生物传感技术在即时分子诊断中的最新进展和面临的挑战

王汉明，分子生物学博士、高级研究员。广州万孚生物技术股份有限公司分子研产总监助理。理学博士，于2013年获“本科毕业免试直接攻读博士学位”资格，进入北京大学攻读分子生物学博士学位，方向为复杂疾病的分子机制。在校期间表现优异，曾获“国家奖学金”、“北京大学五四奖学金”等奖励，发表SCI论文5篇，精通分子生物学技术，尤其是生物大分子互作。2020年9月加入万孚生物中央研究院，任高级研究员，承担了诸如平台建设、产品开发和战略投资等工作，现阶段主要工作聚焦于核酸快检技术。

钟玥，理学硕士、助理研究员。现任职于广州万孚生物技术股份有限公司，生物化学与分子生物学专业，研究方向为慢阻肺、肺动脉高压。2020年毕业于广州医科大学-中国科学院广州生物医药与健康研究院联合生命科学学院，硕士期间研究方向为RNA甲基化m6A参与慢阻肺发病机制研究。毕业后曾就职于广州呼吸健康研究院任科研助理，研究内容为慢性血栓栓塞性肺动脉高压发病机制研究、丹参酮治疗新型冠状病毒机制研究。2021年6月至今主要从事CRISPR方向军特药新冠项目的研发以及其他呼吸道传染病相关试剂盒研发。

近年来，分子诊断技术呈现出快速发展的趋势，随着临床端的全面推广，其在感染性病原微生物的快速甄别和复杂疾病的精准医疗中显现出巨大优势；相比于传统检测手段，它为疾病的早期确诊、用药指导和复发监测提供了更加快速可靠的依据。在众多分子诊断产品中，依托于生物传感器的即时分子诊断产品具备快速灵敏、高效特异和便携易用等优势，因此备受关注。本文将系统性的回顾在分子诊断产品中广泛应用的生物传感技术，并对其发展进行展望。

一、生物传感器技术概览

生物传感器（biosensor）是指对生物物质敏感、并具备将其浓度转换为光、电信号的检测模块，通常由识别元件、转换器、信号放大器三部分组成[1-2]。其中生物识别元件的作用是识别待测物质，主要包括抗体、酶、核酸、细胞等生物物质；也可识别类似于生物物质的合成物，如适配体、多肽、MIPs聚合物（molecularly imprinted polymers）[3]。信号转换器是将生物敏感元件对目标分子的识别转换成不同的信号。生物酶催化特定的物质发生化学反应，转换成相应的电信号；或者生物抗体捕获特定的抗原，然后通过标记的荧光来转化成光信号等。信号放大器是指生物信号转换为光电信号后，为增强信噪比的一类元件，比如光电倍增管。生物传感器与物理/化学传感器的主要区别在于生物传感器的识别元件是生物物质与仿生物物质[4]。

生物传感器可以按识别物质类型来分类，比如免疫传感器、酶传感器、核酸传感器等。如果是以抗体为识别单元的，可称为免疫传感器[5]；如果是以酶为识别单元的，可称为酶传感器[6]，血糖测试条就是一个酶传感器；如果以核酸作为识别物质，则叫核酸传感器[7]。

生物传感器也可以根据信号转换单元来分类。信号转换单元可以分为物理信号转换器与化学信号转换器。常见的物理转换方法是基于光学、场效应、质量、折射率、介电特性或电阻率的测量。常见的化学转换方法为电化学，电化学发光等[6]。

二、即时分子诊断技术产品

由于新冠肺炎疫情，全球范围内的分子诊断需求显著提升，而能满足“即时、即地、即检”的分子诊断产品对疾病的预防控制、快速诊断及公共传播限制起到了重要的作用[8-10]，见表1。在新冠疫情中，相比于耗时过长、操作繁琐和极度依赖于实验室的传统检测手段，依托于生物传感器的分子检测具备快速灵敏、高效特异和便携易用等优势，尤其是随着分子生物学、纳米技术、光学、电化学等领域融合，越来越多的生物传感器新技术出现，诸如基于场效应晶体管、基于荧光的生物传感器、表面等离子体共振（SPR）传感器和电化学生物传感器[11]等被应用于核酸检测，不仅可实现快速精准的核酸检测，其制造工艺日益成熟，元器件成本也得到了大幅降低，这使得在诸如社区、军队、冷链和诊所等无专用设备的场景下开展分子诊断成为可能，极大程度的推动了分子诊断重心下移。

