挥发性有机物检测在肿瘤早期诊断中的应用前景
张义，医学博士、教授、博士研究生导师。现任山东大学齐鲁医院检验医学中心主任，生物标志物与人工智能应用山东省工程研究中心主任。现兼任中华医学会检验分会委员、中国医师协会检验分会委员、中国医学装备协会检验医学分会副会长、中国中西医结合学会检验分会常委、山东省免疫学会免疫技术及标准专业委员会主任委员、山东省医学会检验分会候任主任委员等。美国MD安德森癌症中心访问学者。主要研究方向为生物标志物的筛选、转化应用及机制研究。先后主持国家自然科学基金项目和省部级重点研究课题16项，以第一/通讯作者发表相关研究论文50余篇，其中SCI收录30余篇；获教育部及山东省科技进步奖5项，国家发明专利7项，软件著作权2项。
张欣，医学博士、副主任技师、硕士生导师。现任山东大学齐鲁医院检验医学中心主任助理，齐鲁卫生与健康杰青人才。现兼任中国医师协会检验医师分会青年委员、中华医学会检验医学分会青年教师科研创新联盟委员、山东省研究型医院协会肿瘤液体活检专业委员会副主任委员等。主要从事新型生物标志物发现与体外诊断研究，近年主持国家自然科学基金2项、山东省重点研发计划等省部级课题5项，以第一/通讯作者在“Clinical Cancer Research”等国内外杂志发表论文20余篇，其中SCI收录21篇，授权国家发明专利8项，参与获山东省科技进步一等奖1项，山东省医学科技一等奖1项。
挥发性有机物（volatile organic compounds，VOCs）是指室温下即以蒸汽形式存在的一类有机化合物。人体内VOCs来源于多种内源性生化过程，包括能量代谢、氧化应激等。作为细胞代谢的最终产物，VOCs浓度或是组分的异常改变可反映机体因炎症、感染、肿瘤而引起的代谢变化。因此，VOCs有望成为诊断某些疾病的新型生物标志物。近年来，VOCs作为一类肿瘤标志物在肿瘤诊断中的作用受到越来越多的关注。本文将对VOCs在肿瘤诊断中的研究进展作一简要概述。
一、VOCs概述
根据WHO定义，VOCs即在常压下沸点50℃至260℃，室温下饱和蒸气压大于70Pa的易挥发性有机化合物，按其结构不同可分为：烷类、烯类、酯类、醛类、酮类、芳烃类、卤烃类和其他共八类。VOCs来源广泛且复杂，人体内VOCs可根据其来源分为外源性和内源性VOCs，外源性VOCs来源于外界环境并通过肺脏排出体外，不参与人体内部代谢过程。内源性VOCs主要为多种代谢途径的产物，经由血液到达肺泡细胞、肾上皮细胞、肠上皮细胞等，并通过皮肤、尿液、粪便和呼出气排出体外，可直接反应人体的代谢变化。
1. VOCs常用检测平台：一般常用检测平台有电子鼻技术（electronic-nose technology，eNose）、气相色谱-质谱法（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、选择离子流动质谱法（selected Ion flow tube mass spectrometry，SIFT-MS）、气相色谱离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）等。
（1）电子鼻技术（electronic-nose technology，eNose）：McCulloch通过训练犬类鉴别他们主人的健康状态，首次证明了VOCs能够用于鉴别癌症患者和非癌患者。然而犬类仅可通过其敏锐的嗅觉鉴别癌症患者和非癌症患者之间的差异VOCs所导致的不同味道，但无法检测其中组分和浓度的变化[1]。基于这一结论，电子鼻技术被应用于VOCs检测。eNose是一种基于交叉反应传感器的代谢组学技术，通过特定材料制成的传感器与不同VOCs进行反应，形成“VOCs气味印记”以实现对不同疾病的识别, 其操作简易，检测快速且成本低廉[2]。然而，eNose仅能识别不同VOCs的组合，不能对单一的VOCs组分进行分析，并且容易受到外界环境因素的干扰。
（2）气相色谱-质谱法（Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）：GC-MS是目前最常用的VOCs检测平台，其被广泛应用于VOCs组分的分离与鉴定。GC-MS技术主要包含三个步骤：样品收集、样品预浓缩和样品分析。其中，样品的预浓缩是VOCs分析的关键步骤，通过使用吸附材料提高生物样本中VOCs组分的含量以实现分析前样本富集。随后，GC-MS对样品VOCs组分进行分离以及定性和定量分析。目前，GC-MS已被证明可以检测来自不同生物样品如呼出气、尿液、血清等的VOCs，进而能够鉴别出疾病组和对照组[3, 4]。然而，通过此方法找出的差异VOCs在同种疾病的不同研究中并非完全相同，这可能是由样本处理及分析过程缺乏标准化导致的。因此，这也提示不同研究得出的共性VOCs或许有着更好的临床意义。
