墨汁染色阴性的隐球菌性脑膜炎一例分析

何宏，病原生物学硕士、主任技师。现任青岛大学附属医院市南院区检验科微生物组组长。从事临床微生物检验工作近20年，具有扎实的专业基础理论知识，在临床微生物学质量控制、病原菌的分离与鉴定、抗菌药物敏感性试验、病原菌耐药监测、耐药机制检测方法等方面积累了丰富的经验。发表多篇SCI及核心期刊论文，发明专利2项。主要社会兼职：山东省研究型医院协会临床微生物学分会副主任委员、山东省细菌耐药监测质量控制中心委员、山东省临床检验质控中心临床微生物检验专家委员会委员、山东省医院协会临床检验微生物专业委员会委员。

刘佶，副主任技师。哈尔滨医科大学病原生物学博士毕业，现任职于青岛大学附属医院检验科，从事临床微生物工作11年。主持青岛市医药卫生科研计划项目及青岛大学附属医院青年基金各一项，并参与多项国家级课题。发表多篇SCI及核心期刊论文。

一、病例介绍

患者，男，72岁。于2022-12-12日，因“发热伴反应迟钝1月，头痛2周”入院。既往有“糖尿病”病史，曾有接触鸽子史。在1月前因上呼吸道感染出现发热、体温最高38℃，伴反应迟钝、嗜睡、恶心、呕吐两次，呕吐物为胃内容物，无头晕，无胸闷憋气，无肢体活动不灵，无言语不清。

体格检查：体温：36.2℃，脉搏：72次/分，呼吸：18次/分，血压：135/75mmHg；神清语利，高级智能粗测正常，颈部略抵抗，双侧克氏征可疑阳性。患者入院完善相关检查，血常规、肝肾功、大便常规、尿液常规、血凝常规基本正常，HIV抗体阴性。血糖测定（空腹）：葡萄糖8.12mmol/L↑，电解质检测：钠128.00mmol/L↓，氯93.00mmol/L↓。腰椎穿刺检查：脑脊液压力为200mm H2O，脑脊液外观无色微浊，细胞总数689.00×106/L,白细胞数659.00×106/L，单个核细胞85.00%，多核细胞15.00%。脑脊液生化：葡萄糖2.10mmol/L↓，氯105.00mmol/L↓，蛋白＞3000.00mg/L↑。

二、患者诊疗情况

布鲁氏菌虎红平板凝集试验阴性, 结核分枝杆菌γ-干扰素释放试验阳性。脑脊液革兰染色，抗酸染色及墨汁染色均为阴性，胶体金免疫层析法（LFA）检测隐球菌荚膜多糖抗原为阳性。培养是金标准，遂向临床建议采集脑脊液，送检细菌培养和真菌培养，及病原体宏基因组二代测序（mNGS）检测。脑脊液培养采用床旁接种入BD儿童树脂瓶中，立即送检微生物室。宏基因组测序报告新型隐球菌及EB病毒。

采用胆固醇硫酸酯复合物剂型两性霉素B与氟康唑联合治疗，为避免药物不良反应，从50mg起始，逐渐加大治疗剂量。患者输注两性霉素B胆固醇硫酸酯复合物过程中，出现全身抖动，伴恶心、呕吐一次，一般情况改善后继续输注，预防性应用盐酸异丙嗪25mg肌肉注射。患者随后两次脑脊液墨汁染色均为阴性，而同份标本接种BD儿童树脂瓶中培养均报阳性，报阳时间分别为3天16小时和3天8小时，转种沙保罗平板与血琼脂平板，35℃培养2天生长为湿润、不透明、边缘完整的乳白色菌落，经MALDI-TOF MS（Bruker Daltonik，Bremen，Germany）鉴定为新生隐球菌，采用ATB Fungus 3进行药敏试验，两性霉素B MIC≤0.5μg/ml，5-氟胞嘧啶MIC≤4μg/ml，氟康唑MIC=4μg/ml，均为野生型（WT）。

隐球菌感染诊断明确，继续抗真菌治疗。在应用两性霉素B出现不良反应，予以地塞米松控制过敏反应，两性霉素B缓慢加量治疗。患者症状缓解，病情稳定，12-24出院，于上海华山医院就诊后建议继续住院抗真菌治疗。12-28日再次入我院，患者病情稳定，头痛轻，无明显发热，应用两性霉素B继续逐渐加量，并与氟胞嘧啶两联抗真菌，诱导期治疗至少4周。用药过程中出现低血钾达2.63mmol/L，继续予以口服补钾的同时加用静脉补钾。于1-31行腰椎穿刺，测脑脊液压力为140mm H2O，脑脊液外观无色透明，细胞总数100×106/L，白细胞数98×106/L，单个核细胞99%，多核细胞1%。脑脊液生化：葡萄糖3.5mmol/L，氯 122.00mmol/L，蛋白822.00mg/L。各项指标有所好转，于2-3出院，嘱出院后当地医院两性霉素B联合氟胞嘧啶继续诱导期治疗，按期复查，不适随诊。

