纸基微流控芯片技术在即时检验中的应用与面临的挑战
李博伟，分析化学博士、副研究员、硕士研究生导师。现任职于中国科学院烟台海岸带研究所，长期从事微流控芯片技术研究，利用比色、荧光、电化学和表面增强拉曼等方法，创新了一系列基于微流控芯片传感微器件和仪器关键部件。相关成果在Advanced Materials、Angewandte Chemie International Edition、Analytical Chemistry等国际知名期刊发表，SCI收录论文50余篇，其中影响因子IF＞5的论文35篇, ESI高被引论文2篇，论文总他引2000余次，H-指数28, 获授权中国发明专利10余项。主持国家自然科学基金项目2项、山东省自然科学基金重点项目等项目。获中国分析测试协会科学技术奖和海洋工程科学技术奖等省部级奖3项。任Journal of Hazard Materials、Analytical Chemistry等10余种国际学术期刊审稿人。
【摘要】现场即时检测对于临床诊断和疫情防治有重要意义。纸基微流控芯片作为一种低成本、便捷、环保的试纸化快检器件，在临床即时检测中展现出了较好的应用前景。本文论述了纸基微流控芯片的制备、流体控制以及分析方法构建，并归纳了其在血液前处理、疾病标志物分析、病毒检测和细胞分析等临床即时检测中的最新应用研究进展，指出了纸基微流控芯片面临的挑战，展望了其未来的发展。
即时检测（point of care，POCT）是指在核心实验室之外进行的即时实验检测，通常是在样品采集现场、临床治疗地点等现场完成的快速检测，甚至可以由非专业的人员操作完成[1]。POCT在临床医学诊断上的意义表现在很多方面：（1）在急诊或需要紧急治疗时，POCT能快速给出结果，促进及时正确的治疗方案形成；（2）在不具备实验室分析的条件下，如家庭、野外、资源匮乏的国家/地区，通过POCT也可以得到及时诊断；（3）POCT大大缩减了医学诊断的成本，让诊断过程更加简单与亲民。此外，在生态环境安全、食品安全、公共安全、军事与航天等领域，POCT由于其不受环境限制、简捷快速、高效廉价的特点而受到广泛的关注[2]。尤其是在新型冠状病毒疫情席卷全球的当下，我国坚持“动态清零”的防疫政策，那么POCT必然是未来我国核酸检测的发展趋势，也是降低防疫成本最有效的方法之一。
如何构建POCT方法？选择适宜的分析平台是关键。纸被用于构建快速检测方法已经有悠久的历史，最早可以追溯到19世纪，用石蕊试纸来近似测量pH值，至今仍在使用。在20世纪80年代末，基于侧向层析免疫测定的验孕试纸被研发之后，以早孕检测为主，成为流行的快速检测方法[3]。2007年哈佛大学Whitesides团队发表了纸基微流控的开创性论文，纸基微流控芯片被广泛关注[4]。纸基微流控芯片，简称纸芯片，源于微流控技术，通常采用蜡印、光刻、化学气相沉积等技术在纸基上形成亲水/疏水结构的通道或位点的排列，将微升级样品的分离运送与分析传感过程，集成于纸质结构中，形成芯片模式。它与传统基于玻璃/聚合物的微流控芯片相比，纸芯片具有成本低、制作工艺简单、毛细作用（自动力）和生物亲和性等优点[5]。POCT纸芯片提供了一种快捷高效、廉价环保、用后即抛的分析工具，在现场快速测试和临床诊断方面展现了较好的应用前景。
本文全面综述了纸芯片制备、纸基流体控制以及其在即时检测和临床中应用的最新进展，并对纸芯片未来的发展进行了展望。
一、纸芯片的制备
