生物制剂伴随诊断实验室检测技术与临床诊疗监测

刘昱东，博士、副研究员、硕士研究生导师。国家卫生健康委北京老年医学研究所副所长、国家卫生健康委老年医学重点实验室副主任。主持与自身免疫疾病诊治新策略方面国家自然科学基金、中国医学科学院创新工程等项目。担任中华医学会检验医学分会临床免疫组委员、中国老年保健医学研究会风湿免疫分会委员、北京医学会检验医学分会自免学组委员、中国中西医结合学会检验医学专业委员会免疫性疾病实验诊断专家委员会委员、北京免疫学会理事、Frontiers in Immunology副主编等。

周传景，中国医学科学院北京协和医学院在读硕士研究生，临床检验诊断学专业。

詹明华，北京大学医学部在读硕士研究生，临床检验诊断学专业。

生物制剂是指利用基因工程、抗体工程或细胞工程等现代生物技术生产的蛋白质制剂，包括细胞因子、单克隆抗体（mAbs）和融合蛋白等，它可以通过靶向特异性受体阻断疾病中起关键作用的细胞因子或其受体而发挥治疗作用[1, 2]。自1975年使用杂交瘤技术并成功制备出鼠源性mAbs，到嵌合抗体再到全人源性抗体的发展，使mAbs具有越来越高的亲和力、抗原结合活性以及更长的半衰期，相较于传统小分子药物具有更好的治疗效果以及更小的副作用，在治疗各种疾病尤其是自身免疫性疾病（autoimmune disease，AID）方面发挥着重要作用[1]。2021年美国食品药品监督管理局（FDA）批准了第100个治疗性单克隆抗体的临床应用[3]，见证了单克隆抗体应用的巨大的发展潜力。

生物制剂由于能够靶向特异受体，调节机体免疫应答，而免疫抑制剂和细胞毒性药物的使用往往受到严重的全身性和不必要的副作用的限制，所以在临床应用中生物制剂更受青睐。但是，生物制剂不同于大多数药物，因为它们不是小的化合物（异源化合物），而是以尽可能类似于人类蛋白质的方式生产的蛋白质，所以加工过程和体内的代谢方式与一般药物不同，机体产生的不良反应也有其独特的特点[2]。利妥昔单抗（Rituximab，RTX）是一种抗CD20单克隆抗体制剂，临床上常用于缓解AID症状。研究发现，在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患者中，RTX治疗后的前6个月以及使用超过三个疗程与感染易感性增加相关[4]。免疫原性也是生物制剂临床应用过程中最具有挑战性的问题之一。抗药物抗体（antidrug antibody，ADA）与生物制剂结合，影响药物的药代动力学和药效学，可能会降低功能性药物浓度，中和治疗作用继而导致治疗失败[5]。

尽管单克隆抗体对60-70%左右的患者诱导和维持临床病情缓解有效[6]，临床医生仍然需要意识到并识别使用这些药物可能导致的不良事件（AE），并在不同的情况下制定明确的管理策略。药物浓度监测和早期检测血清ADA水平可以帮助临床医生尽早发现不良事件的发生，减少由于生物制剂治疗不当带来的风险。

伴随诊断（Companion Diagnostics，CDx）是一种在用药之前对患者进行测试以确定患者对药物的反应（疗效、风险等），从而指导用药方案的实施的一种检测技术。生物制剂伴随诊断可以帮助临床医生找到最适合患者的药物，可以预测某种药物或治疗手段的不良事件，还可以在治疗进行中实时监测，以便随时调整方案。本文将对生物制剂伴随诊断的实验室诊断技术方面的进展进行综述。

一、伴随诊断的实验室检测技术

AID应用生物制剂伴随诊断项目主要涵盖药物浓度、ADA和抗免疫原性抗体三大内容，实验室检测技术主要有以下几个方面。

1. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：ELISA是一种经典的利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。通常使用捕获法来测定药物浓度，即通过在微孔板底预先包被捕获抗体，与血清、标准品等共孵育，通过HRP标记的检测抗体显色反应，比对标准曲线来计算血清药物浓度。ADA则通常使用ELISA双抗原夹心法进行检测。

Balsa等在一项关于炎症性关节炎患者由于药物免疫原性导致肿瘤坏死因子抑制剂治疗继发性失败的大型研究中，测定参与者血清英夫利昔单抗（IFX）药物浓度及其ADA时，采用了ELISA方法的试剂盒[7]。该方法的缺点在于检测血清或血浆样本时，通常会受到基质效应的影响，血液中的一些成分，如类风湿因子、抗异型抗体（以前免疫过的患者）和补体等，可能干扰读数造成假阳性。

