神经母细胞瘤相关肿瘤标志物检测与临床早期诊断价值
马鸣，主任技师、医学博士、硕士研究生导师。现任河北医科大学第四医院检验科副主任。主要从事临床血液学检验临床与基础研究。以第一主研人完成国家自然科学基金课题一项；河北省自然科学基金课题一项。荣获河北省科技进步一等奖一项，河北省医学科技一等奖两项。以第一作者或通讯作者发表SCI及国家级核心期刊论文20余篇。学术兼职：中国生物医学工程学会医学检验工程分会青年委员，河北省生物医学工程学会医学检验工程专业委员会副主任委员，河北省医学会检验医学分会青年学组副组长，河北省医师协会检验科医师分会青年学组副组长，河北医科大学青年科协委员，河北省免疫学会流式细胞术专业技术委员会委员，河北省抗癌联合会肿瘤免疫治疗专业委员会委员，河北省三三三人才工程第三层次人选。
陈端阳，检验技师。本科毕业，现任职于河北医科大学第四医院检验科。
神经母细胞瘤（Neuroblastoma，NB）是儿童最常见的颅外实体恶性肿瘤之一，其起源于交感神经，主要由未分化的神经母细胞构成，婴幼儿发病率最高[1]。NB临床表现较为复杂，肿瘤边界较为清楚，质地较硬，常有出血、坏死或囊性病变，可发生在不同部位，主要发生在胸部、颈部及腹部，部位不同临床表现也各有所异。
NB最终确诊主要依靠于术后组织病理检查，影像学检查CT、MRI等在确诊过程中，也发挥了重要的作用。目前其主要的治疗方法是手术切除、放疗、化疗以及骨髓移植等[2, 3]，治疗策略不同，患者预后也有不同。对于低危组NB患者（最常见于婴幼儿），单纯手术治疗往往可以取得较好的效果[4]；但高危组NB患者，即使综合各种强化的治疗方案，预后仍然不理想[5]。实验室检查对于该疾病的早期诊断、预后判断及评估有重要意义[6]，随着现代医学不断发展，NB相关肿瘤标志物不断涌现，基于此，本文总结了一些对NB临床诊断及疗效监测具有重要意义的肿瘤标志物，作一概述。
一、神经母细胞瘤血清标志物
1. 神经元特异性烯醇化酶（Neuron-specific nolase，NSE）：NSE是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶，由神经母细胞合成，是NB临床确诊的重要指标之一。NSE参与糖酵解途径，存在于神经组织和神经内分泌组织中。NSE在脑组织细胞的活性最高，外周神经和神经分泌组织的活性水平居中，非神经组织、血清和脊髓液中也有一定含量。NSE主要表达于与神经内分泌组织起源有关的肿瘤中，特别是NB和小细胞肺癌（Small Cell Lung Carcinoma，SCLC）中均有过量的NSE表达[7]，导致血清中NSE明显升高。神经元特异性烯醇化酶（NSE）是一种在临床上很有应用价值的分子学标记物。NSE可以作为肺癌和儿童NB鉴别诊断的肿瘤标记物[8, 9]；其血清含量检测可用于评估小细胞肺癌和NB的病情[10]、治疗反应和预后[11]。其血清高水平往往提示预后较差，且与诊断时肿瘤的最大直径呈线性相关，可间接反映患者体内肿瘤细胞的代谢活跃度[12]。但因其受标本溶血影响较大，即使轻度溶血血清中NSE水平都会明显升高，因此影响了其特异性。
2. 乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）：LDH是生物中催化苯丙酮酸生成苯乳酸的一类关键酶。其在生物体内糖酵解途径中发挥重要的氧化还原作用，能可逆地催化乳酸氧化为丙酮酸，为无氧糖酵解的最终产物。LDH作为全身肿瘤细胞负荷的一项指标，广泛分布于肝、肾、心肌，骨骼肌、肺等多种组织、器官中，当这些组织发生病变时血清乳酸脱氢酶水平升高。有文献报道，血清LDH＞800U／L为NB不良预后的独立危险因素，检测血清LDH水平对估计NB预后而进行指导治疗具有重要意义[13]。血清乳酸脱氢酶可反映NB的疾病进程，与肿瘤的体积呈正相关，即肿瘤负荷越大，肿瘤分泌的LDH活性越高，因此LDH可用于NB的临床进展评估和疗效预测。但多种肿瘤细胞均高表达LDH，故其临床特异性较差。