纸材质种类的选择是纸芯片制作的基础，目前使用最为广泛的是Whatman No.1滤纸，含有98%的α-纤维素，表面光滑均匀，流体在其内部流速合适，颗粒保留效果好。除滤纸外，其它种类的纸也可根据需要被采用，如硝化纤维纸、玻璃纤维纸和棉纤维纸[6]。
微流控纸芯片不仅需要简单的横向液体流动通道，还需要执行少量的生化液体样品的复杂的分析多级反应，这就需要设计构建相对复杂的流体通路。其制造技术大致可分为两类：第一类，通过材料堵塞纸张内部的孔隙来制造物理/化学疏水屏障，如光刻法、蜡印法、喷墨侵蚀法、喷墨打印法、压印刷法、柔性印刷法、丝网印刷法、3D打印法、喷涂法、激光处理法、化学气相沉积法、湿法刻蚀法、电晕处理法；第二类，通过物理模式或切割来形成确定的通道形状，如电子/手工刀切加工法、压花加工法、激光切割加工法，等一些物理加工工艺方法[7]。其中，中科院大连化物所林炳承研究员团队率先开创了通过喷蜡打印机的蜡印法制作纸芯片，使得纸芯片的市场化批量制作成为可能，迅速成为了纸芯片制作最常用的方法[8]。
目前，Fuji Xerox公司的喷蜡打印机已经停产，国内市场难以采购，且蜡容易被有机溶剂溶解，使纸芯片应用范围受限。为了应对这些问题，作者团队采用一种低成本，且具有环保性的感光树脂聚氨酯丙烯酸酯（PUA）作为制作微流控纸芯片的疏水材料，并通过紫外光刻手段制备一种可以抵抗多种有机试剂侵蚀的纸芯片[9]。首先通过物理吸附在滤纸上修饰PUA，然后在掩模的保护下，紫外光辐照特定区域，曝光区的PUA交联固化形成疏水区，未曝光区的PUA用水冲洗掉，从而在滤纸上形成图案化的亲水通道网络。整个加工过程还可以借助丝网印刷技术，简单快速，不需要复杂设备，制得纸芯片通道分辨率高、重现性好。
二、纸芯片流体控制
在一些相对复杂的分析过程往往需要多种试剂参与的多步反应。要实现纸芯片平台上的多步反应，微升级的液体在芯片通道上因毛细作用自发流动的情况下，对于流体的顺序控制是关键。这就需要在纸芯片上控制液体流速，并构建阀来控制液流的启停。
液体在纸纤维中的流动速度是由通道形状、纸纤维孔隙度和表面修饰、液体黏度、环境温度、湿度等多种条件决定的。通常，通过设计纸基通道长度和宽度这种最直接方式，可控制液流速度。延长通道的长度能延长液体到达目标区域所需的时间，另一方面通道越宽，单位时间中单位液体流经的距离越短，从而实现对液流的控制[10]。
纸芯片上阀的构建目前有很多形式。通过纸层间的折叠可以实现不同层间纸通道的接触或分离，进而控制流体在层间流动的开始和中断。纸纤维可变形，可通过施加外力（按压），在一定程度上使纸微量变形，使纸的间隙接触，控制通道液体的通断。还可以在纸通道之间做修饰，植入可溶解的材料被流体溶断后，可以阻断液流的流动[11]。但大多数纸基阀构建方式不够灵活，开关都需要等待时间，并且为单方向一次性阀，对于多步反应无法发挥效果。为解决这些弊端，作者团队研究了一种在纸芯片上制造移动阀操纵流体的新策略[12]。移动阀使用中空铆钉作为中心，可以使通道在不同层中移动，从而控制通道的连接或断开。相比现有方法，该方法更为便捷，可以自由控制流体。利用搭载移动阀的纸芯片，成功实现了多步酶联免疫分析，该方法表现出良好的灵敏性和重现性。进而根据移动阀的思路衍生了旋转式纸芯片的设计思路，进一步提升了纸芯片的功能性和可操作性[13]。
三、纸芯片平台分析方法的构建
