飞行时间质谱技术在核酸检测中的临床应用价值与前景

马庆伟，博士、教授。现任中关村生物质谱转化医学开放实验室主任；北京市临床质谱国际科技合作基地副主任；中国人类蛋白组计划理事、企业工作组组长；出生缺陷防控关键技术国家工程实验室理事；中国医学装备协会理事；中国医师协会检验医师分会委员；科技部重大专项评审专家；北京毅新博创生物科技有限公司创始人兼董事长；北京大学前沿交叉学科研究院工程博士；天津大学客座教授；斯坦福大学访问学者。2006年发表《MALDI-TOF MS引领分子诊断新时代》论文，累计在Scientific Reports, PLOS ONE，Proteomics Clinical Application等杂志上发表论文20多篇。入选2015年中关村“高聚工程”；入选2014年北京海淀区“海英人才”；基于飞行时间质谱系统，在微生物鉴定，基因检测和多肽指纹图谱鉴定进行了一系列的研究，申请相关专利40多项，授权专利33项；参与编写微生物质谱专家共识；承担多项科技部重大专项课题。

【摘要】分子生物学的进步，尤其以聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）和测序为代表的核酸扩增（nucleic acid amplification，NAA）技术，已经彻底改变了生命科学领域。质谱（Mass Spectrometry，MS）通过对临床样本进行准确、灵敏、自动化、高通量的分析，彻底改变了临床分子诊断。NAA与MS的结合，充分发挥前者的高放大率和后者的高质量分辨能力。当今，人类基因组序列、基因结构和基因功能都已初步建立。NAA与MS的结合，在后基因组时代，已经开发了一系列用于临床检测、鉴定、基因分型、定量和抗微生物耐药性测定的高速高通量核酸技术。因此，NAA-MS是未来几年临床检测、鉴定、基因分型、定量和抗微生物耐药性测定最有前途的技术之一。本文论述了核酸扩增与质谱相结合的临床检测与鉴定的最新成果和临床应用价值及前景。

【关键词】微生物鉴定；质谱；核酸扩增

20世纪80年代出现的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技术[1]，打破了以往质谱仅可进行小分子物质分析的传统，使得核酸、蛋白质等生物大分子也可应用质谱进行研究，极大推进了基因组学、蛋白质组学的发展，并且给生物领域及医学领域带来了革命性的突破。美国食品药品监督管理局（FDA）于2014年批准MALDI-TOF MS可用于临床核酸检测[2]。

质谱最初广泛用于有机化学领域，随着“软”电离方法的发展，质谱技术已经得到了巨大的发展，并成为分析包括核酸在内的[3-4]大生物分子的最有效工具之一[1, 5, 6]。在本文中，将重点介绍和论述核酸扩增与质谱相结合的临床检测与鉴定的最新进展和临床应用价值，并展望核酸质谱的未来发展。核酸质谱的原理如图1所示。

一、中国核酸质谱技术的发展历程

中国核酸质谱的发展几乎与世界同步，经历了从跟跑到并跑，甚至领跑的历程。Ma等[8]最早在国内介绍了基质辅助激光解吸飞行时间质谱，该文对于飞行时间质谱在微生物鉴定、核酸检测、蛋白分析等领域的应用进行了介绍，并对MALDI-TOF在分子诊断领域的各方面应用进行了前瞻性的分析。在单核苷酸的多态性（single nucleotide polymorphism简称SNP）方面，Ma等[9]在2007年介绍了怎样从数百万SNP中，找到确有临床意义的功能性SNP，是药物遗传学和个体化医学所面临的重大挑战。会为明天个体化医学理想的实现带来令人鼓舞的曙光。

国内仪器的突破发生在2011年，国内首台用于核酸检测和分析的商用质谱平台，Clin-TOF（Bioyong，毅新质谱）研发完成，荣获北京创新产品金奖。经过3年的努力，Bioyong团队与首都医科大学附属安贞医院团队选取2011年1月至2013年1月北京安贞医院心脏外科心脏机械瓣膜置换术后接受华法林抗凝治疗的患者10例，采集外周血，提取全血基因组DNA，用MALDI-TOF MS技术检测患者华法林代谢酶基因多态性。成功建立MALDI-TOF MS技术检测华法林代谢酶基因多态性的平台，该法具有高通量、快速、准确的特点，在个性化医疗上有较大的推广应用价值[10]。