3. 糖类抗原125（Carbohydrate antigen 125，CA-125）：CA-125是一种来自体腔上皮的可微量存在于正常组织且相对分子质量大于200KD的糖蛋白表面抗原，在胚胎发育过程中由体腔上皮细胞表达，出生后消失，在正常卵巢组织中仅痕量表达而难以检测到，但在卵巢癌细胞中又会重新出现，其诊断的敏感性较高。粘液性卵巢肿瘤中不存在。是卵巢癌和子宫内膜癌的首选肿瘤标志物，广泛用于卵巢癌的早期诊断、疗效观察、预后判断、监测复发及转移的最重要的指标。
此外，肺癌患者血清中CA-125水平也明显升高，不同病理类型肺癌患者血清CA-125水平表达各异，血清CA-125的检测有助于不同病理类型肺癌患者的诊断和化疗近期疗效的评估[14]。近年来，有研究证明了NB患儿的血清CA-125水平可明显增高，且IV期患儿血清CA-125水平明显高于I-III期，有效治疗后的患儿血清CA-125水平明显低于治疗无效组[15]，因此，CA-125在NB临床诊断和疗效监测中可能具有一定意义，其具有成为NB血清肿瘤标记物的潜力。
二、神经母细胞瘤组织分子标志物
1. MYCN癌基因：MYCN基因在正常人体以单倍体状态位于2号染色体短臂远端（2p23～24），由被2个内显子分隔开的3个外显子组成。MYCN是MYC家族成员，参与多种生理和病理过程，包括细胞生长和凋亡、新生血管形成和肿瘤浸润与转移等，MYCN在肿瘤的发生发展过程中所起的作用正日益受到重视。MYCN扩增是NB最重要的基因组特征[16]，是高危NB中公认的驱动基因[17]。
恶性实体瘤在儿童中发病率不高，却是儿童主要死亡原因。MYCN基因扩增是NB的独立的不良预后因素[18]，参与NB肿瘤形成，是分层治疗的重要依据。同时MYCN基因扩增在其他儿童恶性实体瘤中亦可检测到，并与NB的不良病理表现、肾母细胞瘤和肺泡型横纹肌肉瘤的不良预后有关，此外，预后不良的淋巴瘤组织也往往呈现MYCN扩增或失调现象[19]。
MYCN癌基因定位于染色体2p24，约30%的NB中可发现MYCN扩增或MYC蛋白的表达，MYCN基因扩增与不良预后有关，其表达特征可以作为高危NB的生物标志物。
2. 非编码RNA（Non-coding RNA）：人类基因组的30亿个碱基对中，有98.5%的核苷酸序列为非蛋白质编码序列，因此非编码RNA在很长一段时间内被认为是生物学“噪音”。近年来，随着生物信息学的蓬勃发展，基因芯片、二代测序及各种分子生物学实验技术的应用、大量具有生物学功能的非编码RNA被发现，具有代表性的为微RNA（microRNA，miRNA）和长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）[20]。
miRNA广泛存在于真核生物体内、其通过参与肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭及转移等过程而调控NB的进程[21]，血中循环miRNA对NB的诊断具有重要提示作用。miR-483-3P通过下调其靶基因RI0激酶3表达，促进NB的增殖、侵袭和迁移，从而发挥促癌基因的作用[22]。过表达miR-497可诱导MYCN扩增细胞系凋亡，抑制肿瘤细胞生长，降低血管通透性。miR-497可以靶向与细胞周期、生存和血管生成相关的多个基因，成为NB诊疗的一个候选分子。miR-124在NB中低表达，与NB细胞的分化有密切关系[23]。let-7基因缺失在NB中很常见，与MYCN扩增负相关，可作为不良预后的独立预测因子。