2. 时间分辨荧光技术（TRFIA）：TRFIA使用镧系元素及其螯合剂作为示踪物，常用Eu（铕）作为荧光标记，由于其荧光寿命为1ms，令其荧光值足以在激发光消失后检测到，在减少激发光影响的同时也可避免生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身发出荧光的影响。因此其相比传统的荧光分析（FIA）具有更高的灵敏度。Jørgensen等在一项关于英夫利昔单抗长期随访研究中检测药物浓度和ADA时采用了TRFIA法，通过铕标记的示踪剂结合英夫利昔单抗的Fc结构域，在AutoDELFIA（PerkinElmer，Waltham，MA，USA）免疫检测平台上完成测试[8]。

3. 基于表面等离子共振（SPR）技术的生物分子相互作用分析：将生物制剂键合在生物传感器表面，再将样本注入并流经生物传感器表面。若发生抗原抗体结合则引起生物传感器表面质量的增加，导致折射指数按同样的比例增强，抗原抗体之间的反应即可通过观察折射指数而被捕捉到。

已有研究利用SPR对药物浓度和ADA进行了测定。Feliciana Real-Fernández等通过不同的技术检测患者血清中的抗阿达木单抗抗体，其中便有SPR，SPR与其他方法在结果上有着良好的一致性[9]。Marten Beeg等利用SRP测定了英夫利昔单抗和抗英夫利昔单抗抗体的血清浓度，此方法在灵敏度和重复性方面都有所保证，并且比商业化的ELISA试剂盒更具成本效益，可以在几分钟内直接检测和测量血清抗体，避免了漫长的孵卵、分离、洗涤、检测步骤，降低了检测过程的复杂性和可变性[10]。

4. 同质迁移率变化分析（HMSA）：HMSA是将配体结合试验与体积排阻色谱法（SEC）结合的一种方法。SEC是一种色谱技术，可以根据目标化合物的相对大小和形状进行分离。在HMSA方法中使用SEC可以区分不同大小的同型ADA[11, 12]。Wang，S.-L. 等利用该方法检测人血清中的抗英夫利昔抗体（ATI），并基于分子大小进行分离，结果表明，当血清中英夫利昔单抗浓度远高于患者注射英夫利昔单抗后达到的最大治疗水平时（60μg/mL），可检出低至0.036μg/mL的ATI，该方法克服了传统ELISA方法中血清原有药物竞争性结合ADA致使敏感性下降这一缺点[11]。

Barry D. Hock等开发了一种改良的、竞争性结合HMSA（cHMSA），用于在同类药物存在的情况下测定阿达木单抗。将含有英夫利昔单抗（作为一种相关药物）的血清样本与荧光标记的阿达木单抗混合，然后添加抗阿达木单抗抗体，孵育1小时形成免疫复合物。然后利用HMSA的SEC部分对游离药物和阿达木单抗-ADA二聚体进行鉴别。该方法克服了普通HMSA方法不能区分阿达木单抗和其他TNF特异性单克隆抗体的缺点，对阿达木单抗具有特异性，因此在近期接受过另一种抗TNF单克隆抗体治疗的患者中，cHMSA也能提供准确的抗阿达木单抗抗体定量信息[13]。

5. 以细胞为基础的生物活性试验：细胞增殖会伴随着代谢酶活性的增加，当抗体药物偶联物（ADCs）药物与细胞作用后，细胞发生死亡或者凋亡，继而酶活性降低。因此根据ADCs药物作用机制，选择适当的细胞系和检测系统，再建立细胞活性、毒性检测系统。中和抗体（neutralizing antibody，NAbs）是一类特殊的ADA，它与药物结合并阻断其治疗功能[14]。在适当的ADCs药物浓度条件下，样本中若存在NAbs则可以降低ADCs对细胞活性或增殖的抑制，以此判定NAb是否存在[15]。

6. 竞争性配体结合试验（CLBA）：NAb能阻断药物到达其靶标或干扰与配体的结合，进而影响药物体内活性。利用NAb与药物靶蛋白竞争性结合药物的特性，若样本中含有NAb，则表现为药物与靶蛋白的结合在一定程度会被抑制。CLBA试验系统通常较基于细胞的试验系统有更高的灵敏度、精密度，良好的药物耐受，并可耐受较强的基质干扰[16]。