随着多种功能材料与纸纤维结合，赋予了纸传感性能，因此越来越多的先进分析方法也可以在纸基微流控芯片上实现。从纸芯片被最初用于分析检测所采用的比色法，到随后陆续出现的电化学分析传感纸芯片、电化学发光分析传感纸芯片、化学发光分析传感纸芯片、光致电化学分析传感纸芯片、表面增强拉曼散射传感纸芯片、荧光分析传感纸芯片和酶联免疫分析纸芯片。微流控纸芯片发展到如今已经出现了多种分析传感方法联用，并与各种仪器装备、与便携式仪器设备以及家庭电子用品（智能手机）相结合的发展趋势[14]。作者团队研制了一种基于分子印迹荧光传感的旋转式微流控纸芯片平台，用于快速检测环境有机污染物。该工作通过分步化学偶联反应，将荧光传感与分子印迹技术结合在旋转式纸芯片上，形成适配荧光光谱仪的纸芯片器件，成功分析了海水中两种酚类污染物（4-NP和TNP）[15]。
四、纸基微流控芯片在临床即时诊断中的应用
1. 血液样品前处理：血液中含有众多体征信息，血液分析是临床最常见的诊断方法。除对血细胞的分析外，大多数的待测物存在于血浆/血清中，分析时需要对血液样品前处理，主要为将血细胞与血浆/血清分离，提取血浆/血清。目前，常用的实验室方法为离心法，离心机成本较高、需外部供电、难以处理微量血液，限制了实验室外的灵活检测。
纸纤维结构多孔亲水，适合形成过滤方法。血细胞或经凝集后的血细胞，无法通过纸纤维空隙，实现红细胞与血浆/血清的过滤分离。Yang等开发了一种嵌入凝集抗体（抗A、抗B）的纸基装置[16]。加入全血后，红细胞聚集并被固定在纸基内，而血浆则流向周围的检测区。Ge等在折叠纸芯片的免疫测定中使用抗D抗体凝集红细胞来分离血浆，凝集方法展示了有效的血浆分离[17]。然而，特定抗体无法适用于所有的人类血型。此外，如果每次检测加入多种抗体，检测成本将会很高。Nilghaz和Shen开发了一种盐功能化的纸基分离装置，在加入全血时产生渗透压梯度，随后诱导红细胞凝集。利用盐溶液，该方法更加廉价[18]。
建立纸基手动离心功能，也是一种可以实现的血液离心方案。Bhamla等报道了一种低成本，重量轻的纸基手动离心机，该离心机无需电力即可达到125000rpm的转速[19]。如果将纸基离心机融合分析方法，构建一站式的血液分析平台对临床应用意义重大。作者团队研发了一种完全集成的纸芯片诊断系统，该纸芯片系统能够离心全血样品获得血清，并通过夹心免疫分析法比色分析肿瘤标志物，最终通过手持式数字终端采集纸芯片数据信息[20]。该纸芯片完全集成了手动离心和免疫分析过程，使用该纸芯片成功定量分析了人血中的癌胚抗原和甲胎蛋白。这项研究为资源有限环境下的医学诊断提供了可行方法，单个纸芯片的制造成本低廉，只有3元左右。
2. 疾病标志物分析：人体的血液、尿液和唾液等液体样品中往往存在可以指征生命状态的生物标志物。其中，蛋白质、糖类、代谢物和一些化合物等特征生物标志物的存在，可以提供疾病的早期信息。在疾病标志物的临床即时检测方面，纸芯片作为工具被广泛研究。
Whitesides团队第一次提出的纸基微流控芯片，就是用来检测尿液中的葡萄糖和蛋白质，随后研发了用于尿酸和乳酸检测的纸芯片[21]。此外，Vella等开发的纸芯片能够通过从指尖采集的几滴血来测量肝功能的酶指标，主要对碱性磷酸酶和天冬氨酸氨基转移酶实现了检测[22]。Yao等研发了一种纸芯片装置，使用电极和电化学发光，通过直接应用于舌头来测量唾液样本中的乳酸[23]。纸芯片还被研究用于检测癌症生物标志物，在肿瘤筛查、治疗观察和跟踪复发方面具有很大的应用价值。Wang等研发的纸芯片装置集成了磁力驱动的阀门和时间控制器，用于检测不同浓度的癌胚抗原，利用基于HRP-O-苯二胺-H2O2系统的化学发光免疫分析反应缩短了检测时间[24]。
