过敏原特异性IgE抗体 实验室检测规范要求

血清和血浆（血清+纤维蛋白原）被认为是本文中所讨论的过敏原特异性IgE抗体检测的工作标本。可供选择的标本类型，如眼泪，支气管或鼻灌洗液，痰，脑脊液和细胞上清液主要用于科研中，很少有厂家声明它们的检测方法可以分析这些标本。如果从患者那采集的血液比取样装置要求的血量少时，不平行性或蛋白质基质效应的问题可能会加重。严重溶血、黄疸或脂血血清/血浆标本，因其可能带来的干扰，不应该用于IgE抗体的检测。可能的干扰物质，如高水平的血红蛋白、胆汁和脂质，应该由厂家鉴定，并列在产品介绍中。

基于经验的工作，下面的一般性建议将有助于血标本在不同的储存条件下维持稳定。虽然通过聚苯乙烯泡沫塑料运输的血清，室温下可维持IgE没有明显降解（当用免疫化学分析时）达一个星期，但建议分离的血清/血浆在室温（例如18℃-25℃）保存不超过8h。在给实验室服务客户建议前，实际存储要求应由检验科的人员研究定出。

如果检测不能在8h完成，建议血清/血浆标本储存于-20℃。但没必要冷冻于更低的温度（如-70℃至-120℃），即使这不会对IgE抗体免疫反应性造成不利影响。血清/血浆标本最好不要反复冻融，因为这可能破坏蛋白质，包括IgE。不建议使用无霜冰箱进行长期储存，因为冷冻/解冻循环可能导致激进的温度变化，这对标本中的蛋白质是有害的。长期储存，冷冻标本开始分相，蛋白质集中于管底。这些分为两相的标本在使用前应该小心地混匀。如果使用血清/血浆分离器，应该有厂家附带的用法说明书和仪器设计的总体积。

过敏原特异性IgE免疫分析的实验室内和实验室间变异以及每日批间确认通常是由厂家和最终用户检验科评估。重复分析含有不同量的IgE抗体的人血清可以保证最后结果报告的质量。虽然已经提出IgE抗体质控血清的制备方案，但实际中获得临床上大量非感染性、特应性患者血清却是困难的，从而限制了这些理论方案的实施。最可行的方案是收集尽可能多的（至少10份）来自高度致敏患者以及有过敏历史和阳性的确证实验（皮肤实验和/或血清学实验）的健康人群的血浆，并且他们没有接受过敏原免疫治疗。接受过积极的过敏原免疫治疗将产生水平达μg/ml的特异性IgG，这将干扰检测水平为ng/ml的IgE抗体的检测实验。当这些血清等量加入时，将使其变为含有多种类型和过敏原特异性的抗体的不均匀混合物。混匀多份血清趋向于浓缩最常见的IgE抗体特异性和稀释少见IgE抗体特异性。因为使用单一个体血清将过于代表少数特异性反应，而使用不同血清混合物将削弱这些相同的少数特异性，所以在文件化特异性IgE抗体检测的有效性时，为了互补，单一个体血清和混合血清都应该使用。 

在某些情况下，可以通过多种免疫学方法，如对流免疫电泳或可溶性抗原抑制蛋白免疫印迹法（Western blot）分析，进一步对血清的异质性进行表征。潜在的竞争性抗体（IgG和IgA）可通过免疫分析直接检测，以分析其对IgE抗体与较小抗原决定簇结合的竞争性抑制和阻碍作用。对于厂家的质量控制，生产过敏原试剂的厂家应该有单一个体血清和一系列参考血清，后者是从未治疗的对各种过敏原过敏的患者中制备而来。