表1. 新冠疫情中的即时分子诊断产品

三、生物传感器技术在即时分子诊断中的应用

即时分子诊断产品的生物传感器通常包含5部分：靶、寡链核酸探针、传感工具、传感器和信号读出装置。靶可以是DNA、RNA；适配的探针可以是寡链核酸、抗体、酶、适配体、超分子、小分子等；传感工具有Cas酶、纳米管、纳米颗粒、水凝胶、石墨烯等；通过使用电化学、光学、表面等离子共振、场效应等方法的传感器转化为可读出的信号；最终通过侧向免疫层析、电信号、比色分析或智能手机处理信息的方式读出结果。

以万孚的BoxArray产品为例，样本在该产品的一体化卡盒中经过了核酸裂解释放、提取纯化、预扩增、二次扩增、靶向杂交捕获和荧光信号读出等步骤，将核酸分子转化成了光学信号，在3小时内至多实现30个靶标的一次性检测，从而可在临床上将脓毒血症的诊断时间由12小时缩短至3小时，对危急重症患者的精准用药和及时救治有着极其重要的意义。

相信随着生物传感器的迅猛发展，在未来几年，即时分子诊断产品将会更加精准高效、快速易用，并提供更有价值的临床信息。

四、即时分子诊断中的生物传感器技术类型

1. 光学：光学生物传感器是最常见的生物传感器类型之一，在环境、生物医学、诊断等不同领域具有良好的应用前景。光学生物传感器主要作用是监测光与生物识别受体的相互作用，利用各种参数进行检测，如光散射、荧光、偏振、吸收、振幅或反射指数的变化。可通过荧光、比色、表面等离子共振、表面增强拉曼散射等方法对分子信号进行转换读出。

（1）基于核酸扩增的荧光检测：目前大部分分子诊断试剂依赖于荧光检测手段。近年来，各种核酸扩增方法的飞速发展为低丰度样本分子信号的读出提供了一种简单、高效的解决方法。荧光检测主要代表的方法学有PCR、RPA、LAMP、CRISPR等，均需要通过核酸扩增的方式，对样本信号进行放大。信号探针结合靶标分子序列后，工具酶可通过对结合的探针进行切割，从而使得探针断裂，荧光基团与淬灭基团脱离，在特定波长激发光的作用下发出较强的荧光信号。该方法需要通过光学仪器对荧光信号进行读取，具有灵敏度高，特异性强的特点[12]。

（2）基于单分子成像的荧光检测：单分子荧光成像是最先进的分析技术之一，由于其简单、快速、高灵敏度、低样品消耗和可视化能力等显著优势，已被广泛应用于生物传感领域。一类是在外力作用下研究单分子活动，通常通过原子力显微镜、光镊或磁镊将力施加到单个分子上。另一类就是用荧光显微成像观察生物系统中单分子活动。荧光显微成像是生命科学领域观察生物体结构的经典方法。这其中，用荧光探针标记，检测和分析单个分子的单分子荧光成像技术，能够帮助科学家们在不破坏生命体正常生理状态的情况下，清晰地观察到单个分子的活动[13]，该方法为临床研究诊断提供了重要帮助。

（3）基于表面等离子体共振的光学传感器：等离子体共振是一种现象，当自由电子在光刺激下在金属表面振荡时发生。当入射光的频率与表面电子在其正核的引力作用下振荡的频率相同时，就可以实现表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）。在各种生物传感和生物成像方法中，都采用了SPR，通过增加荧光信号与背景噪声的比值，有效地提高荧光标签的亮度。这种增强和限制光在两种介质之间的界面使得等离子体平台非常适合制造POC诊断设备[14]。

（4）基于表面增强拉曼散射的光学传感器：表面增强拉曼散射，用通常的拉曼光谱法测定吸附在胶质金属颗粒如银、金或铜表面的样品，或吸附在这些金属片的粗糙表面上的样品。尽管原因尚不明朗，人们发现被吸附的样品其拉曼光谱的强度可提高103-106倍。主要用于吸附物质的状态解析等[11, 14-15]。1974年，Fleischmann等人发现吡啶的非弹性散射在与银电极密切接触时大大增强。自那时起，SERS光谱由于其精度高、拉曼光谱宽度窄、分析时间短、易于利用材料进行表面修饰等优点，已显示出它是一种有前途的超灵敏检测分析工具，未来可能发展出更加多功能SERS传感器。