作者团队在构建疾病生物标志物的纸芯片方面做了一些工作。酶联免疫吸附分析法是目前广泛应用于疾病生物标志物分析的临床和实验室检测技术。利用活页式移动阀方法融合酶联免疫分析构建纸芯片，实现人血样本的新型冠状病毒SARS-CoV-2受体结合域（RBD）特异性IgA/IgM/IgG抗体分析，对早期发病患者的敏感性高于传统的IgM/IgG检测（99.7% vs 95.6%），利用该方法探究了各抗体及组合在早/晚期新冠患者诊断中的特异性和灵敏性[25]。与生物抗体相比，分子印迹聚合物具有成本低、制备方便、耐储存、选择性强等独特的性能，可以作为一种人工抗体，受到研究者的广泛关注。在此基础上我们提出了一种基于表面生物分子印迹技术的新策略来制造微流控纸芯片，通过纸基移动阀和折纸的方法，用于选择性和灵敏性的临床检测癌胚抗原[26]。移动阀控制纸芯片不同层的通道，提高了纸芯片材料合成和分析过程的使用性能。模板预先修饰于纸芯片工作电极区域，随后用电聚合多巴胺的方式在工作电极表面形成分子印迹层。从合成到分析结果产生，整个过程都在纸芯片上完成，最大限度的减少了外部发生过程。此外，核酸适体作为传感反应元件也被构建于纸芯片上，我们构建了一种自供电纸芯片，并将其用于凝血酶的检测。集成移动阀能够在微流控纸芯片上方便地控制流体，控制多步的核酸适体反应，在芯片上构建的电容器结构中形成电压，用家用的万用表即可实现数据的读取[27]。
这些研究表明，用纸基微流控芯片检测疾病生物标志物，在样品制备和检测方法上都相对成熟，虽然在临床中还没有大量使用，但未来可能为现有临床方法提供廉价和易于使用的替代品。
3. 病毒检测：诸多疾病都因病毒而起，包括狂犬病、登革热、肝炎、埃博拉、艾滋病、禽流感、SARS、MERS等等。病毒载量可影响疾病的严重程度。除急性疾病外，一些病毒可导致慢性感染或癌症，如乙型和丙型肝炎。病毒通过受感染的携带者、接触受污染的表面和接触气溶胶病毒颗粒而传播。目前，全世界每年有三分之一的死亡是由病毒感染造成的。最近，一种新型冠状病毒（SARS-CoV-2病毒）引起肺炎大流行，导致数百万人死亡，并波及了全世界的经济发展。病毒分离、基于免疫荧光的显微镜、酶联免疫吸附试验和核酸扩增技术（如聚合酶链反应（PCR））通常用于病毒检测[28]。尽管这些技术的灵敏度很高，但需要进行费力和耗时的步骤，而且依赖于昂贵的试剂/设备。因此，开发快速、低成本的纸基病毒检测平台，可以及时控制疫情。
纸基微流控芯片上病毒的常见检测方法研究主要分为两类，一类是基于抗体/抗原识别的作用对病毒检测，另外一类是基于病毒核酸扩增的核酸检测。第一类方法关键在于抗体等生物识别元件在纸基上的固定，Fabiani等开发了一个基于磁性纳米颗粒的电分析免疫传感器来检测SARS-CoV-2[29]。电极是在透明柔韧的聚酯纤维通过丝网印刷而成，并用碳黑改性。SARS-CoV-2蛋白（S蛋白和N蛋白）的抗体，作为捕获抗体被固定在MNPs上，碱性磷酸酶标记的抗体为检测抗体，形成免疫夹心法。碱性磷酸酶与萘基磷酸酯作用生成酶促产物，磁纳米颗粒提供预浓缩的作用，使电极表面密切接触酶促产物，从而提高了灵敏度。采用电化学差分脉冲伏安法，对未经处理的唾液中的S和N蛋白进行分析，检测时间30min，得到S和N蛋白的最低检测限分别为19ng/ml和8ng/ml。
