血清学和分子生物学检测在 丙型肝炎病毒感染的诊断和 管理中发挥的作用

可用于丙型肝炎病毒（HCV）治疗的药物已经逐步实现更短的治疗疗程和更高的持续病毒学应答（SVR）率，HCV感染诊断试验的作用也在不断进化以满足不断变化的临床需求。本文概述了HCV感染诊断试验（分子和血清学试验）在HCV感染诊断和管理中发挥的作用。所有这些关键信息为临床医生优化患者临床治疗效果提供了指导。这篇文章还对药物进一步创新研发背景下诊断试验的未来发展方向进行了讨论。

据估计世界范围内大约有1300万至1700万人是HCV的慢性感染者，每年新增感染300至400万例，每年因HCV相关肝脏疾病死亡的人数高达35万人。HCV感染的长期影响变化无常，从对慢性肝炎患者最小的损伤、到肝纤维化、肝硬化以及肝细胞癌（HCC）。HCV诊断试验的发展与我们对HCV感染的认识是同步的，随着不断引进的越来越多的治疗方法，HCV的不利影响也在逐渐减弱。HCV血清学和分子诊断试验在病毒感染的识别、评估疾病严重程度以及治疗方案应答方面发挥着主要作用。在这篇文章中，我们将侧重于这些试验临床作用的变化，尤其侧重于近年来HCV筛查管理和治疗策略的变化。

不安全的医疗行为包括未经管理和有效筛查的输血，以及违法的毒品注射是HCV感染的主要原因。美国研究者对上世纪60年代以来的献血者和受血者资料库进行了回顾性研究，发现大约25%的受血者感染了HCV。这些发现促进了上世纪70年代志愿献血体系的出现，该体系在对乙型肝炎病毒表面抗原阳性血液排查的同时，将HCV经输血传播的概率大幅下降到7%。1989年，病毒已经可以通过分子方法鉴别，因此，我们对HCV生物学的进一步理解允许我们去开发HCV特异性诊断试验，这些试验在多种临床样品中的应用证明了病毒的传播途径。后来，公共卫生建设通过开发并持续改进HCV特异性酶免疫分析法（EIA），专注于减少感染发生的数量，并结合重组免疫印迹试验（RIBA）进行确认，使得与输血相关的HCV感染发生率在上世纪90年代末期下降到0.01%以下。

HCV抗体筛查的一个缺点是可能会延误感染的诊断，因为HCV抗体阳性通常发生在病毒暴露后的数周至数月的时间段。这一“血清转化窗口期”被定义为可以通过HCV RNA或核心抗原（cAg）检测出而不能通过HCV抗体检测出的时间间隔，这使得上世纪90年代末血站开始使用核酸检测试验（NAT）。先前基于EIA的献血者筛查试验通常需要耗时13周，通过基于NAT的试验，献血者筛查的时间缩短为3天。因此，目前HCV经输血相关途径感染的风险降为每100万输血单位1例（0.0001%）。

减害技术（主要用于减少HIV感染）被引入后，注射相关的HCV传播也出现了大幅下降。1995年，大部分高收入国家开始进行大规模HIV预防计划，包括注射器交换、注射设备药店销售以及美沙酮疗法的推广，这些活动大幅降低了HIV感染人数。由于HCV更易于传播，毒品注射人群（PWID）的HCV传播虽有大幅下降，但效果不及HIV。与HIV相比，共用设备和较高的设备共用频率更容易传播HCV，这导致了PWID人群较高的HCV流行率。由于采用了改进的献血制度和减害技术，美国HCV感染总人数出现了下降，但是HCV感染人数在特定人群中出现了增长，也就是说在年轻人群、非城市地区出现增长，而且这种增长主要是白人PWID人群。许多HCV感染病例都有其特有的起源，通常是最初滥用处方阿片类药物的人群，第一次使用药物平均发生在开始注射海洛因并共用注射器2年以前。这些发现表明需要实质上推广减害技术和控制药物滥用以终止HCV感染的发生。

