临床血细胞分析白细胞相关复检策略
乐家新，解放军总医院第一医学中心检验科副主任技师，30多年在临床一线从事临床基础血液学检验和相关研究。特别在血液分析仪器的技术研究与性能鉴定、临床应用与全面质量管理、国产化试剂研制与质量鉴定、复检规则制定与临床应用、外周血细胞形态学检查与质量控制等方面做了较系统的研究，并进行了许多有益的探索性工作，有较丰富的实践经验。成功研制出七大系列十八种型号进口血液分析仪的国产化试剂50多种，其中12种获得国家颁发的生产批号。参与承担国家及军队等重点课题6项，在国内外医学期刊发表论文50余篇、主编专著3部、参编专著10多部；获国家发明专利2项、军队或省部级医疗成果二等奖4项及其他成果奖项5项。现兼任CNAS医学实验室评审员。
一、临床血细胞检验流程
1. 复检规则方式：在临床工作中，收集到的临床样本，经过各种仪器的分析，得出的结果输送到LIS系统来报告。这些结果经过《复检规则》的综合判定，满足规则属于正常结果的报告经LIS审核发出。如果怀疑形态学有异常，就需要推片制片染片人工镜检。结合镜检结果与图形报告给临床。如果《复检规则》不能通过，就需要复检，按结果综合判断复检方式：（1）在其他机器上进行CBC计数复检；（2）怀疑样本有问题的，需要对样本的性状进行检查，查看颜色状态，是否溶血凝血或有其他的异常蛋白导致的异常使血液分析仪检测结果不正常或出现异常图形和报警；（3）仪器试剂潜在的故障导致假性结果或异常的报警需要人工判定。任何操作都需要按照SOP文件来规范执行。这样处理后的结果才能报告给临床，给临床或患者发出正确的检验报告。
2. 审核规则方式：检测出来的结果通过《审核规则》的判定，认为是正常的结果，直接审核发出。认为明显异常的，可以仪器重测，也可以显微镜镜检。不确定的地方，即灰区，有正常和异常两个通道。但由临床经验判断，灰区属于不确定的结果，必须人工审核。人工审核除了可以走正常直接报告和异常重测/镜检这两条路外，还必须关注样本的性状和仪器试剂的状态，然后按照SOP文件报告结果。
二、复检
做好复检应具备的基本条件：首先需要相应数量、拥有一定能力和责任心的合格检验人员；另外还需要血液分析仪、智能阅片仪等性能优良的仪器（校准及性能验证后使用，要特别关注对原始细胞的检测能力）；质量合格的试剂与标本（如试剂、抗凝静脉血、血涂片）；规范的操作及质控程序（如仪器、筛查/审核、镜检、质控、报告）；还需要合适的环境，例如合适的温湿度、电源、仪器运行、物料存放、人工镜检的环境；最后灵活运用“三三原则”，如镜检的三要三结合、审核与确认的三注意。发出正确的检验结果需要熟知细胞计数、仪器检测原理，用以在复核审核时判断检测结果的合理性正确性。
1. 白细胞计数与分类原理：电阻抗技术白细胞检测原理：稀释后的血液经溶血剂处理后，不同类型的白细胞形成体积大小不同的“膜包核”白细胞。因电阻抗原理，这类“膜包核”白细胞经过微孔检测区时替代等量的电解质溶液导致电阻变化，从而产生相应的脉冲信号。脉冲信号的数量反应了白细胞的数量，不同体积“膜包核”白细胞产生的脉冲信号的大小也不同。根据脉冲信号绘制直方图，将白细胞分为大体积、中等体积和小体积三个群。根据各群在白细胞直方图上所占面积的大小计算百分率。