在一年以后，在北京市科委的支持下，Bioyong团队展开了基于飞行时间质谱系统的新生儿耳聋基因检测研发。开发了一种同时检测10处与遗传性耳聋相关的基因多态位点的引物系统。基于该引物系统所制备的产品，能实现同时对遗传性耳聋相关的10处基因多态位点进行检测。使用该产品对被检者在10处基因多态位点的基因型进行检测，检测结果可以辅助临床诊断，也可用于流行病学调查及产前筛查、新生儿筛查等领域。该方法可以在一个反应体系内对不同基因上的10处基因多态位点同时进行检测，较测序、实时荧光定量PCR等技术成本更低，操作更简便，准确度和灵敏度提高。该方法申请了发明专利。

2016年是中国核酸质谱的发展取得重大突破的一年。首先，Clin-ToFⅡ核酸质谱获得NMPA认证，国际首创单机多组学检测，一台仪器可同时满足微生物、核酸等领域应用。该团队承担科技部微流控芯片核酸质谱专项。在应用方面，与协和医院团队合作，用MALDI-TOF-MS技术检测53例患者药物代谢酶基因[11]，建立了检测药物代谢酶基因多态性平台，该平台具有高通量、准确的特点，对个性化用药治疗具有重要的临床应用价值。

随着应用的深入，2017年哈医大一附院开展耳聋基因检测及高血压等精准用药项目。华大基因采购毅新质谱仪用于耳聋基因检测。2018年参与编写中国首个核酸质谱专家共识[12]。2019年二十项耳聋基因检测、叶酸与维生素D检测、高血压、高血脂、高血糖、抗凝抗血小板、精神类、麻醉类药物基因检测等多项核酸样本预处理试剂拿到一类备案证。2020年中国首个飞行时间质谱的行业标准参与制定。Clin-ToF I、Clin-ToFⅡ飞行时间质谱仪均入选第二批新冠肺炎疫情防治急需医学装备目录。国产质谱状元花落毅新博创。Clin-ToF飞行时间质谱系统及新冠病毒相关检测试剂盒为中关村首批抗击疫情的新技术新产品新服务。Clin-ToF飞行时间质谱系统荣获中关村国际前沿科技创新大赛——病毒检测技术领域TOP10。与安徽省疾控联合发表国内首篇核酸质谱检测论文：PCR-核酸飞行时间质谱系统检测新型冠状病毒方法的建立及应用研究[13]。Clin-ToF飞行时间质谱系统参加卫生部临检中心室间质评，多次100分通过，这意味着核酸质谱技术获得了以卫生部为代表的广泛认可。

除了仪器设备研发，Bioyang团队还进行了试剂研发和软件研发包括：飞行时间质谱系统基因分析软件：可快速、直观进行检测结果分析。软件核心功能构成包括导入样本、导出结果、导出位点信息等。

中国核酸质谱的发展吸引了业界同仁的关注，逐渐形成合力。2021年Bioyong团队与诺赛基因（国家基因组北方中心）共建核酸质谱临床研发中心；与岛津公司就核酸质谱达成战略合作协议；与首医临检中心合作，推动精神类药物基因检测服务项目。

核酸质谱研发征程筚路蓝缕，毅新博创专注临床质谱十八年的历程波澜壮阔，实现临床质谱中国梦的意义与价值体现在实施健康中国战略。要完善国民健康政策，为人民群众提供全方位全周期健康服务。深化医药卫生体制改革，全面建立中国特色基本医疗卫生制度、医疗保障制度和优质高效的医疗卫生服务体系，健全现代医院管理制度。坚持预防为主，深入开展爱国卫生运动，倡导健康文明生活方式，预防控制重大疾病。

二、核酸质谱的研究最新成果

1. 工作流程：核酸扩增质谱检测（nucleic acid amplification MS，NAA MS）的工作流程由三个关键步骤决定：样品制备、核酸扩增、质谱检测（图2）。