除了感染事件，据估计美国大约有45%至85%的流行性HCV感染个体，无论是通过输入血液制品、还是毒品注射或其他方法，都没有意识到自己的HCV感染状态。在资源有限的环境中，诊断率更低。由于最高的HCV流行率（76.5%）发生在1945至1965年间出生的人群，而且大部分未意识到自身状态的人都在这一人群中，疾病控制中心建议1945至1965年间出生的所有人都应该接受一次血清学试验。

与治疗相关的诊断方法和设计用于筛查及保护血液供应的试验大不相同，由于近年来HCV的治疗方法显著改进，诊断模式也在逐渐变化以满足不断变化的临床需求。大约15%至30%的患者在初始暴露6至12个月内能够自行清除HCV病毒。这些个体的HCV抗体仍呈阳性但是没有可检测到的病毒，已经痊愈并且不会出现长期后遗症。在对患者采取治疗手段之前，医生必须区分哪些是暴露于HCV但是经过急性无症状感染后已经痊愈的患者，哪些是暴露后进展为慢性及潜在的终身感染患者。传统意义上，使用RIBA证明血清中的抗体与特异HCV蛋白的反应确认HCV感染，能够提高抗体酶联免疫吸附试验（ELISA）的特异性，但是这种试验已经停用并无法再获得。外周血内出现HCV RNA是HCV复制的可靠标志，也是今天用于确认HCV活动性感染的主要标志。通常有2种技术进行HCV RNA定性试验：PCR和转录介导扩增（TMA）。

一种直接测量HCV RNA的备选方法是血液中HCV蛋白定量。HCV蛋白产生需要病毒复制，因此它可以作为HCV活动性感染的可靠标志物。HCV核心抗原试验经过广泛确认，是目前血清或血浆内HCV蛋白检测唯一可用的商购检测方法，但是该试验目前在美国仅用于研究使用。使用不同HCV核心抗原试验进行的研究表明：虽然使用核心抗原水平的试验其灵敏度和精密度不如HCV RNA水平试验，但与HCV RNA水平是显著相关的。因HCV核心抗原分析更快而且通常比NAT方法便宜，这种方法正越来越多地被用作HCV血清反应阳性样品的补充方法来鉴别HCV活动性感染个体，尤其是在资源有限的区域。由于与HCV RNA试验相比HCV核心抗原试验的灵敏度较低，为了100%检出活动性感染，应该在HCV Ag结果为阴性，HCV抗体结果为阳性的样品中考虑HCV RNA试验（图1）。考虑到普通人群中cAg假阴性的数量非常少，因此确认cAg阴性结果需要的RNA试验数量也很少，同时也能保证100%的检出目标。在转氨酶水平升高的基础上，通过对样品进行分类和分级确认，这些试验的需求量还能进一步减少。

图1： 基于这篇文章和先前的研究，联合HCV抗原与HCV RNA试验准确鉴别HCV活跃复制的流程。*，对于过去6个月可能暴露于HCV的个体，建议在HCV抗体试验之后追加HCV RNA试验。对于免疫功能不全的个体，应考虑进行HCV RNA试验。†，为了区分既往、已痊愈的HCV感染与HCV抗体生物学假阳性，可以考虑用另一种HCV抗体试验进行检测。如果怀疑被测试个体在过去的6个月内暴露于HCV或有HCV疾病临床症状或者对试验标本的处理、储存有疑问，则重复HCV RNA检测。

总而言之，急性HCV感染分为3个风险人群：PWID（代表发达国家主要的传播风险）；患者在医院内感染HCV（通常出现在发展中国家）；HIV阳性患者通过男男性行为传播（MSM）。关于MSM，特别是HIV感染MSM，急性HCV感染可视为性传播疾病。

与其他病毒相比，HCV不能整合到宿主基因或持续潜伏于体内病毒库，这种情况使用抗病毒治疗是“可治愈”的，称之为持续病毒学应答（SVR）。SVR定义为在治疗结束后的特定时期内（通常为12周或24周）检测不到HCV RNA。该治疗的目的是根除HCV感染，避免出现HCV相关肝病的并发症。