二、开展伴随诊断的生物制剂

1. 抗TNF制剂：肿瘤坏死因子α（TNF-α）在多种慢性炎症疾病的发病机制中起着关键作用，英夫利昔单抗是首个被批准临床使用的抗TNF药物，用于控制包括类风湿关节炎（RA）、炎症性肠病（IBD）在内的慢性炎症性疾病，它与TNF-α结合，防止细胞因子激活细胞TNF受体复合物[17]。英夫利昔单抗治疗期间，一些无效或不耐受的患者改用其他抗TNF药物也是有效的[18]。

抗英夫利昔抗体的滴度与对TNF与药物结合的抑制性有关，在抗英夫利昔Ab阳性的血清中，较低的英夫利昔单抗谷水平（用药后稳态时最小血药浓度）更为常见，且使用英夫利昔单抗诱导产生抗体的患者血清未显示出与其他两种已批准的抗TNF制剂（依那西普和阿达木单抗）发生结合反应的能力[19]。还有一项系统性回顾研究发现，对于抗TNF治疗疗效不佳的IBD患者，低药物谷水平并且能检测到ADA的患者改用另一种抗TNF药物比增加药物剂量更加有效，低药物谷水平但未检测到ADA的患者增加用药剂量后疗效会比更换抗TNF药物更加显著，而高药物谷水平的患者无论是增加药物剂量还是更换抗TNF药物，其收益都并不显著[20]。因此，测定药物血清谷水平和ADA滴度对IBD患者的治疗药物监测有重要的临床应用价值。

2. 干扰素β（IFNβ）：在一些欧洲国家，抗药物抗体的检测已经成为多发性硬化症（MS）临床治疗中的一部分。自20世纪90年代以来，MS患者就已经使用IFNβ进行治疗，IFNβ是（多发性硬化症）MS的一线治疗方法，能够降低疾病的复发率与致残率[21]。已有不少研究表明，抗IFNβ抗体会降低IFNβ的生物活性[22-24]，并使药物疗效下降[25, 26]。因此分析IFNβ的生物活性及抗药抗体的测定是监测IFNβ治疗的一种有价值的辅助手段，特别是对于出现大量抗IFNβ抗体的患者。

C. Boz等对262位接受单一IFN-β治疗的MS患者进行了一项回顾性研究，发现Betaseron®治疗的NAb+患者在第3年复发率高于NAb-患者，几乎达到了显著性（P=0.056），但他们的复发率在第4年及以后没有差异。Rebif®治疗的NAb+患者第3年复发率高于NAb-患者（P=0.074），但第4年复发率明显高于NAb-患者（P=0.009）[27]。因此通过对NAb的检测，可以实现对IFN-β治疗疗效的预测，对指导临床用药有重要的应用价值。

3.抗整合素α4β1制剂：纳他利珠单抗（natalizumab）是一种抗α4-整合素的单克隆抗体，被批准用于治疗多发性硬化症，该抗体与淋巴细胞表面的整合素α4β1（迟现抗原-4，VLA-4）合，阻断其与内皮中存在的受体VCAM-1（血管细胞粘附分子1）的结合，从而干扰淋巴细胞向中枢神经系统的运输，进而延缓MS的疾病发展[28]。纳他利珠单抗抗体的存在会致使药物血清浓度的降低和治疗效果的丧失[29, 30]。

B. Oliver-Martos等对用药初期的MS患者进行研究，在用药后第1至第18个月连续观察纳他珠单抗抗体的生成，发现约9%接受纳他单抗治疗的患者会产生抗药抗体，并非所有抗体阳性患者都为持续性，其中3%为短暂阳性（所有短暂阳性的患者在治疗的第二个月到第四个月之间变为阴性），6%为持续阳性。对于抗体连续阳性而非短暂阳性的患者则考虑停止纳他利珠单抗治疗[31]。因此，患者用药早期抗体检测结果（在治疗的六个月内）可能会导致错误的临床指导，对患者体内ADA的长期连续性监测能更好的了解患者ADA的生成情况，以调整治疗方案，降低风险，优化患者的治疗。

4. 抗CD20制剂：利妥昔单抗是一种单克隆嵌合IgG1抗体，靶向B细胞特异性细胞表面抗原CD20。它的B细胞清除作用在各种自身免疫性疾病中都有应用。已有许多学者展开了对抗利妥昔单抗抗体（ARA）的检测，并研究其临床意义。在15例原发性干燥综合征患者中，利妥昔单抗特异性抗体与血清疾病风险增加相关[32]，在6例SLE患者和2例ANCA相关血管炎患者中，利妥昔单抗特异性抗体与复发风险增加相关[33]。也有研究发现利妥昔单抗治疗会导致高滴度的抗药抗体，并影响B细胞清除效果[34]。近期，Kidoguchi K等还通过测定利妥昔单抗抗体来预测SLE患者的输液反应，对于有发生输液反应风险的患者则考虑更换B细胞清除剂（如奥法木单抗）[35]。可见在许多疾病的治疗中，通过对ARA的检测能够实现相关不良事件的预测，更好地指导临床治疗。

