): 504-507.

张文宏, 王新宇. 加强登革热早期诊断与及时防控的紧迫性[J]. 中华传染病杂志, 2019, 37(10): 577-580. DOI:10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2019.10.001

Broadhurst M J, Kelly J D, Miller A, et al. ReEBOV antigen rapid Test kit for point-of-care and laboratory-based testing for ebola virus disease: a field validation study[J]. The Lancet, 2015, 386(9996): 867-874.

Brangel P, Sobarzo A, Parolo C, et al. A serological point-of-care test for the detection of IgG antibodies against Ebola virus in human survivors[J]. ACS nano, 2018, 12(1): 63-73.

Jacob S T, Crozier I, Fischer W A, et al. Ebola virus disease[J]. Nature reviews Disease primers, 2020, 6(1): 1-31.

Lawn S D, Nicol M P. Xpert® MTB/RIF assay: development, evaluation and implementation of a new rapid molecular diagnostic for tuberculosis and rifampicin resistance[J]. Future microbiol, 2011, 6(9): 1067-1082.

Yang Q, Chen Q, Zhang M, et al. Identification of eight-protein biosignature for diagnosis of tuberculosis[J]. Thorax, 2020, 75(7): 576-583.

徐英春, 胡继红. 新型冠状病毒抗原快速检测专家共识 (2022)[J]. 协和医学杂志, 2022.

Gray E R, Bain R, Varsaneux O, et al. p24 revisited: a landscape review of antigen detection for early HIV diagnosis[J]. AIDS (London, England), 2018, 32(15): 2089.

Fu Y, Yi Z, Wu X, et al. Circulating microRNAs in patients with active pulmonary tuberculosis[J]. J Clin microbiol, 2011, 49(12): 4246-4251.

Jung W, Han J, Choi J W, et al. Point-of-care testing (POCT) diagnostic systems using microfluidic lab-on-a-chip technologies[J]. Microel Eng, 2015, 132: 46-57.

Lee Y F, Lien K Y, Lei H Y, et al. An integrated microfluidic system for rapid diagnosis of dengue virus infection[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2009, 25(4): 745-752.

Watkins N N, Hassan U, Damhorst G, et al. Microfluidic CD4+ and CD8+ T lymphocyte counters for point-of-care HIV diagnostics using whole blood[J]. Sci Translat Med, 2013, 5(214): 214ra170-214ra170.

Cheng C M, Martinez A W, Gong J, et al. Paper‐based ELISA[J]. Angewandte Chemie, 2010, 122(28): 4881-4884.

Peng H, Chen I A. Rapid colorimetric detection of bacterial species through the capture of gold nanoparticles by chimeric phages[J]. ACS nano, 2018, 13(2): 1244-1252.

Halas N J, Lal S, Chang W S, et al. Plasmons in strongly coupled metallic nanostructures[J]. Chemical reviews, 2011, 111(6): 3913-3961.

Uludag Y, Tothill I E. Cancer biomarker detection in serum samples using surface plasmon resonance and quartz crystal microbalance sensors with nanoparticle signal amplification[J]. Analytical chemistry, 2012, 84(14): 5898-5904.