长链非编码RNA的长度超过200个核苷酸，其可通过基因表达的调控及表观遗传学等调控影响肿瘤的发生发展[24]。有研究表明，长链非编RNA SNHG7在NB细胞中高表达，它可以作为miR-653-5p的海绵与miR-653-5p结合，调节其下游靶基因信号转导及转录激活因子2的表达，进而促进NB细胞增殖、侵袭转移及上皮间充质转化[25]。有学者研究发现，MYCN扩增和非扩增的NB细胞系中GAS5的表达水平均较高。体外抑制GAS5可导致细胞增殖缺陷、凋亡和细胞周期阻滞。他们进一步分析CAS5克隆发现多个剪接变异，证明CAS5以长链非编码RNA剪接变异体的形式对NB细胞增殖和凋亡进行调控，从而为NB的诊疗提供新靶点[26]。
3. 转录共激活因子（Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ）：分子靶向治疗是近年肿瘤领域研究的热点，因此寻找与NB疾病发生、侵袭和转移相关的肿瘤标志物对于NB的诊断及治疗有十分重要的意义。据报道，TAZ在多种人类癌症中表达异常，如乳腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、横纹肌肉瘤及肝细胞癌等多种恶性肿瘤中高表达并与临床预后相关[27-29]。TAZ参与调控肿瘤细胞增殖、分化、凋亡以及影响肿瘤侵袭和转移过程，还参与上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及多能性，且与淋巴结转移、肿瘤复发及远期的总生存率密切相关[30-32]。有研究表明，在乳腺肿瘤中TAZ的过度表达可促进细胞G0/G1期转变，有利于细胞有丝分裂进程，相反，抑制TAZ的表达，则可阻滞细胞分裂进程，促进细胞凋亡[28, 33]。有学者发现在NB中的TAZ基因敲除可诱导G1期细胞周期阻滞，以及细胞周期蛋白E2（cyclin E2）下调，这表明TAZ是维持NB细胞增殖和肿瘤发生所必需的，TAZ可能是NB的潜在治疗靶点之一[34]。有文章指出发现在NB中TAZ通过调节激活TGF-β／Smad3信号通路来诱导结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor，CTGF）的表达并参与EMT过程。在NB中TAZ呈阳性表达，并通过上调CTGF和血小板衍生生长因子-β（Platelet-derived growth factor，PDGF-β）的表达促进细胞增殖和肿瘤形成。通过沉默TAZ基因表达可降低NB细胞的增殖和肿瘤形成，并预测TAZ的表达可作为NB患者的预后指标和潜在的治疗靶点[35]。这些特性提示TAZ蛋白的过表达和肿瘤的不良预后密切相关。
4. 受体原肌球蛋白受体激酶（Tropomyosin receptor kinase，Trk）：TrK属于神经营养受体家族，在NB生物活性中发挥至关重要的作用。TrkB表达水平升高与NB临床高风险和低生存率相关，而TrkA表达升高与NB低风险和肿瘤缓解密切相关。事实上，MYCN扩增的NB晚期患者往往TrkA表达降低。TrkB的异常表达可促进NB对依托泊苷、阿霉素和顺铂的耐药，并增加肿瘤组织血管生成和瘤细胞转移。因此，TrkB是NB治疗的重要靶点之一[36]。在临床前模型中，Trk抑制剂GNF-4256和AZD6918可以减缓异种移植物肿瘤的生长，并且Trk抑制剂与化疗药物联合治疗的效果明显优于单独化疗药。AZ64是一种神经营养原肌球蛋白受体激酶（NTRK）抑制剂，在NB动物移植模型中具有显著抑制TrkB的作用，同时，其可增强局部放疗和化疗的疗效。这提示，Trk抑制可能是现有化疗的有效辅助手段。此外，CEP-751对表达高水平TrkB的NB细胞和移植瘤组织具有有效的抗肿瘤活性。Enterrectinib是TrkA/B/C的另一种抑制剂，已被发现可有效抑制NB肿瘤的生长，同时也可增强替莫唑胺的肿瘤生长抑制作用[36]。