5. 聚乙二醇化蛋白制剂：聚乙二醇（PEG）是一种亲水聚合物，经PEG修饰后的蛋白表面能产生水化相，以减少它们与单核吞噬细胞的相互作用，以此增加它们在血液中的停留时间，延长半衰期[36, 37]。因此PEG在生物医药领域具有广泛的用途。随着PEG在生物制剂中的广泛应用，越来越多的文献报道PEG本身具有高度免疫原性，针对PEG部分的ADA引起的潜在后果不断得到重视。抗PEG抗体通过聚乙二醇化脂基纳米颗粒触发补体激活，这可能会破坏药物的完整性，导致药物过早释放或暴露于血清蛋白[38]。Nicoletta Bivi等开发并验证了亲和捕获洗脱（ACE）-AGL检测方法，作为一种新方法，可以同时检测针对药物及其PEG部分的抗体，具有高灵敏度、耐药性和准确性[39]。

有不少研究发现，抗聚乙二醇抗体会影响聚乙二醇化药物的血药含量。Jonathan K. Armstrong等发现在接受聚乙二醇化天冬酰胺酶PEG-ASNase治疗的急性淋巴细胞白血病患者中，抗PEG的存在与PEG-ASNase的快速清除密切相关[40]。普瑞凯希（Pegloticase），作为一种聚乙二醇化尿酸特异性酶，近日由FDA批准与甲氨蝶呤联用来治疗难治性痛风。Peter E Lipsky等进行过一项随机对照实验，在169例接受普瑞凯希治疗的患者中，69例（41%）出现高滴度抗普瑞凯希Ab（＞1:2430），40%（67/169）的患者出现抗PEG抗体；仅14%（24/169）的患者出现抗尿酸酶抗体，且多为低滴度，其中抗PEG抗体的发生率和滴度与血清普瑞凯希的含量降低相关。可见，临床上可以通过对抗聚乙二醇抗体的监测来确定适当的给药策略或决定是否更换为非聚乙二醇化药物[41]。

6. 基于AAV的基因治疗药物：在目前可用的基因治疗平台中，基于腺相关病毒（AAV）的载体显然已成为最有前景的基因传递载体之一。但因为野生型AAV感染非常常见，30-60%的未用药个体体内都存在阻止AAV转导的中和抗体存在（NAbs）[42]，且经常对不同的AAV血清型产生交叉反应[43, 44]。体内已有的抗AAV抗体是一个棘手的问题，抗体会严重影响AAV基因治疗的疗效，即使低NAb滴度也会影响转基因的表达[45, 46]。因此在治疗前进行抗AAV抗体的检测，对于选择适当的对应措施是非常必要的。最近Janina Haar等建立了一种基于中尺度发现（MSD）的分析方法，用于定量分析AAV2，AAV8和AAV9三种最常用AAV血清型的结合抗体（BAbs）和NAbs，相较传统的ELISA、细胞为基础的NAbs检测等，有快速、可扩展，只需要少量的血清样本、消耗品和病毒储备等优点[47]。

为确保治疗的有效性，许多基因治疗药物的临床试验都纳入了血清抗AAV抗体阳性患者的排除标准。如：近期Lindsey A. George等在一项针对A型血友病患者基因治疗的临床试验中，其在血友病A患者的肝细胞中注入AAV载体，用于VIII因子的表达。在受试者的筛选上，便要求患者SPK200（一种从AAV3中提取的生物工程衣壳）中和抗体滴度小于等于1:5。通过对受试者抗AAV抗体的检测，能发现治疗的适宜人群，以尽可能低的载体剂量安全地给予长期稳定的因子VIII表达[48]。

三、结语与展望

随着各类生物制剂在生物医药领域的广泛应用，药物的免疫原性仍然是长期用药的主要限制因素。针对药物浓度和抗药抗体的伴随诊断重要性也不断凸显。但因缺乏统一的检测标准，许多生物制剂的相关伴随诊断往往难以实施。目前，伴随诊断市场处于飞速发展阶段，临床应用主要还是基因检测为核心。通过对抗药抗体/抗免疫原性抗体相关检测技术及其临床意义的不断研究将推进伴随诊断的综合发展，不断挖掘其临床应用潜力，以此进一步促进个体化用药，指导制定合理治疗方法。

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