图2. 核酸扩增质谱检测的工作流程。

样品制备的另一个重要考虑因素是质谱检测。样品应针对MS进行优化。各种质谱都有一些必须考虑的因素，如体积、浓度、样品状态、溶剂成分。样品制备中最重要的考虑因素之一是确定样品必须处于何种条件下才能成功进行MS检测。在某些情况下，分析物本身必须在进入离子源之前进行纯化。在其他情况下，MALDI基质或分析物周围的溶剂是需要考虑和调整的最重要因素。

在纯化和扩增步骤之后，通过MS分析得到的NA样品的结果。整个测试过程可以在样本溯源、仪器控制、数据处理、结果搜库等四个方面实现自动化。

2. 技术优势：核酸扩增质谱分析的联用既发挥了前者的高扩增能力，又发挥了后期的高质量分辨能力。NAA-MS是最有前途的微生物鉴定技术。表1总结了常用基因检测技术的优缺点。

3. 核酸质谱临床应用领域：主要包括药物基因组学检测、传染性疾病检测、遗传病筛查、肿瘤相关检测、健康管理等（图3）。

图3. 核酸质谱临床应用领域。

（1）药物基因组：郭等[10]选取2011年1月至2013年1月北京安贞医院心脏外科心脏机械瓣膜置换术后接受华法林抗凝治疗的患者10例，采集外周血，提取全血基因组DNA，用MALDI-TOF MS技术检测患者华法林代谢酶基因的单核苷酸多态性（SNP）位点。成功建立MALDI-TOF MS技术检测华法林代谢酶基因多态性的平台，该法具有高通量、快速、准确的特点，在个性化医疗上有较大的推广应用价值。

Ye等[11]选取2013年10月~2014年6月在北京协和医院门诊就诊患者53例EDTA抗凝外周血，提取全血基因组DNA，用MALDI-TOF-MS技术检测53例患者药物代谢酶基因的单核苷酸多态性（SNP）位点。成功建立MALDI-TOFMS技术检测药物代谢酶基因多态性的平台，该平台具有高通量、准确的特点，对个性化用药治疗具有重要的临床应用价值。

Ye[15]团队纳入2018年7月至9月在北京协和医院诊断为高脂血症、高血压或动脉粥样硬化的患者共计71例。收集EDTA抗凝全血并提取基因组DNA，采用MALDI-TOF-MS检测不同位点。结果发现两种方法对相关基因位点的检测结果具有较高的一致性。MALDI-TOF-MS可应用于脂质及药物代谢相关基因SLCO1B1和ApoE多态性的检测，从而指导临床他汀类用药。

Zhou等[14]针对北京地区的心血管疾病患者采用飞行时间质谱测定所有患者的基因型开展了一项研究，探讨北京地区心血管疾病患者CYP2C19和ABCB1基因多态性与氯吡格雷抵抗（CR）的关系。携带CYP2C19*2或*3突变等位基因与血小板对氯吡格雷的反应减弱和CR风险增加显著相关。ABCB1突变等位基因的携带与CR风险没有显著相关性。该成果同时获得发明专利。

（2）传染性疾病检测：Wang等[13]应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）原理，在Clin-ToFⅡ飞行时间质谱系统上，建立PCR-核酸飞行时间质谱（PCR-TOF MS）系统检测SARS-CoV-2的方法，并评估其实际应用价值。该方法可作为实时荧光定量PCR法的补充和协同，在一定程度上有利于弥补假阴性的问题，从而降低临床漏诊率，提高检测效率，为疫情的研判缩短时间。

中国疾病预防控制中心病毒预防控制所评估了Bioyang团队开发的“8种呼吸道病原体多重检测试剂盒（微阵列芯片-飞行时间质谱法）”的检测有效性，认为该试剂盒对8种呼吸道病毒核酸的中/强阳性样品、临界阳性样品和阴性样品分别进行10次重复测试,检测结果一致且正确，重复性较好。试剂盒阳性、阴性参考品检测符合率均为100%，表明MS检测灵敏度提高。在冠状病毒大流行的时代，这种检测方法可以扩展到包括其他冠状病毒，如SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2和其他潜在的动物冠状病毒，并可用于常见呼吸道病毒感染的大规模流行病学研究。研究结果将为我们监测和控制呼吸道病毒感染提供有价值的工具。