（5）基于水凝胶的光学传感器：结构色，又称物理色，是由入射光的衍射和反射产生的特定结构所产生的，产生结构色的结构通常由光子晶体组装而成，光子晶体由空间排列的周期性介电材料组成，这种材料可以独特地改变光的传播，从而在特定波长产生高效反射。其中水凝胶被认为是重要的传感材料，因为它们易于发生化学修饰，与生物分子交联，并能对声学、光学、电磁、pH值和其他类型的刺激作出反应。由于生物传感器与计算机技术和水凝胶相结合在现有的生物分析方法上具有许多优点，因此在这一领域具有很大的前景。目前，已报道过的一些基于水凝胶的各种生物传感器，有潜力发展成为检测多种类型的生物标志物的POC设备，可检测如葡萄糖、凝集素蛋白、激酶、循环肿瘤细胞、有害离子、真菌毒素、白色念珠菌和核酸。这些创新性的研究证明了基于结构色的方法学在开发新型POC器件中的有效性。然而，目前的水凝胶生物传感器都被设计成只将探针分子固定在水凝胶中，这些基于水凝胶的生物传感器，主要通过分子间键合从而使水凝胶的体积或折射率发生巨大变化，因此该方法严重限制了可检测的分析物类型，使其不适合在POC诊断中更广泛地使用[16]。

（6）基于石墨烯的光学传感器：检验医学领域的快速发展离不开纳米生物传感器等新技术新方法的创新与突破。近年来,场效应晶体管（Field Effect Transistor，FET）生物传感器的前端开发与临床应用研究不断地为众多生物标志物的检测与疾病诊断带来新途径与新思路，极具发展潜力与应用前景。场效应晶体管生物传感器是一种包含源级、漏极和栅极的三端型器件，其主要工作原理是通过对栅极施加栅压来调控源漏极间的电导。在检测中，FET通过直接感应目标分析物本身所带的电荷来引起即时的电学响应，因此可以实现免标记检测和动态实时的分析。除此之外，FET生物传感器还具有灵敏度高、体积小、功耗小、噪音低、易于集成等优点，被认为是下一代医疗诊断平台的理想候选者。石墨烯是一种呈蜂窝状结构的二维碳基纳米材料，具有高载流子迁移率、大体表比、强导电性、双极性场效应和良好的生物相容性的优点。以石墨烯为导电材料的场效应晶体管生物传感器可以在生物分子的识别与检测中发挥独特的优势，是应用最广泛的生物传感器之一。石墨烯及其衍生物是由sp2原子组成的二维层状材料，具有较大的比表面积，可为生物分子检测提供大量的附着位点。此外，氧化石墨烯、还原氧化石墨烯的表面都有含氧官能团，经过化学修饰，可以分散在各种溶剂中，具有良好的生物相容性[17]。

2. 电化学：电化学生物传感器可识别受体和传感器之间的结合产生电化学信号，可以通过电化学技术，如伏安法、阻抗光谱、电位法或安培法测量。与其他类型的传感器相比，它们具有低成本、小型化能力、便携性、易于使用和高灵敏度等优点。因此，以前已经开发了几种电化学生物传感器，用于各种传染病的POC诊断。

例如电化学DNA传感器主要检测核酸的杂交反应，它以电极为换能器，单链或基因探针为敏感元件，与识别杂交信息的电活性指示剂共同构成。在适当的温度、pH和离子强度下，被固定在电极表面的DNA探针分子能与目标物选择性杂交，形成双链DNA，导致电极表面结构发生改变，从而改变电极的信号传导，通过检测电信号的变化来达到检测目标物或特定基因的目的。电化学核酸传感器技术难度高，是未来POCT检测的重要发展方向，代表企业有美国的Genmark[11, 18]。

五、结论与展望

随着人们对各种人类疾病的理解不断加深，以及多领域交叉进步，前沿研究现在不仅专注于开发感兴趣的检测生物分子的方法，更重要的是设计可用于检测含有多种生物分子的一类靶标的多功能方法。这些生物传感器的快速发展，实现了从真实临床样本中定量分析靶标分子的检验需求，并强有力地促进了新兴医疗行业更多地参与临床POC领域的进一步发展。在本文中，我们列举了各种生物传感的检测方法。目前已经报道的几种基于光学的生物传感器，如用于使用表面等离子体共振、荧光和比色检测等检测方法，这些光学方法大都具有良好的灵敏度。然而，高成本和集成光学传感器在微型平台的POC诊断仍然是主要挑战。电化学生物传感器通常被认为是具有低成本和高灵敏度的方法。因此，目前已经开发了的一些电化学生物传感平台，用于检测核酸时，在灵敏度、准确性、选择性和可移植性方面显示出良好的结果。石墨烯、碳纳米管、金纳米颗粒等纳米材料与生物传感器件的结合也具有重要意义。新纳米技术概念的集成，如微流体、CRISPR和带有生物传感器的便携式设备，已经彻底改变了该领域。开发的生物传感器使得分子检测不仅仅局限于大型医院和检测机构，还将在未来更多的满足人们对于在灵活场景中即时、即地、即检的需求。

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