狼疮抗凝物实验室检测方法与临床应用价值
吴俊，医学博士，博士后，主任医师，北京大学副教授，硕士导师。现任北京积水潭医院检验科主任。国家卫健委能力建设与继续教育中心检验专委会血栓与止血组长，中国医院协会临床检验专业委员会委员，中国医学装备协会现场快速检测（POCT）装备技术分会副会长，中国医药教育协会血栓与止血危重症专委会副主任委员，北京整合医学会血栓与止血分会会长，北京临检中心血栓与止血专家委员会常务副主委, 北京检验学会常委/血凝学组长。中华检验医学杂志、临床检验杂志、北京大学学报（医学版）、中国医学科学院学报，JTH等杂志编委及审稿。参编、副主编著作7部，发表文章100余篇。获得多项研究基金。
李静，北京积水潭医院主管技师，北京协和医学院北京协和医院临床检验诊断学硕士，师从李永哲教授。主要研究方向为自身免疫性疾病诊断标志物、遗传风险因素和发病机制研究。以第一作者/共同第一作者发表SCI论文7篇。
【摘要】狼疮抗凝物（LA）是一组能直接与磷脂或磷脂蛋白复合物结合的自身抗体，是辅助诊断抗磷脂综合征（APS）的重要实验室指标。由于LA本身的异质性和受到抗凝药物的影响，其检测方法的标准化程度较低。临床实验室多依据国际血栓与止血学会（ISTH）、英国血液学标准委员会（BCSH）以及临床实验室标准化协会（CLSI）等相关指南进行检测，包括筛查试验、混合试验和确证试验。LA持续阳性是动静脉血栓以及不良妊娠结局等不良事件的重要危险因素。
【关键词】狼疮抗凝物；抗磷脂综合征；活化部分凝血活酶时间；血栓与止血
狼疮抗凝物（lupus anticoagulants，LA）是抗磷脂抗体（antiphospholipid antibodies，aPL）家族成员之一，是一组能直接与磷脂或磷脂蛋白复合物结合的异质性免疫球蛋白。在体外，LA主要通过结合β2糖蛋白1（β2-glycoproteinⅠ，β2-GPⅠ）、凝血酶原及其他磷脂复合物来干扰凝血过程，从而延长磷脂依赖的凝血试验的时间。而在体内，LA却通过识别与磷脂结合的凝血酶原而影响依赖磷脂的各种凝血反应，起到促凝的作用[1, 2]。LA持续存在是抗磷脂综合征（antiphospholipid syndrome，APS）的三个实验室诊断标准之一[3]，此外还可见于系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）和结缔组织病（connective tissue diseases，CTD）等多种自身免疫性疾病，是动静脉血栓及不良妊娠结局的危险因素之一[4]。
现行LA的检测方法大多基于LA与磷脂结合可延长磷脂依赖的凝血试验时间这一原理。由于LA本身组成成分的异质性和检测试剂的多样性，检测过程中影响因素较多，LA检测目前尚无参考物质和参考方法。目前临床实验室主要依据国际血栓与止血学会（The International Society on Thrombosis and Haemostasis，ISTH）和英国血液学标准委员会（The British Committee for Standards in Haematology，BCSH）以及临床实验室标准化协会（The Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）发表的LA检测相关指南来进行检测[5-8]。在临床中准确检测LA具有重要价值，除了协助诊断自身免疫病，还能监测某些特定人群血栓事件和病态妊娠的发生，并为患者的治疗提供依据[9]。本文对LA的检测方法及其临床应用进行概述。
一、LA的检测方法
ISTH 2020年更新的指南建议应对疑似APS的患者、免疫性血小板减少症患者、具有网状青斑等非标准自身免疫病症状的年轻患者以及意外发现不能解释的活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）延长的患者进行LA的检测[8]。目前指南推荐的LA检测可分为以下3个流程：（1）筛查试验：磷脂依赖的凝血试验延长，这提示可能存在凝血抑制物；（2）1:1混合试验：排除凝血时间延长是由于凝血因子缺乏所导致；（3）确证试验：试剂中含高浓度磷脂，若凝血时间被纠正则证实凝血抑制物具有磷脂依赖性[5, 6]。