（3）遗传病筛查：目前的研究表明，与中国人遗传性耳聋最为密切相关的耳聋基因为GJB2、SLC26A4、GJB3、线粒体12Sr RNA。本研究收集318份山东临沂和湖北宜昌的耳聋患者全血血样，通过应用多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）结合飞行时间质谱对样本GJB2、SLC26A4、GJB3、线粒体12Sr RNA四个基因20个常见突变位点进行检测。

Wang等[16]应用基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对先天性非综合征性耳聋患者进行耳聋基因筛查。团队采集2015年10月~2016年4月318份先天性非综合征性耳聋患者抗凝静脉全血，应用多重聚合酶链式反应（PCR）和MALDI-TOF MS的方法进行中国人常见的四个耳聋基因检测。该研究确定不同非综合征性耳聋人群相关基因突变谱，对于建立先天性耳聋患者理想的基因筛查方法意义十分重要。

（4）肿瘤相关检测：DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它在不改变碱基序列的情况下，调控遗传表现。DNA甲基化是指在甲基转移酶的催化下，DNA胞嘧啶的5号C上被选择性地添加了一个甲基或者羟甲基。CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，其中存在一些富含双核苷酸“CG”的区域，称为“CpG岛”（CpGisland，CGI）。这些CGI的大小通常在0.5-2kb范围内，位于基因启动子的1kb之内。

围绕核酸质谱检测平台，南京腾辰生物共布局了近10条产品管线，覆盖包括肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤。其中，肺癌早诊产品已经完成了4000余例临床验证（其中I期肺癌比例大于90%），对于2cm以下的极早期肺癌的灵敏度与特异性均＞80%。

（5）健康管理：叶酸缺乏是导致新生儿出生缺陷的原因之一。导致机体缺乏叶酸有两个方面的原因，一是叶酸摄入量不足；二是与叶酸代谢相关的基因发生异常。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）和甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）是参与叶酸代谢的最重要的两个酶，当编码这两个酶的基因发生突变时，会引起叶酸代谢异常。中国人中，高达17%-47%的人为叶酸代谢关键酶MTHFR（亚甲基四氢叶酸还原酶）基因异常人群。目前围孕期妇女补充叶酸的剂量一般为0.4mg/d。然而，对于那些由于叶酸代谢关键酶的编码基因突变造成叶酸代谢障碍的女性人群，在补充相同剂量叶酸的情况下，血清和红细胞叶酸的浓度较正常人低，机体血浆同型半胱氨酸浓度明显升高。

因此，通过检测MTHFR基因型，对于携带CT、TT基因型的妇女，可以通过增加叶酸的补充而维持正常的血清叶酸水平，从而降低血浆同型半胱氨酸浓度，降低疾病的发生。MTHFR基因型的检测，不仅可以指导孕妇服用叶酸，降低唐氏综合征、唇腭裂、神经管缺陷等新生儿缺陷，同时还可以提示脑卒中风险性。

三、结论

核酸质谱是一种功能强大的综合性技术平台，可进行基因的SNP、突变、甲基化及CNV分析。在临床检验领域，质谱技术用于耳聋基因检测、表皮生长因子受体（EGFR）突变检测、液体活检、高血压易感基因多态性检测等方面也具有广阔的应用前景。迄今为止临床上还鲜有其他检测平台可以兼顾多种组学层次的检验分析。它与质谱的蛋白质多肽检测功能相比，其基因检测的功能还基本未在临床应用中进行开发，独特的多重PCR技术，稳定准确的检测结果，经济的检测成本可满足临床越来越多对中等通量位点SNP及基因突变等定性和定量检测的需求，再加上方便快捷的DNA甲基化及CNV检测，更使得质谱在基因检测领域具有自己的特色和极大的竞争力。在临床检测领域，其基因检测的功能还未得到充分开发，但鉴于其灵敏度高、特异度高，检测成本低、高通量和高准确性等特点，在核酸检测方面具有广阔的应用前景。随着临床实验室对质谱的了解和应用不断的加深，未来该检测平台或可成为规范实验室不可或缺的标准装备。

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