放射过敏原吸附试验（Radio Allergosorbent Test，RAST）是最早引进用于检测过敏原特异性IgE抗体。这种非竞争性异相免疫放射分析运用吸附于纸片上的过敏原特异性结合血清中所有同型抗体；分离游离和结合的人类抗体；并运用放射性标记抗人IgE去检测结合的IgE抗体。随后基于这种方法的许多不同商业化方法也发展起来[3-5]，后来许多方法都不再使用。反向的或利用液相抗原捕获形式的方法中，开始利用固相抗-IgE来捕获血清中的IgE，然后特异性IgE通过标记的过敏原来检测，这些反向分析方法很少应用于临床。它们与利用吸附过敏原的分析方法比具有的优势在于：它们不检测低亲和力的抗体，这些抗体可能具有较小的临床意义。由于它们主要用作科研工具，本文中不再讨论。所有其他IgE抗体检测方法拥有下面共同点：①反应容器：塑料（聚乙烯）或玻璃管；②过敏原试剂：固相吸附过敏原或液相标记过敏原；③抗人-IgE Fc检测试剂（ε重链特异性）；④校准系统（例如，用含有确定量的IgE标准血清绘制的总IgE校准曲线）；⑤反应缓冲液（盐溶液、蛋白质）维持pH值并为待检分析物提供蛋白质基质以确保最低的非特异性结合；⑥标本：可能含有IgE抗体的人血清和不含过敏原特异性IgE抗体的阴性对照血清；⑦数据处理系统。这些组分中，过敏原试剂因其是从未加工的生物材料中制备而来以及需进行批间质量控制和确认，被认为是最复杂的检测成分；第二重要的试剂是抗人-IgE检测试剂，其赋予方法IgE抗体特异性。第三重要部分是校准系统，用于确定被检测IgE抗体的水平。

根据检测结果能够准确反应标本中IgE抗体的含量的程度以及检测精密度要求，商业化的IgE抗体免疫分析可分为定性、半定量和定量检测[6]。每种检测类型在帮助过敏性疾病诊断和研究中有其适用性和局限性。对于过敏原特异性IgE抗体检测，三种检测类型的结果呈现、标准化方法、标准/参考校准物和精密度要求概括在表1中。

表1 过敏原特异性IgE抗体免疫分析的一般分类方案

抗人IgE特异性抗体作为捕获和检测试剂已经被用于过敏原特异性IgE抗体检测中。抗人IgE抗体一旦纯化将可直接用作液相中的抗体，或者经放射标记、酶标记或化学和物理法固定于固相载体上。这些关键的试剂赋予了IgE抗体检测方法的特异性，因此他们必须对特定的决定簇ε重链高度特异。最早的多克隆试剂是从免疫动物中纯化的IgE骨髓瘤蛋白。对人IgE特异性的单克隆抗体已商业化。现在一些厂家利用单克隆和多克隆抗人IgE混合物捕获血清中的IgE或检测预先绑定的IgE抗体。

过敏原试剂是赋予IgE抗体免疫分析过敏原特异性的关键组分。通常，它是IgE抗体检测中最复杂和高度变异的试剂。有许多原因可导致过敏原试剂的异质性，即使是同一厂家采用相同的提取源、化学试剂和相同的制造规程。除了这些原因导致过敏原试剂异质性外，厂家通常通过推荐使用特定批号的试剂组合来最小化实验的变异。当使用规定的试剂组合，检测方法的批内和批间变异均应在预设的、可重复的目标范围内。

根据检测系统提供的定量水平，经典的IgE抗体水平是使用若干随意单位来报告的。在定性试验中，根据检测反应信号与预先设定的阳性阈值水平比较，报告血清标本中IgE抗体为阳性或阴性。在一些半定量试验中，不仅需报告阳性/阴性结果还需报告检测信号大小（例如，发光单位[LU]，毫伏特[mVolts]）、分数等级、调整的或标准化的计数或最低控制百分比。信号的强度与待检血清中IgE抗体的量的等级顺序相关（但不是直接与其成比例）。