鞘流光散射技术白细胞检测原理：血液经过稀释后，细胞在鞘流液的包裹下，通过流通池。经光源照射后，低角度散射光检测细胞体积的大小，高角度散射光检测细胞的内含物，即复杂程度，这是最基本的原理。如果仅仅是依靠这个原理，散点图是无法将各种细胞分的很清楚的，特别有异常细胞时也是分不清的。因此各个厂家以鞘流光散射为基础，多种方法联合应用进行白细胞计数及分类。包括物理法：VCS、多角度光散射、鞘流电阻+射频等；化学法：Perox染色、苏丹黑B等；荧光法：XE系列、XN系列、BC系列等。鞘流技术为基础的五分类检测原理：物理方法最典型的是VCS技术。它是通过激光测量细胞内颗粒的特性，高频波分析细胞的核型，低频波分析细胞体积，运用V、C、S三种探针，在流式通道的某一位点对通过的单列白细胞逐个同时进行三重检测及三维分析，以确定其亚群性质。在白细胞分类的基础上还有非线性柔变轮廓分类技术来进行更准确的白细胞分类。化学方法，比如不同的白细胞含有不同的过氧化物酶活性，其中嗜酸性粒细胞最高，中性粒细胞次之，单核细胞比较少，原始细胞中粒系有少量活性，单核细胞有微量的活性，其他的例如淋巴细胞有核红细胞没有活性。白细胞经过过氧化物酶染色后，在胞质中根据过氧化物酶的大小，使得白细胞的复杂度增加，各个类型的白细胞差异度增加，便于进行白细胞的分类。荧光法例如聚次甲基荧光染料经过染色后，侧向荧光反映DNA、RNA的信息，侧向散射光（高角度）反映细胞内容物复杂程度，前向散射光（低角度）反映细胞大小信息。不同细胞的特性不同，DNA、RNA含量不同，就能得到相应的散点图。IMI通道是一种特殊通道，主要是检测未成熟粒细胞的通道，通过相应的技术得到不同未成熟粒细胞的区域。还有某国产的仪器使用的是花菁类荧光染料，同样从低角度测细胞体积、高角度测量细胞的复杂度、侧向荧光测量荧光强度，但它的优点在于合成的是多维度的散点图，图像可以进行旋转，从而从多角度观察不同细胞所在的位置，便于我们更加精准的识别白细胞。
使用哪种类型的仪器，就需要了解其原理，熟悉散点图及细胞分布的位置。白细胞分类的技术在各个厂家也还在不断地改进，更加敏感地检测异常细胞。要使检测更加敏感，就需要从细胞核和细胞质两方面深入探究。胞核里可以改善相应的荧光强度检测DNA、RNA。胞质里主要是要增加复杂程度。
2. 核质双检技术（DIFF+WNB双通道联合检测和试剂+算法）：通过试剂+算法的原理来改进白细胞的分类。试剂是指白细胞溶血剂的溶血力相应的减弱，对白细胞的损伤减小；荧光染料进入细胞染色后加上细胞本身受损的影响，在之前的基础上分析的敏感度和分析的图形会更加优质。这样得到的散点图在原来散点图的基础上把异型淋巴细胞和原始淋巴细胞区分开，同时将异常淋巴细胞和淋巴样的原始细胞也进行了区别，核左移和未成熟粒细胞在这个通道里也更加明显。其原理是，综合性解析散点群的形状、重心位置，将各种不同的异常图形模式化、与正常图形的差异数字化来进行判断。
（1）DIFF通道核检—试剂两部曲：无差异化打孔、点亮细胞核：①DIFF试剂非特异性地结合膜蛋白，使其变性脱落形成膜孔；②荧光染料特异性地与核酸结合，原始细胞染色质更疏松，更高效地结合核酸，且原始细胞核酸含量更高，荧光强度更强。细胞经试剂处理完后检测的散点要经过算法的处理。算法是指DIFF核检9大信息特征进行综合的分析（Lym团面积增大、Lym荧光方向展出粒子、Mon上方展出粒子荧光信号强且体积大、Mon面积大、Mon荧光信号强、Mon和Lym边界不清晰、Mon和IG边界不清晰、Neu位置靠左、Neu面积大FL高度大），最终体现在散点图上，特别是异常细胞、原始细胞的检测敏感度增加。有文献报道这类技术的检测敏感度可以达到0.4%，也就是说1000个细胞里出现的4个原始细胞能被检测到。