1. 筛查试验：基于LA在体外与磷脂结合可延长磷脂依赖的凝血试验时间的原理，理论上来说，只要试剂中的磷脂浓度低到足以对LA敏感，所有依赖磷脂的凝血试验都适用于LA的筛查，临床中常用的试验包括反映内源性凝血途径和共同途径的APTT、高岭土凝固时间（kaolin clotting time，KCT）和二氧化硅凝固时间（silica clotting time，SCT），以及反映共同途径的稀释蝰蛇毒时间试验（dilute Russell viper venom test，dRVVT）等试验。dRVVT试验的原理是在待测血浆中加入蝰蛇毒和钙离子，蝰蛇毒可直接活化凝血因子X，在钙离子、凝血因子V和磷脂存在下，激活凝血酶原导致纤维蛋白凝块形成血液凝固。若样本中存在LA则会抑制具有凝血活性的磷脂，从而使凝固时间延长，Thiagarajan等于1986年首次报道了该方法[9]。KCT和SCT通常被认为是使用不同激活剂的APTT衍生试验，其中KCT由于高岭土的颗粒性质可能会干扰凝血仪的光学凝块检测系统，并且结果重复性欠佳，临床中应用已逐渐减少，目前临床更多使用SCT作为LA的筛查试验[5, 8]。
由于LA的异质性，因此没有单一的检测方法对LA是100%敏感的。2009年和2020年的ISTH指南均建议，对LA的检测应包括两种不同原理的测试，首选dRVVT和以硅作为激活剂的APTT即SCT，可提高LA检测的敏感性[5, 8]。BCSH 2012和CLSI 2014同样推荐dRVVT和APTT，但未对激活剂种类进行限制[6, 7]。ISTH不建议进行两种以上的检测方法，认为这会导致结果难以解释，并且会增加LA的假阳性从而导致临床可能会进行不必要的抗凝治疗[5, 8]。CLSI 2014则认为即使筛查试验无法避免出现假阳性结果，但后续的混合试验和确证试验可以进行排除[7]。
2. 混合试验：混合试验是在一份未经稀释的血浆样本出现了凝血时间延长的情况下，将待测血浆与等体积的正常血浆（normal plasma pool，NPP）1:1混合均匀，未经孵育前进行相应筛选项目测定，如凝血时间延长仍未被纠正，则排除了磷脂依赖性凝血时间延长的原因是一种或多种凝血因子缺乏，因此假定存在凝血抑制成分。需要注意的是，混合试验并不能证明这种抑制成分就是LA。混合试验中的NPP可以使用市售的商品试剂或实验室内自行配制，ISTH 2020指南建议应混合至少40例健康人的乏血小板血浆样本，以确保提供完整的凝血因子[8]。
关于实验流程的选择，ISTH 2009指出在筛查试验检测结果延长时即需要进行混合试验，混合试验结果阳性时再进行确证实验[5]。BCSH 2012则认为混合试验中的稀释效应可能导致弱阳性LA检测结果出现假阴性，因此即使混合试验结果阴性，但筛查试验和确证试验检测结果提示阳性时仍然判定LA为阳性[6]。CLSI 2014则强调检测流程依次为筛查试验、确证试验、混合试验，只有当筛查试验和确证试验的结果难以解释时再进行混合试验[7]。ISTH 2020将建议顺序修改为，在筛查试验检测结果延长后同时进行混合试验和确证试验[8]。
3. 确证试验：确证试验的基本原理是通过加入含有高浓度磷脂的试剂来中和血浆中的LA在体外试验中的抗凝作用，以此来确认循环抗凝物是否具有磷脂依赖性。当待测血浆中存在LA时，在加入含高浓度磷脂的试剂后血浆凝固时间缩短。ISTH 2009和2020指南均不建议将冷冻后复融的血小板作为确证试验的磷脂来源，因为批间差异较大，而是建议在确证试验中使用合成的双分子层或六边形II相结构的磷脂[5, 8]。BCSH 2012和CLSI 2014均未限定试剂类型[6, 7]。
二、检测结果解读与影响因素
1. 结果解读：鉴于LA检测的复杂性，其结果的表达与解读非常重要。目前大多数实验室都遵循ISTH 2009指南的建议，在检验报告中将所有试验（筛查、混合和确证）的凝血时间转换为标准化的比率来表达，即将检测样本的凝血时间除以平行检测的NPP的凝血时间。对于采用综合试验即对每个样本同时进行筛查试验和确认试验时，则可计算凝血时间纠正百分比［凝血时间纠正百分比=（筛查试验比值－确认试验比值）/筛查试验比值×100%］，或标准化LA比值，即筛查试验比值/确认试验比值的比值[5]。同时，LA的检测结果必须与筛查、混合和确证试验设定的cut-off值进行比较，以确定检测样本是否为阳性。指南建议实验室至少检测120个样本选取第97.5或99百分位数作为自己的cut-off值，但在实际临床操作中难度较大，大部分实验室选择对试剂生产商提供的cut-off值进行验证后使用[10]。由于LA和磷脂依赖性测试之间存在多种形式的相互作用，APTT和dRVVT只在少部分的患者中同时出现阳性，因此目前的指南要求，只要两种测试中一项呈阳性即为LA阳性[6-8]。完整的报告应包含所有试验的分析结果、cut-off值以及最终的结论。