定量IgE抗体检测利用更先进的检测校准方法。定量检测中校准的目的是定义试验的剂量-反应关系，以便从患者血清检测中获得的反应结果可以被转换为与血清中IgE抗体相对量相应的剂量单位。同源和异源插入法已被成功应用于商品化的IgE抗体检测[6]。同源插入法程序的整个过程中采用相同的固相过敏原，并使用与待检血清具有相同过敏原特异性的人IgE抗体，从而提高了整个检测的平行性和最大化检测工作范围。通常，IgE抗体标准血清按照待检血清IgE稀释相同的方法稀释，因此保证了检测平行性。此方法具有确定工作范围的优势和检测每种过敏原特异性的局限性，但这种方法的主要局限性在于其要求大量含有针对每种待检过敏原特异性的IgE抗体的人血清。

由于同源插入法校准方法具有IgE抗体血清的限制性，来源于血清总IgE校准曲线的异源插入法已经应用于现代涉及上百种不同过敏原特异性IgE抗体定量检测的校准。异源插入法系统已经成为产业标准，同源插入法至今只用于检测，不再商业化。异源插入法系统使用可以溯源至WHO 75/502的IgE校准物，血清总IgE校准曲线与检测系统中过敏原特异性IgE一起检测。这种校准方法的优势在于其可应用于所有IgE抗体检测厂家。通过证明校准（总IgE）剂量-反应曲线与患者血清中IgE抗体稀释水平相平行来证明线性。这种系统已成为解决批间交叉标准化的通用方法。

血清过敏原特异性IgE抗体检测分析性能包括精密度和复现性（变异）、变动范围、检测限、分析准确度和线性。下面主要讨论分析准确度和分析干扰。

术语“准确度”指的是单次检测结果与公认的或真值之间的接近程度。一次准确的测量具有较小的误差的特点，此误差是系统误差和随机误差的无偏估计。为准确检测血清总IgE，使用WHO IgE血清标准75/502和US IgE标准作为主要的参考物质。对于过敏原特异性IgE抗体检测，目前没有普遍认可的附有过敏原特异性IgE校准水平的IgE抗体标准[7-9]。因此，用回收实验证明IgE抗体检测的准确度非常困难。许多研究均是基于抗体吸附或消耗的方法，制备出二级IgE抗体标准物质。并且人源化的IgE嵌合抗体已用于校准以质量/体积为单位的IgE抗体检测。由不同方法检测相同的稀释样品得出的实际结果与理想方法所得的预期结果进行回归和最小二乘法分析，其中理想方法的半对数图的稀释回收斜率为1。这些规程对于评价IgE抗体检测准确度和报告工作范围相关的定量特性是有效的。

许多因素可能干扰过敏原特异性IgE抗体的免疫分析性能。厂家应该评价人类类风湿因子、天然存在和治疗引起的抗人-IgE自身抗体和人IgG抗过敏原抗体对检测方法准确度的影响。人类类风湿因子是一种能够交联人免疫球蛋白的自身抗体，也是已知的能够交联其他物种的免疫球蛋白。这样，它们会干扰使用来源于动物的单克隆和多克隆抗体血清的试验，并且可能导致人类抗体检测免疫分析时假阳性和假阴性结果。已经发现天然产生的抗-IgE抗体是结合在嗜碱性粒细胞上，它们的临床意义目前还不明确。治疗导致的抗人-IgE抗体是已知的能够干扰过敏原特异性IgE检测的抗体。它们对人IgE抗体检测可能的干扰应该在方法开发的确认阶段进行评价。大量文献报道一些方法在过敏原过量的情况下IgG抗过敏原抗体很难对实验造成干扰。最后，具有交叉反应的糖类决定簇可能导致阳性的IgE抗体结果，其临床意义不明确。已有报道使用非特异性糖类基质（例如，菠萝蛋白酶或过氧化物酶）来探讨可能的交叉反应，并需要进一步的研究。

患者检测系统质量保证，如检验科用于检测过敏原特异性的IgE抗体的检测系统，对于保证报告结果的有效性非常重要。过敏原特异性IgE检测的质量保证应该考虑3个层次。第一个层次是由厂家在试剂和方法开发阶段执行。如果实施有效，厂家质量保证测试能够最小化后续检验科必须执行的内部的室内质量控制。第二个层次的质量保证是由检验科使用者执行，目的在于证明每个检测方法处于“在控”。第三个层次的质量保证涉及实验室员工参与到外部质量保证调查中。