5. 杆状病毒IAP重复包含5（Baculoviral IAP repeat containing 5，BIRC5）：BIRC5基因位于17号染色体长臂上（q25），编码产物为survivin蛋白。晚期NB通常表现为染色体17q25区域的增加，并且在49%的NB肿瘤中获得BIRC5基因（存在于该17q25区域）。survivin蛋白表达升高与NB患者预后不良密切相关。事实上，在年龄大于1岁的III期和IV期患者中，survivin mRNA的水平更高，并且与TrkA的表达水平呈显著负相关。NB中survivin表达水平升高也与MYCN扩增相关。Survivin还会增加NB患者的糖酵解过程和化疗耐药性。此外，survivin还可通过抑制caspase 9增强NB细胞对Staurosporine诱导的凋亡的抵抗，发挥抗凋亡作用。survivin也被发现能够抵抗免疫或药物介导的细胞死亡。例如，一项对几种NB细胞系的研究发现，survivin表达最低的NB细胞系NB10对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）和依托泊苷诱导的细胞死亡最敏感。相反，具有丰富存活素的NB7和NB16细胞系对TRAIL和依托泊苷诱导的细胞死亡具有更强的抵抗力。Survivin也被发现引起染色体乘客复合体（chromosomal passenger complex，CPC）微管的稳定[36, 37]。
在NB的临床前研究中发现了多种靶向survivin的抑制剂。例如，YM155可降低NB SH-SY5Y细胞的survivin表达，抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。同样的研究也表明，YM155治疗后survivin的表达降低可以有效地使SH-SY5Y细胞对顺铂（化疗药物）敏感，并在SH-SY5Y异种移植模型中诱导肿瘤消退和凋亡。Kunnimalaiyaan等人的研究表明，LY2090314（GSK-3抑制剂）能够抑制NB细胞的生长，诱导细胞凋亡，并降低survivin水平。研究还发现，Withanolides对NB细胞具有细胞毒性，这可能是因为它们下调NB细胞中的survivin。Noscapine是一种无毒的天然化合物，在p53野生型和无NB细胞中通过下调survivin诱导细胞凋亡。此外，抗糖尿病药物曲格列酮也具有通过下调survivin，促进NB细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性[36-38]。
三、展望
NB易复发、易转移等特点使其成为主要的致死原因。由于NB的发病机制及病情进展个体差异较大，因此需对多学科多种诊断评价系统不断进行完善以准确评估患儿疾病情况并制订合适的治疗方案。而实验室检查对这一常见疾病的早期诊断、预后判断及评估有重要意义。肿瘤标志物检测具有广泛的指导意义，联合多项共同检测更能加强特异性。另外随着细胞生物学及分子生物学的迅猛发展，染色体的改变和一些具有潜在诊断价值的分子逐渐被发现，它们在NB预后判断和评估等方面有重要意义。许多肿瘤相关分子及信号通路的调控模式不断被发现，这些基因分子预测指标将成为NB诊断研究的新热点并为未来基因的靶向治疗提供重要依据。
参考文献
Lin KS, Uemura S, Thwin KK, et al. Minimal residual disease in high-risk neuroblastoma shows a dynamic and disease burden-dependent correlation between bone marrow and peripheral blood[J]. Translational Oncology, 2021, 14(8): 101019.
