新型生物传感器在冠状病毒超快速检测中的应用
唐亚楠，工学博士，现就职于复旦大学高分子科学系、聚合物分子工程国家重点实验室。毕业于日本国立新泻大学，国家高层次海外人才公派留学，主持完成日本文部省国际援助项目，担任教育部留学服务中心创新创业大赛优胜项目的负责人。研究方向为高分子材料的制备、传感器件的应用。
魏大程，研究员，博士生导师。现任职于复旦大学高分子科学系、聚合物分子工程国家重点实验室，担任国家重点研发计划、国家自然科学基金、军科委等多项目的项目负责人，入选巴渝学者讲座教授、中国高被引学者、全球前2%顶尖科学家。研究方向为晶体管传感器及其在病原体检测领域的应用，发表学术论文100余篇，他引7000余次。
马学军，研究员，博士生导师。主要从事病原体核酸检测新技术平台的研发和应用研究，主持研发国内外首个新冠病毒核酸荧光RAA等温扩增快速检测试剂盒及配套仪器，获医疗器械注册证，现任中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所中心实验室主任，中国医促会分子诊断学分会主任委员，国家重点研发项目“病原多场景实时检测关键技术平台的建立和应用”首席科学家，《中华实验和临床病毒学》杂志执行主编等。
【摘要】新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒引起的传染病。目前存在的变体具有更强的传播性、更大的潜在致病性以及逃避宿主免疫的能力[1，2]。定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）核酸检测是新冠肺炎诊断的金标准，然而，qRT-PCR需要耗时的纯化、扩增过程、昂贵的仪器和专业技术人员，大大降低了检测效率，这些因素严重制约了临床样本进行即时高效的大规模检测[3]。基于纳米材料的新型生物传感器具有选择性高、检测速度快、便携性好的特点，本文介绍了生物传感器在新型冠状病毒超快速检测中的应用。同时我们对未来开发高度准确、便携的诊断技术发展趋势进行了展望，以期为研究人员提供研究思路。
【关键词】新型冠状病毒；新型生物传感器；快速检测
新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒引起的传染病。随着不同的病毒变体在大规模人群中持续发生，目前存在的变体具有更强的传播性、更大的潜在致病性以及逃避宿主免疫的能力，尤其是无症状感染者的出现使得疫情形势更加严峻[1, 2]。定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）核酸检测是新冠肺炎诊断的金标准，然而，qRT-PCR需要耗时的纯化、扩增过程、昂贵的仪器和专业技术人员，大大降低了检测效率，这些因素严重制约了临床样本进行即时高效的大规模检测[3]。故开发高灵敏超快速（检测时间10分钟内）的SARS-CoV-2检测方法是疫情防控的关键，新型的生物传感技术具有便捷、高灵敏性、无需扩增、检测速度快的优点，基于纳米材料的新型的生物传感器因其独特的物理化学性能更有利于构建高性能的生物传感器，具有选择性高、特异性强、响应性好的特点，检测的分析物包括了新冠病毒抗原、抗体、核酸及完整病原体[4-6]。本文介绍了基于光学、电化学、电磁学、可视化的生物传感器在新型冠状病毒超快速检测中的应用。同时我们对未来开发高度准确、便携的诊断技术发展趋势进行了展望，以期为研究人员提供研究思路。
一、基于光学的生物传感器
光学传感技术是利用光与生物识别组件之间的相互作用实现其检测目的。光学传感器由于灵敏度高、特异性强和操作简便，成为最常用的生物传感器之一[7-9]。
1. 表面等离子共振传感器SPR（Surface Plasmon Resonance，SPR）：通过金属表面目标分子和等离子共振波相互作用引起的折射率的变化来实现目标物质的检测，具有便捷、实时、无标记以及良好的重复利用性能等优点。SPR技术主要分为传播型表面等离子体技术（简称SPR）和局域型表面等离子体技术（Local-Surface Plasmon Resonance， LSPR）[10-12]。
Taka-aki Yano等人报道了Au纳米粒子三明治结构，通过制备了Au基底-新冠病毒N蛋白-二抗修饰的Au纳米粒子，利用SPR技术检测新冠病毒，实现了新冠病毒N蛋白的灵敏度fM水平的检测[13]。它与SPR相比，局域SPR（LSPR）是发生在金属纳米结构上的一种现象。限制在金属纳米结构中的电子因入射光的电磁场诱导而集体发生电荷振荡，导致了在紫外可见（UV-VIS）波段内光的吸收[14]。Huang等人开发了一步法蛋白特异的纳米等离子体共振传感器，可以在几乎没有任何样品制备的情况下超快直接的光学检测SARS-CoV-2病毒颗粒。在15分钟内一步检测到低至370vp/mL。通用酶标仪和智能手机连接设备上显示测量的结果，实现了在常规临床环境和资源有限的环境下便携式的低成本超快检测[15]。