最初， HCV感染的治疗进展只是略有改进，使用干扰素（IFN）是HCV治疗的基础；干扰素包括α干扰素、聚乙二醇干扰素（Peg-IFN）、单独使用α-2a或2b或联合利巴韦林（Peg-IFN/RBV）。尽管这些方法多年来治愈了不少HCV感染，但是对干扰素治疗的依赖伴随其副作用和低治愈率明显限制了治疗摄入（treatment uptake）。近来大量的研发投入获得了大量耐受良好的直接抗病毒药物（DAA）和宿主靶向制剂（HTA）。2011年，第一代DAA博赛泼维和特拉匹韦出现，它们是HCV非结构3/4A（NS3/4A）蛋白酶抑制剂，这两种药物被批准与Peg-IFN和RBV联合使用。据最近的报告称在II期和III期的临床试验中联合使用DAA具有大于90%的治愈率，许多病例甚至不使用α干扰素和/或利巴韦林。

除了确认病毒血症外，HCV RNA水平、病毒基因型和亚型试验还是帮助医生做出治疗决策的重要工具。既往治疗史，可能还包括基准耐药性检测，也有助于指导治疗，还能了解肝损伤水平，也许还能了解白介素-28B（IL-28B）基因型（至少在包含IFN的HCV治疗方案中），IL-28B是天然免疫功能的标志物。治疗指南对新疗法的应用方法给出了建议。新的HCV疗法有特殊的适应症包括适用于特殊患者的治疗疗程和联合用药方法，疗程和方法根据HCV基因型而变化，这是判断治疗效果的决定性因素。使用干扰素治疗，基因1型和4型的反应较基因2型和3型弱。尽管这会随着新药物的出现而改变，但是使用新的无干扰素DAA治疗方法，基因3型被证明最难以根治。即使更全基因型的方法被开发出来，很有可能仍会继续进行基因分型的检测。

HCV基因型分型也很重要，因为基因型1a对多种DAA的耐药性屏障低于基因型1b。这一区别最初见于蛋白酶抑制剂，但是也证明与非核苷多聚酶抑制剂和非结构5A（NS5A）抑制剂有关。例如，在HCV基因型1a感染的治疗方法中将利巴韦林与AbbVie最近批准的paritaprevir-ombitasvir-dasabuvir联合使用，但是不能用于基因型1b感染的治疗。在侧重HCV基因1型感染的药物临床试验中广泛研究了病毒遗传多样性和亚型的临床意义。关于其他基因型遗传多样性影响的更多研究揭示了类似的细微差别，从而能进一步改善临床治疗效果。在发达国家，HCV基因型检测目前可以在大多数临床和医院实验室中进行。使用了广泛而多样的基因分型方法，包括PCR扩增后进行条带反向杂交，或者进行Sanger法测序以及实时荧光定量PCR。

这些基因分型方法具有一定好处，但也存在局限性。迄今为止还没有完美的基因分型试验。虽然测序可以提供卓越的HCV分型解决方案，但是费时费力，需要技术纯熟的技术员并会花费大量资金，得到的结果却不标准。实时荧光定量PCR具有工作流程优势，能够实现高度自动化并能减少人工处理时间，降低了对技术熟练度的要求和费用，美国（FDA）和欧洲（CE）批准的商用方法已经存在。但是，研究显示该技术不能解决或准确辨别某些罕见的病毒亚型。最后，条带反向杂交方法虽然便宜，但需要人工操作，是一项劳动密集型的工作而且结果的判读也很主观。

干扰素治疗有很大的副作用而且治疗停止后24周检测的结果显示效果一般（HCV基因1型 SVR率50%；HCV基因2型和3型 SVR率75%）。对于这些治疗方法，某些基线预测因素如病毒载量小于800,000IU/ml，感染HCV基因2型或3型以及对于某些免疫反应相关基因比如IL-28B来说有利的患者基因型，都是长期治疗获得成功的有价值的预测因素。世界上许多将干扰素方法指定为治疗方法的地区，医生需要评估与患者临床表现相关的预测因素来决定是否开始干扰素治疗。一旦患者开始干扰素治疗，监测病毒载量和动力学（如应答指导治疗或RGT）被证明在指导治疗方面很有效，因为通过监测可以确定治疗疗程并优化SVR率。