（2）WNB通道质检—试剂两部曲：差异化打孔、点亮细胞质：它是基于原始细胞和成熟白细胞里包囊的数量和体积大小不一。WNB通道中，试剂特异地改变原始细胞质中转运囊泡的大小，显著增大原始细胞胞内复杂度，使得其侧向散射信号（SS）显著大于成熟白细胞，有助于原始细胞的识别。算法上，胞质里囊泡的大小经过试剂处理后，用仪器来进行检测，它的复杂度增加，相应的散点的位置就会增加。WNB质检的5大特征信息（特征区域粒子比例、幼稚粒细胞干扰识别、异型淋巴细胞干扰识别、异常单核细胞干扰识别和异常中性粒细胞干扰识别）经过处理后得到相应的散点图。特别注意的是，这种技术的改变并没有增加检测的通道，那么在原有通道的基础上就不会增加成本。这个通道可以进行旋转，通过改变角度来全方位观察。
外周血经特殊试剂处理后，到DIFF和WNB双通道联合检测，得到“核”特殊信息和“质”特殊信息，再经过综合分析，使得原始细胞的检测更加精准。“核质双检”是双通道协同的检出，两者缺一不可，实际根据样本类型的差异，双通道侧重略有不同。比如髓系的细胞主要在A区、Blast%≥5%淋系和单核系主要体现在B区，Blast%≤5%淋系和单核系主要体现在C区。不同类型的细胞它的灵敏度和特异度有各自的特征，所以在使用仪器前的性能验证环节要做好。
（3）临床案例：因腹胀、腹痛、腰痛不适2月余就诊。血细胞分析仪显示贫血和血小板减少，报警信息提示“异常淋巴细胞/原始细胞？”。按照实验室复检规则，进行外周血涂片复检，结果显示：原始细胞4%。完善骨髓检查及相关辅助检查后诊断为急性淋巴细胞白血病。DIFF通道中，该样本呈现出淋巴细胞群中部分细胞荧光变强的“核”特征信息。WNB通道中，原始细胞“质”特征信息明显，该特征区域粒子占比为4.62%。通过“核质双检”技术特征综合模块准确提示原始细胞报警，为实验室高效检出原始细胞和早期临床介入急性白血病诊疗提供了重要参考依据。在日常工作筛检时，如若仪器没有报警信息、图形基本正常，正常来说不需复检，只报仪器检测结果，如果仪器检测的敏感度和特异度提高，仪器报警后必须进行制片染片镜检。
再次强调，要做好复检工作，必须熟悉血液分析仪的检测结果、图形和报警信息。使用哪家的仪器就要熟悉相应的检测原理、特点、优势和缺陷。只有掌握这些知识，才能在工作中有的放矢。
3. 血细胞分析复检的“双观检查”（宏观睛检、微观镜检）：宏观睛检掌握的信息量大，微观镜检掌握的信息量少。如果直接微观镜检就会遗失掉很多宏观的信息，比较片面。其中宏观睛检有4个要素：①血液分析仪检测结果及历史结果；②图形变化；③报警信息；④病人临床资料。微观镜检中人工镜检需要掌握4个重点：①血涂片浏览。看显微镜下血片的宏观。看血片染色的情况、细胞分布、细胞完整情况，还有白细胞、血小板的数量和仪器计数结果的符合性等；同时也要关注有无血小板聚集、红细胞凝集、异常细胞和寄生虫等。能否在低倍镜下识别出异常细胞，这也是能力的体现；②白细胞分类。要关注行标在血片体尾交界处城垛式计数，数上不数下数左不数右，否则将会漏掉异常细胞；③血片详查。查细胞的形态；④善于联想。微观镜检中仪器镜检遵循2个原则：①必须人工确认后才能发报告；②有疑问必须人工镜检复核。仪器镜检有两种模式，一种是进行细胞准确定位、细胞形态识别的模式，一种是对异常细胞、大血小板和血小板聚集的识别模式。两种模式缺一不可。