2. 荧光生物传感器（Fluorescence biosensors）：作为疾病现场检测的常用方法之一，具有低成本、高灵敏度、易操作的优点。构建荧光生物传感器中重要的一部分是荧光分子，包括荧光染料和荧光纳米材料。荧光生物传感检测主要基于荧光能量共振转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET），一般是指如果受体的吸收光谱与供体的发射光谱有一定的重叠，两个荧光基团的距离小于10nm时可以观察到荧光能量由供体向受体转移的现象[16, 17]。Liu等人[18]开发了一种开关型荧光生物传感器用以检测核酸生物标志物。由于FRET和光诱导电子转移，使得当前状态为荧光“关闭”。当荧光探针特异性结合目标物后，刚性双链DNA结构就会从锆卟啉金属有机骨架纳米颗粒表面释放出来，导致荧光“开启”状态。通过观察荧光的开关状态从而实现在30分钟内对核酸生物标志物的超快、超灵敏检测。常用的荧光纳米材料有碳量子点、石墨烯量子点、二硫化钼量子点、金属纳米簇等，具有更稳定的荧光性能和更高的荧光特性等特点[19, 20]。此外，碳量子点的合成方法简单多样，成本低，绿色无毒且具有优异的生物相容性，因此受到了广泛的关注。
二、基于电化学的生物传感器
电化学传感器作为一种便捷、超快的新型传感平台，是新冠病毒抗原、抗体、核酸的临床诊断中最强大的替代工具之一。
1. 电化学传感技术：这主要是通过检测电性能的变化，如电流或电位，当反应系统中加入目标分子后引发一定的电化学反应，从而产生物理、化学等信号，将目标分子的信息转换成电信号，最终实现对目标物的检测[21-23]。电化学生物传感器由于其灵敏、超快、易操作的特点，近年来有了重大的发展。目前已经开发了许多利用电化学特性的策略检测生物标志物，如氨基酸[24]、病毒[25]、蛋白质[26]、核酸等[27]。经常使用的固体电极主要是金属，金属纳米颗粒或者纳米结构的金属电极具有高的比表面积，具有易于修饰和标记的特点，能够提高电化学传感器的灵敏度、特异性以及准确率。Chaibun等人[28]开发了一种基于等温滚动循环扩增技术（RCA）的超灵敏电化学生物传感器，用于超快检测SARS-CoV-2。其中，RCA的扩增子可以与被氧化还原基团标记功能化的探针进行杂交，进而利用电化学生物传感器检测到。该传感器可以在不到2个小时内检测到1copy/μL的病毒基因。
2. 场效应晶体管生物传感（FET）技术：这是通过半导体沟道及界面附近外界刺激产生的电信号变化以实现检测应用，是一种很有前途的生化传感平台，具有高灵敏、高特异性和无需标记等优点，并且能够与微电子系统集成，实现针对护理点的检测[29, 30]。通道材料的固有电子特性和生物识别能力决定了生物传感器的性能，其包括灵敏度、选择性和稳定性[31, 32]。二维敏感材料展现出独特的低维特性如高比表面积、高信号传导效率，可以有效提升FET传感器的检测性能。石墨烯场效应晶体管（GFET）传感器通过传导和监控带电分子、离子等吸附以及脱附过程中引起石墨烯传感沟道导电性发生变化实现对痕量物质的检测[33]。Seo[34]等报道了一种2019-nCoV刺突蛋白抗体功能化的石墨烯FET生物传感器。标本中S蛋白与传感器表面的抗体特异性结合，因而可引起石墨烯表面电荷密度的改变，最终通过监测反应前后的电学信号改变即可实现检测。
Wei团队[35]提出的分子机电系统（MolEMS）在外电场驱动下精准调控分子识别和信号转化的过程。可直接从电学响应中读出检测结果而不需要复杂操作的微型装置。新冠病毒核酸的片段与组装到石墨烯场效应晶体管上的分子机电系统会发生特异性作用，分子机电系统“捕捉”住病毒核酸，通过外电场的驱动使得柔性适配体悬臂发生运动，灵敏度显著提升。同时一种液栅修饰的石墨烯场效应晶体管也被该团队报道，研究发现，栅极修饰的晶体管较传统导电沟道修饰策略具有更大的信号传导效率，能够实现痕量目标物在传感界面的富集。该传感器实现了诊断时间约80秒的高灵敏新冠核酸检测，极大地提高了核酸检测的效率[36]。基于场效应晶体管传感平台该团队开发了多抗体组合修饰的石墨烯晶体管传感器，该传感器的检出限达到3.5×10-17gmL-1量级实现了检测时间小于1分钟新冠病毒抗原的混检，且与qRT-PCR结果的符合率为100%，成功筛查出全部阳性病例展现出高准确性[37]。这种检测芯片通过半导体加工工艺制造，成本相对较低，方便集成到便携式系统中，为现场和即时检测新冠病毒提供了很大的希望，使人们能够在海关、车站、诊所、家中甚至互联网上监测感染状况，减少交叉感染的风险。