使用HCV动力学指导治疗突出了对临床阈值和/或治疗指南标准化的需求，以解决不同病毒载量试验的问题。在用于定义新RGT模式的所有试验中，仅罗氏人工高纯化系统/Cobas TaqMan（HPS；美国加利福尼亚州普莱森顿，Roche Molecular Systems Inc.）用于测量HCV载量。RGT模式建立期间未列入考虑的因素是不同HCV RNA试验可获得的结果，如Roche Cobas/Cobas TaqMan、Siemens kPCR、Abbott RealTime（ART）以及Qiagen Artus assay，这些都是国际上的商用试验而且用于常规临床实践。需要进行额外研究来探索这些RGT规则与其他商用试验的兼容性。

2013年，欧洲和美国批准了更多的DAA用于HCV感染治疗。第一种DAA是西米普韦，一种二代蛋白酶抑制剂，不久以后索非布韦—NS5B核苷聚合酶抑制剂也得到了批准，这两种药物成为新一代药物的代表。对于这两种新药，病毒基因型的检测仍然非常关键。在与Peg-IFN/RBV联合使用时，与第一代蛋白酶抑制剂（用于治疗HCV基因1型初治和复治患者）相比，西米普韦对NS3/4A显示出增强的亲和力和特异性。相反，索非布韦是第一种用于无干扰素，联合利巴韦林使用以治疗基因2型和3型患者的药物。该药物被批准后，成为原来采用Peg-IFN和利巴韦林联合治疗12周的基因1型和4型患者的一线疗法。不适合使用干扰素的患者可以使用索非布韦和利巴韦林24周疗法。

与干扰素治疗相比，DAA有更强的抗病毒效果，而且治疗方法更简化，因此最近开始逐步弃用Peg-IFN/RBV疗法。最新的II期和II 期无IFN/RBV临床试验已经不再使用RGT：即使在不使用RBV的情况下，使用西米普韦和索非布韦12或24周也能实现100% SVR。在索非布韦/雷迪帕韦“孤星”试验中，无论是治疗8周还是治疗12周的患者，95%的患者都达到了SVR；在联合RBV进行12周管理后，SVR率达到100%。另外，DAA的花费非常高，需要最大程度的坚持治疗来尽可能缩短治疗时间，通过6周甚至4周的抗病毒治疗提高获得SVR的希望。治疗期间细致的动力学监测可能有助于确定缩短疗程是否有效，这种方法还需进一步的研究进行评估。

尽管诊断测试对HCV患者的管理非常关键，但除了包含干扰素的方法依靠HCV载量监测进行治疗无效评估外，使用第二代和第三代DAA治疗疗程的决策不受病毒动力学监测指导。最新疗法的病毒学应答不仅取决于先前治疗经验如对先前抗HCV疗法的反应以及其他治疗前临床指标，还取决于病毒基因型和亚型以及基线病毒载量来确定最佳的治疗方法及疗程。联合NS5B抑制剂索非布韦和NS5A抑制剂雷迪帕韦已经成为一个方案，欧洲和美国已经批准该方案用于HCV感染的治疗。获得批准的基础在于根据试验报告，HCV 基因1型感染者经过全口服每日一片的治疗方法SVR率大于90%（最高可达99%）。批准的联合用药方案表明基线病毒载量小于600万IU/ml且初治非肝硬化的患者可以使用仅8周的治疗方案，其他患者则应该接受完整的12周治疗方案。根据之前建立的RGT规则，这些治疗方案规则确立期间，没有关注商购病毒载量测试的不同性能特点，以及它们与用于临床试验的单一的人工方法相比的兼容性，而这一单一的人工方法是不会广泛应用于临床实践的。设计用于评估试验可变性对临床的影响以及确定该方法治疗截断的采样时间的独立研究发现：很大比例的患者出现了病毒载量波动，在不同的时间点病毒载量高于或低于600万IU/ml，这会潜在影响治疗决策。根据HPS和ART试验得出的定量值之间的已知偏移，以及此次和其他研究中初步得到的数据，ART 200万IU/ml的病毒载量相当于HPS 600万IU/ml的病毒载量。