4. 血细胞分析筛检后的复检策略：筛选出来需要复检的标本，在宏观睛检后，根据相应的情况，进行标本性状检查、仪器试剂检查、CBC复查、遵循《血涂片镜检质控程序》进行血涂片微观镜检。复检结果（和/或其他结果）需要宏观睛检确认。后经过自审和/或他审进行审核确认和结果报告。遵循《血细胞分析报告规范化指南》发出数值报告和/或数值+描述性报告，包括形态描述、诊断建议、后续措施。审核时遵循宏观睛检的四要素、微观镜检中人工镜检的四重点和仪器镜检的两原则。宏观睛检与微观镜检的关系：宏观睛检定方向，微观镜检“敌特”抓。
5. 血细胞分析复检案例分析
（1）案例1：患者男67岁，因右眼眶脓肿在当地医院眼科引流后抗生素治疗1个月伤口不愈合，于2010年11月6日转来我院眼科就诊，首次血常规结果如下：（病历记录在当地医院初诊时WBC为4.49）WBC-0.94，RBC-2.36，HGB-72，HCT-23.3，MCHC-309，RDW-SD-70.1，RDW-CV-19.6，RDW-19.9，P-LCR-44.5，NEUT#-0.16，LYMPH#-0.75，MONO#-0.02，EO#-0，BASO#-0，NEUT%-17，LYMPH%-80.9，MONO%-2.1，EO%-0，BASO%-0，其余数值正常。报警：中性粒细胞、淋巴细胞、白细胞低，红细胞低。怀疑：有核红？宏观睛检后确定的关注方向：异常白细胞、低值血红蛋白。
结合病历怀疑是否为绿色瘤，但因病历中无脓液颜色无法判断。后寻找白细胞层，推片镜检，全片查找，找到2个原始细胞，病人随后转到血液科诊治，最后确诊：ANL-M2。绿色瘤：粒细胞肉瘤，是指幼稚粒细胞在骨髓外部位形成的局限性实体性肿瘤。因其颜色淡绿（瘤细胞原浆骨存在淡绿色色素），肿块呈圆形隆起似瘤，因此得名，绿色瘤在临床上很少见。可早于白血病出现，也可与白血病同时或之后发生。患者多为外观健康的儿童，男性较女性多见。后此病人按照ANL-M2治疗，恢复良好，虽不得而知是否为绿色瘤，但也给疾病诊治提供了新思考。对于白细胞减低的患者，我们在关注细胞数减低的同时要特别关注形态学的变化，特别是临床上抗生素治疗后经久不愈的患者，要尤其谨慎。
（2）案例2：朱某某，男41，2月前发现右侧颌下肿物，略有压痛，并出现咽部疼痛，吞咽食物时加重，无发热、咳嗽等症状。2015年6月18日患者在住地A院查血常规：白细胞减低（1.34），未见镜检结果。后就诊于当地医科大学附院（B院），查血常规：白细胞计数1.46，也未见镜检结果；给予口服阿奇霉素及中药，咽部症状有所减轻，但出现牙龈萎缩、盗汗症状。于2015年7月14日来我院就诊，血常规结果如下：WBC-1.14，RBC-4.08，HCG-132，PLT-68，PCT-0.07，NEU#T-0.12，LYMPH#-0.99，NEUT%-10.5，LYMPH%-86.8，其余结果正常。报警：未成熟粒细胞？中性粒细胞减少、白细胞减少。宏观睛检后确定的关注方向：异常白细胞、低值血小板；同时看看有没有血小板聚集等异常情况。
复查白细胞1.14，镜下中性粒细胞1/10，淋巴细胞9/10。但根据临床信息等不能确定。后再次复查，浓缩白细胞制片染色镜检，发现异常早幼粒细胞5/20个WBC，完善检查后确诊APL。在此例病例中，要注意宏观睛检不能与微观镜检脱节，注意人工镜检4要素要做好。