张渝华,石浩,赵维彬. CT应用于诊断小儿神经母细胞瘤价值观察[J].当代医学, 2019, 25(23): 151-153.
张秀芸,宋玉霞. CT应用于小儿神经母细胞瘤诊断及随访中的价值分析[J]. 中国卫生标准管理, 2018, 9(21): 106-108.
许新科,李方成.关于儿童脑肿瘤手术治疗的认识与思考[J].临床小儿外科杂志, 2021, 20(05): 405-408.
张飞, 侯广军, 冯全得, 等. 小儿神经母细胞瘤手术切除比例对预后的影响[J]. 临床医学, 2021, 41(04): 68-70.
张培培, 杨毅, 侯丽英, 等. 儿童神经母细胞瘤实验诊断学的研究进展[J]. 医学综述, 2020, 26(06): 1126-1130+1136.
周光廷, 张波克. CYFRA211.NSE.TK1及SCC对早期肺癌的诊断价值[J]. 医学综述, 2021, (10): 2045-2049.
Lee H, Park SD, Kim T, et al. Algorithm using Neuron-Specific Enolase and Pro-Gastrin-Releasing Peptide to Increase the Diagnostic Accuracy for Small Cell Lung Cancer[J]. Annals of laboratory medicine, 2021, 41(3): 339-341.
Xia XF, Li KJ, Wu RQ, et al. Predictive Value of Neuron Specific Enolase, Neutrophil-to-Lymphocyte-Ratio and Lymph Node metastasis for Distant metastasis in Small Cell Lung Cancer[J]. The clinical respiratory journal, 2020, 14(11): 1060-1066.
Xu FZ, Zhang YB. Correlation analysis between serum neuron-specific enolase and the detection of gene mutations in lung adenocarcinoma[J]. Journal of thoracic disease, 2021, 13(2): 552-561.
Tian Z, Liang C, Zhang Z, et al. Prognostic value of neuron-specific enolase for small cell lung cancer: a systematic review and meta-analysis[J]. World J Surg Oncol, 2020, 30; 18(1): 116.
吕俊, 席红卫, 石正峰, 等. 特异性肿瘤标记物检测对小儿神经母细胞瘤治疗的意义[J]. 实用医技杂志, 2019, 26(12): 1519-1521.
张文静, 孙岩峰, 刘秋玲, 等. 20例神经母细胞瘤患儿肌酸激酶同工酶及乳酸脱氢酶结果分析[J]. 中国急救复苏与灾害医学杂志, 2017, 12(6): 592-594.
王妮娜, 李晓花, 陈敏丽, 等. 肺癌患者血清NSE, SCC, CA125及CYFRA21-1水平检测在不同病理类型早期诊断和化疗疗效评价中的应用价值[J]. 现代检验医学杂志, 2021, 36(1): 33-37.
王宝平, 张泓, 余绍兵, 等. 血清CA125.NSE及24h尿VMA检测在小儿神经母细胞瘤诊治中的应用价值[J]. 癌症进展, 2019, 17(07): 837-839+868.
Lee EJ, Lee JW, Lee B,et al. Genomic profile of MYCN non-amplified neuroblastoma and potential for immunotherapeutic strategies in neuroblastoma[J]. BMC Medical Genomics, 2020, 13(1): 171.
Li ZH, Lim SL,Tao YF, et al. PROTAC Bromodomain Inhibitor ARV-825 Displays Anti-Tumor Activity in Neuroblastoma by Repressing expression of MYCN or c-Myc[J]. Frontiers in Oncology, 2020, 10: 574525.
Otte J, Cecilia D, Adena P, et al. MYCN Function in Neuroblastoma Development [J]. Frontiers in Oncology, 2021, 10: 624079.
Raieli S, Di RD, Lampis S, et al Roberto. MYCN Drives a Tumor Immunosuppressive Environment Which Impacts Survival in Neuroblastoma[J]. Frontiers in oncology, 2021, 11: 625207.