（3）选择离子流动质谱法（selected Ion flow tube mass spectrometry，SIFT-MS）：SIFT-MS是一种定量选择质谱技术，其原理是将质谱法与选择离子流管耦合，利用带正电荷的前体离子的化学电离，与样品中的VOCs反应生成产物离子，最后通过扫描特定质荷比值范围从而完成实时数据分析，同时根据前体和产物离子信号比率实时计算挥发性化合物的浓度[5]。相较于GC-MS，SIFT-MS允许实时测量，仪器维护成本较低，并且不需要专业人员操作[6]。但其分离的VOCs较少，所得到的VOCs组分信息也相应减少。
（4）气相色谱离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS）：GC-IMS是气相色谱和离子迁移谱的联用技术，它结合了气相色谱对复杂组分的强大分离能力及离子迁移谱的超高灵敏度，无需进行样本预富集浓缩即可检测。GC-IMS通过待测分子气相色谱保留指数和分子离子的迁移时间对物质进行定性，根据信号峰强度进行定量，最终得出一个三维数据（保留指数、迁移时间、峰强度）。相较于传统的GC-MS检测技术，GC-IMS无需进行样本的预处理，大大缩短了样本分析时长，显著提升了检测效率。
2. 不同生物标本中VOCs的检测分析：VOCs作为机体代谢物的一部分，可以在多种生物样本中检测到，例如呼出气、血清、尿液等[3, 4]。呼出气VOCs最早被用于肺癌患者的诊断及筛查，因其具有良好的灵敏度与特异性以及样本简单易得的优点在肺癌筛查中显示出巨大潜力[7, 8]。但非侵入性呼出气的VOCs检测在临床应用中仍存在一些困难，如缺少统一标准的呼出气的采集保存方法、有效的诊断肺癌的VOCs表达图谱以及挥发性有机物的界限值不明确等。近年来，VOCs检测在其他肿瘤的诊断中的应用也得到广泛关注。多项研究结果显示，结直肠癌患者和健康对照人群的生物标本中（呼出气、尿液）可检测出具有显著差异的VOCs，其有望成为早期诊断结直肠癌的生物标志物[9]。
二、VOCs在不同癌症中的研究应用
1. VOCs在呼吸系统恶性肿瘤早期诊断中的应用：VOCs在肺癌早期诊断中的研究多集中于患者呼出气VOCs的检测[10]，其检测平台大多基于GC-MS。Sakumura等[11]分析检测了肺癌患者68种VOCs，随后使用支持向量机（SVM）算法对样本进行分类，观察到5种挥发性有机化合物的组合应用（CHN，甲醇，乙腈，异戊二烯，1-丙醇）在肺癌筛查方面准确率达到89.0%。Schumer团队[12]分析了156名肺癌患者、65名良性肺部疾病患者以及194名健康对照中的呼气样本，检测到2-丁酮、3-羟基-2-丁酮、2-羟基乙醛和4-羟基-2-己烯的浓度在肺癌患者中显著升高，在区分肺癌患者和良性对照方面显示出很高的鉴别能力。此外，新型的研究平台及改良的传统研究平台也逐渐应用于VOCs检测。Larracy团队[13]应用光腔衰荡光谱（CRDS），一种基于激光吸收谱（LAS）方法对62例非小细胞肺癌患者和96例健康对照者呼出气VOCs进行检测，分别采用非嵌套模型和嵌套模型进行诊断能力的评估，其准确性和灵敏度分别为66.13%、97.92%和51.61%、73.96%。而这两种分析方法所对应的呼吸打印技术的灵敏度和特异性可分别达到82.26%、88.54%和58.06%、80.21%。该研究虽然使用了不同于传统的VOCs检测的新方法，但CRDS的表现力与GC-MS大致相同，并且基于CRDS分析后所建模型的呼吸打印技术可用于VOCs的补充研究。Binso等[14]使用改良的传统VOCs检测分析仪器，即带有五个传感器的电子鼻，在55名慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者和51名肺癌患者呼出气中进行了VOCs检测，采用XGBoost算法构建的模型在诊断肺癌和COPD均显示出高灵敏度和特异性。这些研究证明了呼出气VOCs检测对呼吸系统恶性肿瘤早期筛查的重要意义，这一非侵入性的检查方法有望应用于临床。