3. 其他超灵敏电化学生物传感器：伏安/安培生物传感器具有高灵敏度，是最常使用的电化学传感器。通过工作电极上电化学氧化和还原引起的电解产生的电流来实现对目标物质的检测。在伏安生物传感器中，工作电极施加的电势是以给定的速率递增的方式[38]。Alafeef等人构建了一种快速（≤5mins）、低成本、容易操作的具有定量性质的电化学传感器用于检测病毒的RNA，临床样品中检测的灵敏度为6.9 copies/ml[39]。
阻抗生物传感器是另外一种常用的生物传感器，具有高灵敏度和低振幅的优点，是通过电化学阻抗谱（EIS）来实现目标物质的分析[40, 41]。Peng等人提出了一种基于阻抗法和伏安法的高灵敏度的电化学传感器来检测新冠病毒的RNA，该传感器对RNA的检测限可以达到26fM。在该电化学传感器工作时，若存在目标RNA，则会触发催化物质和引起末端脱氧核苷酸酶介导的DNA聚合。从而导致大量的单链DNA的产生，这些带负电荷会由于静电吸附和大量带有正电的电化学活性分子结合，因此放大电化学信号。该研究团队基于提出的电化学传感器来检测临床的新冠病毒样品，该传感器显示出高度的稳定性[42]。
电位生物传感器使用带有两个参比电极的电化学电池，在产生可忽略不计的电流时测量电极上累计的电流[43, 44]。对于生物检测，电位传感器通常使用酶来催化化学反应，并在电极附近产生离子。电位生物传感器具有体积小、响应快、成本低、抗干扰能力强等优点，具有成为新冠病毒现场检测方法的潜力。
磁阻生物传感器是一种基于表面的技术，它对于磁纳米颗粒接近于传感器表面产生的漏磁场非常敏感，从而实现将带有分析物的磁纳米颗粒的结合转换为可读的电信号[45, 46]。磁阻生物传感器中的磁纳米标签需要在不损失顺磁性性质的同时，产生较高的磁矩。
磁颗粒光谱平台是一种基于体积的检测技术，它通过对磁纳米颗粒的磁动态响应直接检测[47, 48]。Wu等人构建了一种磁颗粒光谱平台，通过磁颗粒之间的结合状态引起的高次谐波的变化进行目标物质检测。在磁纳米颗粒上修饰N蛋白或者S蛋白的单克隆抗体，当体系中存在待检测的N蛋白或者S蛋白时，磁纳米颗粒作为探针来结合目标物质，形成纳米颗粒团簇，从而产生一定的磁响应。该检测平台是一种基于纳米颗粒团簇的一步式、免洗的磁纳米传感平台，具有优异的检测灵敏度，对N蛋白的检测限为12.5nM，对S蛋白的检测限为1.56nM[49]。
核磁共振平台是利用磁性纳米颗粒作为对比度增强剂，从而造成局部磁场的不均匀性，监控周围水分子的频率变化。因此，高灵敏度的核磁共振平台的设计本质上依赖于合适的磁纳米颗粒的应用。对该类传感器而言，需要具有高的横向磁豫的磁纳米颗粒[50, 51]。Schoenle等人报道了一套SARS-CoV-2 RBD的序列特异性的骨架归峰，并证明了生物分子的核磁共振光谱化学位移扰动映射图能够成功的超快识别RBD特异性的抗体的分子表位[52]。通过核磁共振光谱的化学位移扰动映射图，并结合其他分子检测技术，可以帮助我们准确地认识到RBD和抗体之间的相互作用，对于抗体的筛查以及进一步疫苗的研制具有重大的意义。
四、可视化的生物传感器
比色生物传感器（Colorimetric biosensors）具有制备简单，读数容易，成本低且便于携带的优点。比色法检测可以通过过氧化物酶或者类过氧化物酶的纳米材料的氧化，纳米材料的团聚或者添加染料指示剂来实现。近年来，类过氧化物酶纳米材料和纳米材料的团聚被广泛地用于比色生物传感器的构建中，如金纳米粒子、铂纳米粒子、银纳米粒子、磁性纳米粒子等[53-56]。其中，金纳米粒子因为其制备简单、易于修饰、纳米粒子具有强的表面等离子体共振应用最为广泛，且通过粒子间的团聚可以引起迅速的颜色变化。
基于比色法的生物传感器最大的优点是可以通过肉眼来判断体系中是否存在目标物质，非常适合居家检测的应用场景。Ventura等人基于Au纳米颗粒团聚引起的颜色变化来检测新冠病毒[57]。当存在目标病毒时，金纳米颗粒由于抗原-抗体的结合聚集在病毒的表面从而造成Au溶胶颜色的变化。该方法能够在3mins内进行超快检测，具备成为超快检测工具的潜力。
结论：截至目前，SARS-CoV-2在全球持续扩散和蔓延，新冠病毒面临全球化和时间持续化的困境。我国在“动态清零”坚决不动摇的方针指导下，内防扩散，外防输入的防控形势依旧严峻。尤其是针对SARS-CoV-2病毒的不断变异，其传播速度增大、隐匿性增强、免疫逃逸比例增高，甚至新变种依旧对免疫力低下的人群和老年人群造成重症和死亡的威胁。因此，发展高通量、高灵敏、便携的检测平台是今后发展的趋势与面临的挑战。
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