三、分析与讨论

隐球菌是具有宽厚荚膜的担子菌类酵母菌，对人类致病的主要为新生隐球菌和格特隐球菌，其中新生隐球菌主要侵犯免疫功能低下人群，而格特隐球菌主要侵犯免疫功能正常人群。新生隐球菌多存在于陈旧鸽粪或其污染的土壤中，而格特隐球菌存在于植物中，尤其是桉木的腐木中，格特隐球菌具有明显的地域性流行，我以新生隐球菌为主，格特隐球菌少见[1]。

隐球菌病是由隐球菌感染引起的机会性感染，最常侵犯中枢神经系统，引起隐球菌性脑膜炎。大多数隐球菌性脑膜炎发生在获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者中，在HIV阴性患者中，多数也存在免疫功能低下的基础疾病，其中糖尿病的高糖状态导致的宿主免疫功能受损，也是引起隐球菌病的危险因素之一[2]。

该患者HIV阴性，但具有糖尿病史及鸽子饲养史，临床表现具有发热、头痛、恶心呕吐，嗜睡，颅内压有所增高，脑脊液生化及常规亦符合隐球菌脑膜炎，与病毒性脑膜炎不符，布鲁氏菌虎红平板凝集试验阴性,也可排除表现相似的布鲁氏菌的感染，但结核分枝杆菌γ-干扰素释放试验阳性，结核性脑膜炎不可排除。患者脑脊液墨汁染色为阴性，但采用胶体金免疫层析法（LFA）进行隐球菌荚膜多糖抗原呈阳性，由于墨汁染色的敏感度取决于隐球菌的负荷量[3]，而采用脑脊液标本进行胶体金法测抗原的敏感性和特异性可高达98.9%和98.9%[4]，因此初步判断墨汁染色阴性可能为患者脑脊液的隐球菌负荷量较低引起的假阴性，随后将患者剩余脑脊液标本接种于沙氏培养基并无真菌生长也证实了这一点。为进一步证实患者的隐球菌感染，检出病原菌并提供药敏结果，微生物室向临床建议送检脑脊液标本进行细菌和真菌培养以及病原体宏基因组二代测序（mNGS）检测，通过BD儿童瓶增菌培养出了新生隐球菌，mNGS结果也提示新生隐球菌感染，确诊患者为新生隐球菌感染。

本病例在病原学检测时由于隐球菌负荷量低，导致墨汁染色阴性，并且在未增菌的情况下培养仍为阴性，极易发生漏诊，这就提示我们在墨汁染色阴性而临床仍怀疑隐球菌感染的情况下，需要进行隐球菌荚膜多糖抗原的检测以提高检出率，目前隐球菌抗原检测已逐渐代替墨汁染色成为隐球菌脑膜炎的主要检测方法。而新兴的宏基因组测序技术即使存在破壁困难的问题[5]，亦快速的给出新型隐球菌感染的提示，也是辅助诊断隐球菌性脑膜炎的有效手段。而对于培养法这种隐球菌诊断的金标准，本案例将脑脊液标本直接接种沙氏平板并未培养出隐球菌，而两次采集脑脊液标本床旁接种BD儿童瓶，进行增菌培养均获得阳性结果，同份标本进行墨汁染色镜检为阴性，可见对于菌量较低的脑脊液标本，采用这种自动化增菌方式可以提高病原的检出率，从而使后续的药敏试验成为可能，助力临床诊疗。

参考文献

刘正印, 王贵强, 朱利平, 等. 隐球菌性脑膜炎诊治专家共识[J]. 中华内科杂志, 2018, 57(5): 317-323.

Lauryn N, Jonathan K, Ronald O, et al. Cryptococcosis complicating diabetes mellitus: a scoping review[J]. Ther Adv Infect Dis, 2021, 8: 1-10.

浙江省医学会热带病和寄生虫病分会艾滋病学组. 艾滋病患者隐球菌感染筛查浙江省专家共识[J]. 中华临床感染病杂志, 2019, 12(2): 81-86, 106.

Hua RH, Li CF, Bhavana R, et al. evaluation of a new cryptococcal antigen lateral flow Immunoassay[J]. PLoS One, 2015; 10(5): e0127117.

中华医学会检验医学分会临床微生物学组, 中华医学会微生物学与免疫学分会临床微生物学组, 中国医疗保健国际交流促进会临床微生物与感染分会. 宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识[J]. 2021; 44(2): 107-120.