2. VOCs在泌尿系统恶性肿瘤早期诊断中的应用：尿液中VOCs浓度高、样本易得、方便收集，同时能够反应机体尤其是泌尿系统等方面的代谢异常，在前列腺癌和膀胱癌的筛查中具有良好的应用前景[15]。在尿液样本VOCs检测分析中，GC-MS仍是最常的研究平台。Lima团队[16]使用传统GC-MS鉴定出前列腺癌尿液中的6种特异性VOCs（己醛、2,5-二甲基苯甲醛、4-甲基己烷-3-1、二氢二醇、甲基乙二醛和3-苯基丙醛），基于这6种物质建立的诊断模型预测前列腺癌的AUC可达0.904，敏感度和特异度分别为89%和83%。Tyagi等[17]分别应用GC-MS和GC-TOF-MS两种平台对前列腺癌、膀胱癌和非癌患者的尿液进行VOCs检测。其中，对于两种癌症的鉴别以及膀胱癌与非癌症的鉴别GC-MS的表现均优于GC-TOF-MS，而在鉴别前列腺癌与非癌症方面，GC-TOF-MS的表现更优。此外，电子鼻技术也被应用于前列腺癌患者尿液的VOCs检测并表现出良好的诊断能力[18]。尽管前列腺和膀胱并不直接参与尿液形成的生物过程，但是前列腺合成的物质可以分泌到尿液中，而膀胱作为尿液储存器官更是直接与尿液接触，因此，相较于呼出气、血清等样本，尿液VOCs更能反映前列腺癌与膀胱癌中的代谢紊乱，在泌尿系统恶性肿瘤早期筛查和诊断中发挥重要作用。
3. VOCs在消化系统恶性肿瘤早期诊断中的应用：胆汁由肝脏细胞分泌产生，参与脂肪的消化与吸收，其成分的改变往往预示肝胆等消化系统疾病的发生。多项研究发现，相较于健康人群，胆囊癌患者胆汁中的酮类和醛类物质变化最为显著，并且这两类物质在患者尿液中也存在明显差异，不仅能够区分癌症组和非癌症的健康对照组，同时也可将癌症同良性疾病区分开来[19, 20]。这种差异可能与多种代谢途径的异常改变有关，如碳水化合物代谢、脂肪酸的β-氧化、细胞膜合成增强和一些重要酶活性的改变[21]。Navaneethan等[22]使用胆汁作为样本，发现了其中6种VOCs（乙醛、丙酮、苯、二硫化碳、戊烷和三甲胺）可以帮助准确区分胰腺癌和慢性胰腺炎。Teränen等[23]进行了一项前瞻性观察性研究，通过高场不对称波形离子迁移谱（FAIMS）检测胆汁中的VOCs，在胰腺癌患者与良性胰腺病变的比较中显示出100%的敏感性及77.8%的特异性。如上所述，胆汁VOCs在区分消化系统肿瘤患者与健康人群方面显示出良好的性能，能够提示肿瘤系统的代谢异常，但其背后的机制仍不明确。
三、结语与展望
肿瘤的早期筛查和诊断对降低患者死亡率、提高五年生存率意义重大。多项研究已经证明，VOCs在不同肿瘤的诊断和鉴别诊断方面具有一定的优秀表现。通过对不同生物样本中VOCs的检测分析，可以实现肿瘤的“早筛早诊早治”。
然而，目前VOCs的检测分析仍然缺乏可供参考的方法，样本的采集和保存尚未统一标准，不同检测平台对于同一样本的检测结果也存在差异。因此，VOCs于临床上的应用，仍需更进一步的探索，如标准的样本采集、处理、贮存条件，质控标准品的确定等。此外，人体内VOCs的产生机制以及其异常代谢的发生机理也有待阐明。相信随着研究的进一步深入及代谢组学技术的不断发展，VOCs有望成为一类新型生物标志物，在肿瘤诊疗中发挥重要价值。
参考文献
McCulloch M, Jezierski T, Broffman M, et al. Diagnostic accuracy of canine scent detection in early- and late-stage lung and breast cancers[J]. Integrative Cancer Therapies, 2006, 5(1): 30-39.
de Vries R, Sterk P J. eNose breathprints as composite biomarker for real-time phenotyping of complex respiratory diseases[J]. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2020, 146(5): 995-996.
Alexandridou A, Mouskeftara T, Raikos N, et al. GC-MS analysis of underivatised new psychoactive substances in whole blood and urine[J]. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2020, 1156: 122308.