Kopp F, Mendell JT.Functional class ii cation and experiment adissection of long noneoding RNAs[J]. Cell, 2018, 172(3): 393-407.
Hayes J, Peruzzi PP, Lawler S. Lawler MicroRNAs in cancer: Biomarkers, functions and therapy[J] Trends Mol Med, 2014, 20(8): 460-469
李晓, 鹿洪亭, 董倩, 等MiR-483-3P下调RIO K 3蛋白表达促进神经母细胞瘤的增殖和迁移[J]临床小儿外科杂志,2016,15(2)：150-155.
Sharif S, Ghahremani MH, Soleimani M. Induction of morphological and functional differentiation of human neuroblastoma cells by miR-124[J]. J Biosci, 2017, 42(4): 555-563
史明睿. 长链非编码RNA在神经母细胞瘤中的研究进展[J]临床与病理杂志, 2018, 38(5): 1077-1081
Chi R, Chen X, Liu M, et al. Role of SNHG7-miR-653-5p-STAT2 feedback loop in regulating neuroblastoma progression[J] J Cell Physiol, 2019, 234(8): 13403-13412.
Mazar J, Rosado A, Shelley J, et al. The long non-coding RNA GAS5 differentially regulates cell cycle arrest and apoptosis through activation of BRCA1 and p53 in human neuroblastoma [J]. Oncotarget, 2016, 8(4): 6589-6607
Feng JT, Ren PW, Gou JH, et al. Prognostic significance of TAZexpression in various cancers: a meta-analysis [J]. onco Targets Ther, 2016, 9: 5235-5244．
Thompson BJ. YAP/TAZ: Drivers of tumor growth,metastasis,and resistance to therapy [J]. Bioessays, 2020, 42: e1900162．
Reggiani F, Gobbi G, Ciarrocchi A. Multiple roles and context-specific mechanisms underlying YAP and TAZ-mediated resistance to anti-cancer therapy. Biochim Biophys Acta Rev Cancer, 2020, 1873: 188341．
Aishwarya K, Matthew TC, Joseph HA, et al. The Hippo pathway as a driver of select human cancers. Trends Cancer, 2020, 6: 781-796．
Denson KE, Mussell AL, Shen H, et al. The hippo signaling transducer TAZ regulates mammary gland morphogenesis and carcinogen induced mammary tumorigenesis. Sci Rep, 2018, 8: 6449．
Mohamed A, Sun C, De Mello V, et al. The Hippo effector TAZ ( WWTＲ1) transforms myoblasts and TAZ abundance is associated with reduced survival in embryonal rhabdomyosarcoma. J Pathol, 2016, 2 40: 3-14.
Feng JT, Ren PW, Gou JH, et al. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis [J]. oncotargets Ther, 2016, 9: 5235-5244．
Yang LQ, Huang MY, Tan J, et al. Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif overexpression promotes cell proliferation and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif deficiency induces cell cycle arrest in neuroblastoma [J]. oncol Lett, 2017, 13: 4295-4301．
Wang Q, Xu ZL, Qun A, et al. TAZ promotes epithelial to mesenchymal transition via the upregulation of connective tissue growth factor expression in neuroblastoma cells[J]. Mol Med Rep, 2015, 11: 982-988．
Zafar A, Wang W, Liu G, et al. Molecular targeting therapies for neuroblastoma: Progress and challenges[J]. Med Res Rev. 2021 Mar; 41(2): 961-1021.
Lamers F, van der Ploeg I, Schild L, et al. Knockdown of survivin (BIRC5) causes apoptosis in neuroblastoma via mitotic catastrophe[J]. Endocr Relat Cancer, 2011, 18(6): 657-668.
Liang H, Zhang L, Xu R, et al. Silencing of survivin using YM155 induces apoptosis and chemosensitization in neuroblastomas cells[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2013, 17(21): 2909-2915.