它与基于免疫分析的方法不同，基于核酸扩增的方法不是对病毒表面或宿主细胞产生的抗原或抗体的检测。病毒病原体含有基因组，由于其特定的遗传信息，可以作为病毒存在的标志。基于互补碱基配对规则，设计特定引物来检测目标核酸。由于DNA-DNA或DNA-RNA之间的特定反应，DNA/RNA探针作为识别介质来构建识别方法[28]。核酸扩增方法包括热循环扩增、等温扩增、滚环扩增等，以提高检测病毒核酸的浓度。其中，等温扩增（LAMP）步骤简单，表现出较强的扩增能力，产生的信号具有更好的特异性。因此，LAMP在纸基病毒检测系统中表现出较好的适用性[30]。Seak等人开发了一个纸基装置，用于从人血清中检测寨卡、登革热和基孔肯雅病毒的一体化分子诊断[31]。将采样、提取、扩增和检测结合在一枚纸芯片上，成功检测了含有5400份寨卡病毒、5700份登革病毒和4500份基孔肯雅病毒的血清。
纸芯片在病毒检测中有许多优点，在一些应用中，比色侧流式试纸用于病毒的即时检测已变得较为常见，由于在标记物和流体控制方面的改进，其灵敏度和特异性都有所提高。
4. 细胞分析：通过对人体内某些细胞的分析可以诊断一些疾病。例如，确定恶性突变的细胞可指征癌症，白细胞的增加或减少表明感染或免疫疾病，一些血液疾病（贫血、多血症和溶血）可以根据红细胞的结构或功能诊断[32]。
纸基微流控芯片可以提供捕捉和识别这些细胞的平台，来辅助疾病的早期诊断。Berry等报道了分析血液学指数以及红细胞体积与总血量比率的纸基装置，可用于诊断贫血[33]。Hegener等研发纸基装置在单细胞水平上分析了红细胞，用于检查病人血液的凝固情况。该方法被用来监测单个红细胞的迁移距离和凝固度，可辅助诊断诸如血友病等疾病[34]。对于癌细胞定性，最常规的方法是流式细胞仪来区分性状，但流式细胞仪成本较高，无法脱离实验室使用。Liang等研发的纸芯片能够检测三种癌细胞（MCF-7、HL-60和K562），通过设计不同颜色的荧光发射的介孔二氧化硅纳米颗粒/量子点标记的核酸适体，识别三种不同的癌细胞系。材料接触到对应细胞，标记探针就会发出强烈的荧光，检测目标细胞的存在[35]。作者团队将纸基微流体与3D打印芯片结合，研发了一种综合微流控芯片用于细胞的分析。在3D打印微流控芯片的顶层集成了“圣诞树”结构，以产生连续的浓度梯度，底层包含了纸基芯片作为细胞培养区域。两层结构使浓度梯度形成层与细胞培养层分离，从而简化了在微流控芯片中的细胞种植，并确保细胞留在培养室中并且不会阻塞微流控通道。应用该混合平台，研究了硫化氢对癌细胞的影响。持续暴露于低浓度的硫化氢中会诱导细胞凋亡，从而抑制癌细胞SMMC-7721的增殖[36]。
纸基微流控芯片在一定程度上使细胞分析更加便捷，但可能的基质中其他物质的干扰，其准确性和稳定性不够，仍需通过仪器方法进一步确认。因此，将纸芯片作为细胞分析的辅助工具存在一定的发展前景。
五、纸基微流控芯片技术临床应用前景与面临挑战
近年来，纸基微流控芯片在即时检测中发展迅速。纸芯片制造可利用多种新型疏水材料，方法多样化，提升了多种溶剂环境的适用性，具有实现商业化的批量制造的潜质。通过通道设计和流体控制，复杂的分析方法过程也可以在纸芯片上实现，新型传感材料的出现也促进了纸芯片传感的多样性。在临床应用中，从分子诊断到人体细胞分析，纸芯片作为廉价便捷的即时分析平台被逐渐开发利用。然而，纸芯片作为普适性的临床诊断平台还面临诸多挑战。（1）由于纸纤维微观结构的不均匀性，会在一些分析方法中产生噪声，这会影响到临床上定量分析的精准度；（2）除比色分析可以依靠人眼颜色辨别，其他纸基分析方法还需要配合相关便携化仪器，搭载纸芯片的仪器还需要进一步研发；（3）对于现场即时分析的最广泛应用场景是家庭，纸芯片如何融合远程医疗、人工智能和大数据，让家庭诊断成为现实，从而减轻医疗资源的浪费，是未来的发展的挑战，也是发展趋势。
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