Wang X R, Cassells J, Berna A Z. Stability control for breath analysis using GC-MS[J]. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2018, 1097-1098: 27-34.
Moorhead K T, Lee D, Chase J G, et al. Classifying algorithms for SIFT-MS technology and medical diagnosis[J]. Computer Methods and Programs in Biomedicine, 2008, 89(3): 226-238.
Bosch S, Berkhout D J, Ben Larbi I, et al. Fecal volatile organic compounds for early detection of colorectal cancer: where are we now?[J]. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, 2019, 145(1): 223-234.
Phillips M, Bauer T L, Pass H I. A volatile biomarker in breath predicts lung cancer and pulmonary nodules[J]. Journal of Breath Research, 2019, 13(3): 036013.
Sani S N, Zhou W, Ismail B B, et al. LC-MS/MS based Volatile Organic Compound Biomarkers Analysis for Early Detection of Lung Cancer[J]. Cancers, 2023, 15(4): 1186.
van Keulen K E, Jansen M E, Schrauwen R W M, et al. Volatile organic compounds in breath can serve as a non-invasive diagnostic biomarker for the detection of advanced adenomas and colorectal cancer[J]. Alimentary Pharmacology & Therapeutics, 2020, 51(3): 334-346.
Hanna G B, Boshier P R, Markar S R, et al. Accuracy and Methodologic Challenges of Volatile Organic Compound-based Exhaled Breath Tests for Cancer Diagnosis: A Systematic Review and meta-analysis[J]. JAMA oncology, 2019, 5(1): e182815.
Sakumura Y, Koyama Y, Tokutake H, et al. Diagnosis by Volatile Organic Compounds in Exhaled Breath from Lung Cancer Patients Using Support Vector Machine Algorithm[J]. Sensors (basel, Switzerland), 2017, 17(2): 287.
Schumer E M, Trivedi J R, van Berkel V, et al. High sensitivity for lung cancer detection using analysis of exhaled carbonyl compounds[J]. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 2015, 150(6): 1517-1522; discussion 1522-1524.
Larracy R, Phinyomark A, Scheme E. Infrared cavity ring-down spectroscopy for detecting non-small cell lung cancer in exhaled breath[J]. Journal of Breath Research, 2022, 16(2).
V A B, Subramoniam M, Mathew L. Detection of COPD and Lung Cancer with electronic nose using ensemble learning methods[J]. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry, 2021, 523: 231-238.
Lett L, George M, Slater R, et al. Investigation of urinary volatile organic compounds as novel diagnostic and surveillance biomarkers of bladder cancer[J]. British Journal of Cancer, 2022, 127(2): 329-336.
Lima A R, Pinto J, Azevedo A I, et al. Identification of a biomarker panel for improvement of prostate cancer diagnosis by volatile metabolic profiling of urine[J]. British Journal of Cancer, 2019, 121(10): 857-868.
Tyagi H, Daulton E, Bannaga A S, et al. Urinary Volatiles and Chemical Characterisation for the Non-Invasive Detection of Prostate and Bladder Cancers[J]. Biosensors, 2021, 11(11): 437.
Capelli L, Taverna G, Bellini A, et al. Application and Uses of Electronic Noses for Clinical Diagnosis on Urine Samples: A Review[J]. Sensors (basel, Switzerland), 2016, 16(10): 1708.
Navaneethan U, Parsi M A, Lourdusamy D, et al. Volatile Organic Compounds in Urine for Noninvasive Diagnosis of Malignant Biliary Strictures: A Pilot Study[J]. Digestive Diseases and Sciences, 2015, 60(7): 2150-2157.
Daulton E, Wicaksono A N, Tiele A, et al. Volatile organic compounds (VOCs) for the non-invasive detection of pancreatic cancer from urine[J]. Talanta, 2021, 221: 121604.
Haick H, Broza Y Y, Mochalski P, et al. Assessment, origin, and implementation of breath volatile cancer markers[J]. Chemical Society Reviews, 2014, 43(5): 1423-1449.
Navaneethan U, Spencer C, Zhu X, et al. Volatile organic compounds in bile can distinguish pancreatic cancer from chronic pancreatitis: a prospective observational study[J]. Endoscopy, 2021, 53(7): 732-736.
Teränen V, Nissinen S, Roine A, et al. Bile-volatile organic compounds in the diagnostics of pancreatic cancer and biliary obstruction: A prospective proof-of-concept study[J]. Frontiers in Oncology, 2022, 12: 918539.