2. 影响因素：在开始LA检测之前，常规凝血试验如凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、APTT、凝血酶时间（thrombin time，TT）和纤维蛋白原的检测有助于确定是否存在抗凝治疗、凝血因子缺乏或特异性凝血因子抑制剂，但不能用作排除的证据。LA检测中的主要混杂因素是抗凝治疗，因为任何抗凝药物如普通肝素、低分子肝素、维生素K拮抗剂和直接口服抗凝药等，都有可能延长测试的凝血时间，因此建议LA的申请单标注患者使用的抗凝剂类型[11]。理想情况下，LA检测应在抗凝治疗开始前或停止后进行，但在临床治疗期间仍然有进行LA检测的需求，可能因此导致假阳性或假阴性结果。实验室可以根据患者使用的抗凝药种类采取相对措施降低其对试验的影响。对于使用普通肝素或低分子肝素的患者样本，可采用包含肝素中和剂的商品试剂将肝素淬灭[12, 13]。对于直接口服抗凝剂的患者样本，使用新型抗凝药吸附剂是一种有应用前景的解决方案[14, 15]。对于使用维生素K拮抗剂的患者样本，目前可采取受其影响较小的太攀蛇/锯鳞蝰蛇毒液作为激活剂的试剂盒进行检测，但现有的相关研究尚没有关于其诊断效能的结论性报告[16-18]。不建议对血浆样本进行稀释来规避抗凝剂对试验产生的影响，因为会出现假阳性或假阴性结果[10]。值得注意的是，根据现有的检测技术，还没有简单的办法可以准确检测抗凝患者的LA。
三、LA检测的临床应用
LA是aPL家族的一员，常与之伴随出现的APS是由aPL介导的，以动静脉血栓形成和病态妊娠为主要临床特点的自身免疫性疾病，APS分类标准要求在有临床症状的同时还要存在持续中高滴度阳性的LA、IgG或IgM型的抗心磷脂抗体（anticardiolipin，aCL）和抗β2-GP1（anti-β2-glycoproteinⅠ，anti-β2GPⅠ）中至少一项（两次检测阳性，间隔时间大于12周）[3]。因此，同时检测LA、aCL和抗β2-GP1通常有助于提高APS诊断率。并且，在最近欧洲抗风湿病联盟（European Alliance of Associations for Rheumatology，EULAR）关于APS管理的建议中，将高风险特征定义为持续存在LA、双aPL（LA、aCL和抗β2GP1中任意两项阳性）或三重aPL（LA、aCL和抗β2GP1阳性），或持续存在的高滴度aPL[19]。而一过性的LA阳性可能出现于肿瘤患者、感染性疾病患者和极少数健康人群[4]。
1. LA与血栓形成：APS是最常见的获得性血栓形成原因之一，下肢深静脉和脑动脉循环分别是最常受累的静脉和动脉部位。LA通过诱导组织因子表达、干扰凝血酶原活性、激活血小板和血管内皮细胞、影响补体活化、抑制蛋白C，导致血栓的形成[20]。Koji Habe等研究报道，在APS及其相关血栓性疾病中，63.5%的患者LA检测阳性[21]。大量研究均表明，与aCL和抗β2GP1相比，LA阳性与动静脉血栓的形成具有更强的相关性[22-24]。一项前瞻性队列研究结果显示LA阳性的患者发生深静脉血栓的概率比LA阴性人群高3.9倍，这也提示了LA对于血栓事件具有良好的预测价值[25]。并且，在已发生了血栓事件的患者中，复发风险最高的是LA阳性的患者[26]。此外，还有研究报道在LA检测中DRVVT和APTT试验同时阳性的患者比单一试验阳性的患者更易发生血栓[27]。
2. LA与不良妊娠结局：APS相关的不良妊娠结局包括一个或多个在妊娠10周以后无法解释的胎儿死亡，由于先兆子痫或胎盘功能不全而导致的1个或多个早产或3个及3个以上无法解释的连续早孕期自然流产[3]。不良妊娠结局通常由多种因素同时作用引起，包括免疫异常和自身免疫性疾病、凝血异常、内分泌疾病、子宫结构异常和遗传因素等。其中，aPL阳性是血栓形成和病态妊娠发生的危险因素。在病态妊娠的发生过程中，aPL会干扰前列环素的合成，从而导致胎盘有产生血栓的风险。aPL可以通过抑制抗凝血蛋白Ⅰ和抗凝血酶Ⅲ的激活，干扰蛋白Ｃ的活性，灭活蛋白Ｓ和蛋白Ｃ对Ｖ因子的活性促进血栓形成、造成细胞免疫平衡紊乱、过度活化补体系统、损伤滋养细胞功能导致病态妊娠，造成胎盘供血不足导致胎儿缺血缺氧，引起流产、胎儿窘迫、子痫前期等并发症[28]。在aPL中，相较于aCL和抗β2GP1，LA同样被证实与病态妊娠关系更密切[29]。几项前瞻性队列研究的结果均表明，LA与不良妊娠结局相关，而未发现其他aPL与其具有相关性[30-31]。另外有一项针对aPL和SLE妊娠的大型多中心前瞻性研究将LA确定为妊娠12周后不良妊娠结局的最强独立预测因子[32]。
综上所述，LA是APS、SLE等自身免疫性疾病的诊疗和预后判断的重要实验室指标，其与血栓形成密切相关，是血栓形成及不良妊娠结局的重要危险因素。由于LA的异质性和检测方法的局限性，目前尚缺乏标准化的行业规则。因此，实验室要充分了解LA检测的仪器、方法和试剂性能，积极与临床科室沟通，才能为临床提供更准确的检测结果。
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