（3）案例3：患者男，23岁，半月前无明显诱因出现牙龈出血，不易止住伴有乏力，无明显畏寒、发热、头痛、头晕、胸闷、心悸、气促、腹痛等不适，2021年3月31日来院就诊，血常规结果如下：WBC-1.17，NEU%-59.9，LYM%-38.2，NEU#-0.7，LYM#-0.45，HGB-69，RBC-2.08，PLT-22。报警：WBC:异常淋巴细胞、原始细胞？未成熟粒细胞？核左移？有核红细胞，淋巴细胞减少，嗜中性粒细胞减少，白细胞减少，三系减少；RBC/HGB：贫血；PLT：血小板减少。宏观睛检后确定的关注方向：异常白细胞、低值血小板、低值血红蛋白。
经阅片机自动扫描后，人工确认发现典型的异常多颗粒早幼粒细胞。
（4）案例4：患者女，65岁，冠心病初诊，左束支堵塞拟放支架，首次血常规结果如下：WBC-2.84，RBC-3.77，HGB-114，PLT-57，NEUT#-1.74，LYMPH#0.88。宏观睛检后确定的关注方向：异常白细胞、低值血小板。
怀疑有异常白细胞，微观镜检时要注意观察血膜两侧、血膜尾部，不好找细胞时需要浓缩白细胞。低值血小板微观镜检时要注意查找有无血小板聚集。若仪器无报警，容易被漏检。观察图形和血常规结果，发现PLT直方图尾部升高，MCV-89.7，RDW-CV-14.1，这些数值提示在微观镜检时应关注是否有巨大血小板，红细胞的形态大小是否不均一，有没有非血小板物质的存在比如细胞碎片等。后经镜检发现血小板聚集，指血复查PLT-101。
（5）案例5：患者女性，42岁，右乳肿物，血常规结果：WBC-3.43（L）（低限），RBC-3.64（L），HGB-100（L），PLT-88（L），HCT-0.303（L），RDW-17.3（H），MPV-16.9（H）。
散点图上有一片较多的蓝色的区域，考虑有核红细胞？还是巨大血小板？或是血小板聚集？血小板直方图有高跷尾。MCV-83.2（N）结合RDW轻度增加判断有无红细胞碎片？后经阅片机扫描血涂片，发现巨大血小板和血小板聚集。仪器阅片的优势是集中显示，便于识别。
（6）案例6：患者男，5岁，2022年4月15日主因面色苍白伴头晕、右膝关节疼痛，伴低热37.4℃，于外院确诊为急淋治疗一周。为求进一步诊治，就诊于我院，血常规结果如下：WBC-8.38，NEU#-0.73，LYM#-6.94，NEU%-8.8，LYM%-82.7（H），RBC-2.74，HGB-83，HCT-0.259。报警：WBC散点图异常？原始细胞？异常淋巴/原始细胞？淋巴细胞增多，（推片）原始细胞报警。发现散点图单核细胞、淋巴细胞融为一体，仪器扫描发现大小不一以小为主的的原始细胞，因为是治疗后，可看到细胞的染色质更粗，核的形状不规则。
（7）案例7：患者女，19岁，外院查血白细胞增多来我院血液科门诊就诊，首次血常规结果如下：WBC-19.78（H），RBC-4.84（N），HGB-136（N），MCHC-305（L），RDW-15.1（H），PLT-328（H），仪器未出白细胞分类结果。
白细胞散点图主要呈灰色，提示可能有异常细胞，有三个不可靠信息：第一，中性粒细胞散点区左下方出现较多灰色密集散点；第二，中性粒细胞散点区有许多未成熟粒细胞散点；第三，血小板直方图左移。重新采血后检测结果：WBC-12.43（H），RBC-4.83（N），HGB-134（N），NEU%-0.744（H），LYM%-0.18（L），MCHC-340（N），RDW-14.9（H），PLT-123（N）。血小板直方图、散点图都不再有以上信息。WBC从19.78到12.43，重测前MCV-92.1，重测后MCV-81.6，PLT从328到123。