欧洲和美国已经批准联合使用ombitasvir/paritaprevir/ritonavir和dasabuvir的方案，大部分使用该方案治疗12周的患者SVR率大于95%。但是该方法不受基线病毒载量的影响，治疗疗程的确定以及是否需要利用利巴韦林取决于HCV基因1型的亚型和肝硬化水平。无肝硬化的HCV基因型1b感染者适合使用12周无利巴韦林疗法，但HCV基因型1a感染需要使用利巴韦林，肝硬化患者的治疗疗程也会达到24周。

在这些有注册商标的新型联合治疗方案的基础上，HCV基因（亚）型和基线病毒载量评估仍然是重要的治疗前标志物，仍会指导治疗方案选择和疗程选择。此外，治疗中HCV RNA水平的变化仍会被用作治疗依从性/治疗反应的标志来判断治疗成功与否。最近的数据阐述了非常早期的病毒动力学，被描述为早期治疗中特定时间点未检测到的病毒载量，能够预测治疗成功。测量病毒载量使用的试验越灵敏，未检测到的病毒载量结果的阳性预测值就越高。相反，即使在治疗末期（EOT），使用非常灵敏的方法进行残余病毒载量检测，也不一定与治疗失败有关。这意味着使用非常灵敏的方法进行非常早期的病毒动力学监测有助于鉴别那些能从时间短、效价高的抗病毒疗法中获益的患者。在这种情况下，低水平的残余病毒载量不能纳入治疗失败或延长治疗疗程的考量。

DAA疗法中，HCV诊断试验的其他作用是用于评价药物治疗依从性。坚持新型高效力DAA疗法的患者在治疗非常早的阶段出现不可检测的HCV RNA。值得注意的是，研究显示即使在治疗末期，出现低水平可定量HCV RNA，也不能作为非依从性指标，也不能排除其能达到SVR。在这种情况下，一种准确但灵敏度略低的方法如HCV核心抗原检测，可能成为高灵敏度HCV RNA检测依从性评价的备选方案。如果患者接受DAA治疗并在治疗第4周出现使用低灵敏度方法可检测的病毒血症，如检测限（LOD）介于1000IU/ml—5000IU/ml之间的方法，该患者很可能依从性不好或者治疗失败。如果被更灵敏的HCV RNA试验进一步确认，则可能带来更有价值的临床干预例如DAA更换。作为一种选择，HCV核心抗原水平的分析能用于该目的。治疗期间不可检测的HCV核心抗原水平对患者可能更加重要，如一些药物滥用者，这些患者的药物依从性就会存在问题。

治疗之后，继续监测HCV复发很重要，尤其是高风险人群如药物滥用者以及HCV/HIV共感染MSM人群。在MSM中，随访急性HCV再感染率介于7.8%-15.2%每年。HCV抗体在接受有效治疗后或自然痊愈病毒清除后还会持续很长一段时间。但是在达到SVR或感染自然痊愈后，不能避免出现HCV再感染。这意味着用于普通人群筛查的抗HCV抗体试验不能用于鉴别再感染患者。对于再感染高风险人群如PWID或MSM，应该使用病毒存在的直接标志物（RNA或核心抗原）进行筛查。

慢性HCV感染的影响在很多方面增加了全球医疗卫生体系的负担。尽管HCV传播同时影响发达国家和发展中国家，但是接受HCV诊断和治疗的水平常存在地理区域差异，甚至在相同国家的不同人群中间也存在差异。经济条件影响一个国家和治疗费用承担者采用的HCV治疗方案，医疗卫生体系正在尽全力支付与慢性疾病相关以及多种与人口老龄化相关疾病的花费。必须优化治疗流程的每个层面包括诊断和治疗中疗效监测来实现最佳的治疗效果。以疗效为立足点，未来的治疗方法很可能被简化，无需在治疗前评估传统意义上影响疗效的因素，如HCV基因型、IL-28B型、基线HCV RNA以及纤维化水平等因素。如果使用这种简单的“一体适用”疗法和新兴高效抗病毒方案，那么诊断试验最后的作用就是鉴别HCV感染者、疗法依从性以及判断12周或24周治疗后治疗是否成功。如果这成为现实，那么将不再需要高灵敏度分子试验，替代试验的灵敏度可能较低（可能是定性方法）但价格便宜且出结果所需时间较短，这样的试验即将成为医生的选择。