生产阶段执行的检测方法质量保证试验的类型取决于方法的复杂性和预期的定量水平。一旦试剂组分通过了性能评价，就应该用组合好的实验来检测来自临床记录为非过敏个体（IgE抗体阴性）和过敏个体（IgE抗体阳性）的血清。Westgard和Klee对“多规则”的结构性质量保证方案进行了全面描述[10]。

定性IgE抗体检测，平行检测过敏原特异性IgE阳性和阴性质控血清的结果应该可以正确识别出IgE抗体样品。对于半定量和定量检测，校准曲线至少应该用3个质量控制血清确认，其质控血清IgE水平包含2-3倍检测限、检测范围中点、高水平上限的10%以内。只有针对定量检测，复现性应该以精密度图、验证方法检测限以及稀释-回收分析线性文件化。

建立内部质量控制方案是监管部门对检验科的要求。参考CLSI文件C24[11]获得建立内部质量控制方案的建议。每个方案会根据实验设计和使用的仪器而不同。许多IgE抗体检测方法已商业化，每种方法可能需要稍微不同的质量控制策略。然而不同的检测方法使用不同的过敏原试剂组分。IgE抗体检测的这种特殊性衍生出建立适当的人IgE抗体检测的内部质量控制方案的两种方法。

其中一种方法建议每种过敏原试剂（具有不同的特异性）是每种检测方法所特有的，这些检测方法拥有其自己的特异性IgE质量控制血清，后者应该在每次检验周期中被检测。这种策略没有认识到广泛的稳定性和每种过敏原试剂在投入使用前已由厂家进行质量控制检测。并且这种策略也是不切实际的，且要求每个实验室保存针对每种过敏原特异性的IgE阳性血清库是昂贵的。另一种方法视IgE抗体检测为一种拥有几百种不同过敏原试剂组分的系统。这样每种过敏原试剂都被视为已经经过厂家质量控制，使用者必须简单的确认校准曲线和定性检测的分析阈限值或每个检测周期中半定量和定量检测的校准。这样可以很容易地通过检测总血清IgE类似的方式分析高、中和低三个水平的IgE抗体血清实现。

所有开展血清过敏原特异性IgE检测项目的实验室要求通过其中一个外部实验室间的能力验证调查来证明其令人满意的性能。为了满足这些要求，建议这种调查至少每年3次，每次检测至少5份血清。另外厂家可能提供它们自己的针对特异性IgE检测试剂的质量保证方案给购买它们试剂的实验室。后者是有用的，但实验室不能视为检测实验室性能的充分独立公正的措施。能力验证方案的主要目标是鉴定实验室是否能正确的检测血清标本中不同过敏原特异性IgE抗体。

过敏原特异性IgE抗体结果评价，其数据分为两种类型：①反映存在与否的定性结果（阳性/阴性），某些情况下是来自半定量检测，如多种过敏原筛查，反映IgE抗体相对水平；②定量IgE抗体检测产生的单位结果（例如kIUa/L）。当实验室获得的阳性或阴性结果与同行实验室使用相同方法获得的结果不一致时，定性结果错误。并且，单个实验室获得的不同的定量单位结果也可与使用相同方法的同行实验室获得的单位结果范围进行比较。从基本原则上看，当一个实验室从非过敏性个体（病史阴性、皮肤实验阴性）血清中检测出IgE抗体被鉴定为离群实验室；同样，当一个实验室未从过敏性个体（阳性病史和皮肤试验和/或激发实验阳性）血清中检测出IgE抗体被视为离群实验室。并且，当有足够数量（n＞10）的实验室提供定量检测过敏原特异性IgE抗体结果时，将可能判断某个实验室结果是否在同行实验室95%范围内或范围之外。