血小板怎会降低200这么多？未成熟粒细胞怎会不见了？宏观睛检和微观镜检既是相互促进相互帮助的，也是相互监督的。要灵活运用到关键点上，体现出对仪器性能和对仪器图形的熟悉。最终，发现有一包抗凝管里出现少量抗凝剂增多，采集80微升到100微升的血，不能完全溶解这些抗凝剂，这些未溶解的抗凝剂阻碍了白细胞和血小板的计数，干扰了白细胞、血小板的数量，也干扰了白细胞分类。同时，高渗情况下，红细胞是一种皱缩状态，在吸入仪器稀释时遇到等渗或等张的稀释液，红细胞体积瞬间有一个涨大，这个涨大导致红细胞体积的增高，HCT也加以增高。如果这是个要手术的患者，需要根据HCT的结果监控血容量，在这样导致的HCT假性增高的情况下，就会导致病人在手术过程中的血容量控制不当，有可能出现医疗事故。
（8）案例8：患者男，49岁，血液内科，2021年6月无明显诱因出现乏力，纳差，有四肢无力感，发烧，未重视。2021年10月喷嚏后出现双侧胸壁疼痛不止，于当地医院查血常规，确诊浆细胞白血病，至我院进一步治疗。查血常规结果如下：WBC-10.43，NEU#-5.41，LYM#-1.86，MON#-3.15，EOS#-0.01，NEU%-51.9，LYM%-17.8，MON%-30.2，EOS%-0.1，RBC-3.47，HGB-104，HCT-32，RDW-CV-18.4，RDW-SD-64。宏观睛检后确定的关注方向：异常白细胞，低值血红蛋白。
异常白细胞体现在形似三级运载火箭的散点图上，出现了非常强的荧光，而且单核细胞区密度增大，区域增宽，有少量有核红细胞。在仪器扫描时发现了非常典型的异常浆细胞。
清晰的细胞图是建立在制片染片、质量符合要求的基础上，任何一台性能优良的血细胞阅片设备或一个高素质的镜检人员，如果没有高质量的血涂片是达不到好的检查效果的。另外，如果发现仪器黑色背景的散点图不易辨别，可以转换成白色背景，这样散点清晰易辨认。在日常工作中，碰到高血红蛋白的血标本，制片十分不易，易出现人工异淋的情况。除此以外，当出现以下情况必须复检：无论是哪个科室的病人，首次出现原始细胞报警或散点图上出现异常散点均需要镜检；红系参数异常，白系无异常，比如红细胞体积异常和RDW的升高，触发复检规则必须镜检；当出现有核红细胞、未成熟粒细胞等均需复检。
三、总结与思考
人工镜检中需要联想是笔者认为需要重视的一点。看到异常血小板直方图时要注意镜下有无巨大血小板、血小板碎片、血小板聚集，做镜检的老师需要关注有没有通过光学通道或显微镜技术来排除以上因素的干扰。当关注到血片上有很多靶形红细胞时，也要注意小红细胞、红细胞碎片对血小板计数的影响。另外，当镜下发现巨大血小板、碎片红细胞时，要关注血小板直方图如何分布，数量是否正确。当镜下发现非晶型物质存在时，要注意对散点图、血小板计数有怎样的干扰。当低倍镜扫描发现血膜上有大空泡时，要思考是样本本身的油脂还是玻片不干净，这种油脂的存在对在不同仪器上不同原理下的直方图和散点图有怎样的影响，对结果是总数的影响还是分类的影响。所以这些思考都提示我们，人工镜检一定要善于联想。这样才能使宏观睛检和微观镜检相互补充，真正做到宏观睛检定方向，微观镜检“敌特”抓，这就是血细胞分析复检的策略。血细胞分析复检愿景是阅清晰，智从容，双观检，复轻松。发现仪器图形异常，报警信息提示，镜下各类血细胞形态完整、特征明显，阅片机扫描清晰，抓图快归类准，加上宏观微观的双观检查，复检工作才能轻松。