有两个因素对第二种方案成为现实的可能性存在很大影响：

第一，现实实践使用DAA治疗的效果与临床试验取得的结果相比可能会下降；

第二，考虑到DAA联合治疗的花费较高，第三方付费者建立繁杂的批准要求会包括HCV基因型测定和HCV RNA水平以及通过切片或无创方法评估纤维化。

此外，这些结果可能要求在批准前30-90天内获得，很可能会导致大量的重复诊断检测，还得考虑药物批准过程中多重和大量的文件要求。

未来的研究会发现由于对患者进行了分类，可以实现更丰富的治疗策略，在治疗前进行检测，对患者进行评估或根据潜在的纤维化恶化水平，结合患者自身的治愈可能性选择方案也能成为现实。DAA疗法通常仅限于纤维化水平较高的晚期患者（3期或4期）。对可能存在纤维化恶化的患者进行准确鉴别，能鉴别出人群中适合优先接受抗病毒治疗的特定群组。

如要治疗世界上每一个病毒性肝炎感染患者，现有资金显然不足。在这种条件下，有义务对每一笔花费的资金的经济有效性进行确认，了解这些资金是否达到了尽可能多地鉴别、治疗和治愈患者这一最终目的。因此，避免潜在的疾病后遗症和后遗症相关的医疗费用至关重要。

诊断学在HCV感染的许多方面发挥着重要作用，从发现感染到预防传播，再到治疗管理，以及最后在全球范围内消灭HCV。慢性HCV感染的影响持续增加全球医疗卫生体系的资金压力。我们需要建立全面、实用和有证据支持的方法来确定开展HCV治疗的最佳途径，包括必要的诊断方法。在无用之处浪费的每一点资金都会削减治疗所需药物和治疗医生的资源。

雅培具有独特的Architect HCV核心抗原检测，该检测采用微粒子化学发光方法，定量检测人血清或血浆中HCV病毒核心抗原含量。

在HCV感染初期，检测抗体的窗口期长达70天，此时的HCV抗体阴性并不能排除HCV感染。根据我国CDC的评估，采用Architect HCV核心抗原检测可将检测窗口期缩短至35.8天，并且与HCV RNA水平呈平行变化趋势，有助于检测HCV感染窗口期患者，对HCV抗体检测不确定结果进行补充，可用于HCV阳性母亲所生胎儿的诊断，以及免疫受损或先天性免疫缺陷群体如HIV感染者、器官移植患者的筛查。

同时，HCV Ag的定量检测还能够辅助HCV RNA用于治疗监测。虽然灵敏度相较于HCV RNA略低，但该方法更加方便快速、通量高、价格也相对便宜，利于在治疗开始后的关键节点快速了解患者对治疗方案的反应性。另一方面，研究表明在治疗末期，即便是检测到低水平的病毒载量也不能说明治疗失败，因此在这时采用灵敏度相对较低的HCV Ag评估疗效可能更加适合。

结束治疗后，应对患者进行定期随访以了解其复发及再感染情况，特别是对一些高危人群，如MSM、HCV/HIV共感染人群、透析患者等非常重要。对于治疗后痊愈或自然痊愈的感染者，HCV抗体会持续很长时间，此时仅检测HCV抗体无法发现感染复发以及再感染。在这些情况下，采用直接检测病毒自身抗原物质的方法，如HCV核心抗原，对患者状态的评估更有价值。

随着新型治疗药物以及治疗方案的出现，HCV治疗的格局正在改变，顺应这一改变，相关实验室检测方法也应该向着更加精准，更加方便实用的方向不断改进。

 雅培贸易（上海）有限公司 供稿