试剂产品附件和相关发表的文献中提供的有关性能结果应该包括：试验变动范围证明、批内和批间精密度图形分析、检测限分析、稀释-回收试验结果、具有代表性的过敏原试剂与非过敏性个体血清和高水平IgE血清（IgE骨髓瘤）非特异性结合水平以及过敏原与IgE抗体特异性检测试验结果。

厂家对血清过敏原特异性IgE抗体检测方法的使用建议相关的产品资料有两种类型。第一种是一般性产品信息手册，它包含了检测方法的常见的问题。这些资料在拟定时应该与使用者所在国家的规章一致；第二种是具体的产品资料单，它对于每种过敏原试剂和检测方法组合是唯一的。两种均由厂家提供给使用者。

实验室员工可能参考比对试验数据和重要杂志上发表的评论、来源于能力验证的公共领域的性能数据、内部开展的有效性研究数据来帮助他们选择过敏原特异性IgE抗体检测方法和试剂。实验室应该设计日常的质量控制方案来识别由实验室专业人员、仪器和实验室内相关问题导致的随机的和系统的误差。每个检测周期中使用的质控血清类型和数目应该与检测方法的定量水平一致。选择的质控血清应该能够确认用于指示方法处于在控状态的检测校准曲线。如果按照厂家的程序操作并且试剂批号没有过期，不建议每天检测过敏原试剂的性能。实验室应该根据厂家的建议和内部的确认研究，定义明确的阳性和阴性质控容许限。日常的定量检测的性能最好将每个质控品的单元数据绘制在Levey-Jennings质控图中。最后，有必要将过敏原特异性IgE抗体的检测方法列在每页实验报告上。列在报告中的检测方法为临床专业人员在结果的基础上做出临床决策提供了正式文件形式的关键信息。

首先，相关的医学专业人员应该遵循几个简单的步骤以保证他们将获得最高质量的血清学结果。首先，医学专业人员应该确保实验室通过了适当的评审机构的认可。这种认可可以保证：实施和监督IgE抗体检测的实验室人员是达标的；保存有适当的记录；实验室规程均文件化、经过确认和书面化以确保IgE抗体结果报告的质量。第二，涉及的医学专业人员应该被告知实验室用于检测过敏原特异性IgE抗体的方法。并不是所有的方法表现一样，也不是所有过敏原特异性IgE抗体数据可以用于预测疾病。因此，医学专业人员应该要求实验室将过敏原特异性IgE抗体检测的方法列在实验报告中。第三，检验科要求建立质量保证措施以确保结果报告的高质量。医学专业人员应该要求其1年的（通常是3次）外部能力验证数据，来验证他们血清过敏原特异性IgE抗体检测结果与其他实验室一致。第四，过敏原特异性IgE抗体检测使用的仪器设备或检测平台需要满足适当的地区和/或国家针对体外诊断检测的要求。

在美国临床实验室定量检测的测量项目分为法规监管项目和非监管项目。过敏原特异性IgE检测仍然是非监管分析项目。也就意味着，检查者没有严格的标准来识别表现不好的实验室，及取消其开展过敏原特异性IgE抗体检测项目的权利。早期的过敏原IgE检测没有统一的标准化方案。意味不同的单位IgE代表的IgE抗体的相对水平是完全随意的。这个时期临床从中获得的重要信息是IgE抗体存在与否，并作为“致敏”的指标。总IgE异源校准系统被逐渐地引入过敏原特异性IgE抗体检测方法中，检测方法便可溯源至人IgE国际标准。并且在大部分试验方法中显示总IgE校准曲线与正确稀释的患者标本成线性或平行。这也导致定量检测的产生，并在不只一个案例中，证明了1 IUa/L过敏原特异性IgE抗体相当于1 IU/L的血清总IgE。并且使用大部分的自动化IgE抗体检测系统，稀释品间CV＜20%通常可以在检测方法工作范围内实现。

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北京医院，卫计委临床检验中心——李婷婷  王治国