临床生化检测系统中测量程序对检验质量的保证

易斌，医学博士，博士研究生导师，教授，主任技师。现任中南大学湘雅医院临床检验学教研室主任、检验科主任。主要社会任职有：国家卫生健康标准委员会医疗服务标准专业委员会委员，中华医学会检验分会临床化学学组委员，中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会鼻咽癌标志专家委员会常务委员，湖南省医学会检验专业委员会副主任委员，湖南省医师协会检验医师分会副会长，湖南省中西医结合学会检验专业委员会副主任委员，湖南省医院协会临床检验管理专业委员会委员，湖南省健康服务业协会医卫检验分会常务理事，湖南省医学教育科技学会医学检验教育专业委员会常委等。卫生部规划教材《临床检验仪器》编委，湖南省卫生系统高级职称评委、政府采购评标专家，国家认可委ISO 15189技术评审员，《中华检验医学杂志》、《中华预防医学杂志》、《中国医师》等杂志审稿专家。主持国家自然科学基金2项，省市级课题多项。近年来在《Journal of Proteome Research》《J Cell Biochem》《Oncotarget》等杂志发表学术论文50余篇。

检测系统是用于检测或评估待测物质存在与否，或对血液、体液中的物质进行定量的一组装置。在临床检验工作中，完成标本检验必须的仪器、试剂、校准品和测量程序等的组合为检测系统。目前国际国内一些知名厂商均能提供完整的检测系统，其系统性能得到了主管部门确认，它有完整的溯源程序，称之为配套系统。而非配套系统则是由实验室按照自己的意愿，选择需要的仪器、试剂、操作程序（一般没有校准品，有标准液）等组合的检测系统。目前在我国非配套生化检测系统占据较大的比重。如何保证国内大量的实验室自行建立的检测系统检测结果的可靠性和溯源性，是一个极为重要的现实问题。以美国病理学家协会（CAP）2015年开展的胆固醇室间质评为例，它有5234家医学实验室参与，其中5189家实验室的检测系统集中在雅培、贝克曼、罗氏、西门子这几家公司，主要是封闭系统。而我国原卫生部临检中心2015年开展的胆固醇项目室间质评中，在参与的1692家医学实验室里，使用的仪器型号和试剂品牌均超过100个，校准物厂家超过70个，由此组合而成的检测系统超过850个。这与美国相比，检测系统呈现出明显的多样性（仪器、试剂品牌多，封闭系统、配套开放系统、非配套开放系统并存），多数为开放系统且不少为非配套开放系统。国内现在生化试剂品牌多，检测系统配套率低，而美国在实施CLIA’88法案后，IVD产品注册时要求以检测系统形式注册，这有助于配套生化检测系统的普及。未来，中国的医学实验室采用配套生化检测系统也将是发展趋势。

评价检测系统的分析性能离不开两个维度，即正确度和精密度。溯源性是保证检验结果正确性的前提，检测系统是保证检验结果精密度的前提，这两方面缺一不可。医学实验室每天检测的患者标本的结果是用户常规检测方法检测的，常规检测方法使用产品校准品来校准，而产品校准品还要进一步向上溯源。溯源性就是通过一条已知不确定度的不间断的比较链，使检测结果或标准值与规定的参考，通常是国家或国际标准联系起来的特性。检验科作为检测患者标本的临床实验室，需要通过使用厂家的校准品来建立检测系统的溯源性。作为终端用户来说，到了产品校准品这一步再往上追溯，单靠检验科是无法实现的，需要由参考实验室、参考系统通过量值传递来实现溯源性，这就要求标准化实验室、参考系统一定要由厂家实验室来补充。医学实验室选择项目具有溯源能力并且有文件证明材料的厂家，建立检测系统的溯源性，得到的患者检测结果才具有溯源性。

生化检测系统四要素包括仪器、试剂、校准品和测量程序。如前所述，根据目前我国临床检验实际工作的现状，生化检测系统主要分为3类，一类是配套检测系统（AAA），即仪器、试剂、校准品都是一个厂家的。这是最理想的状态也是国外目前主流的形式，在国内所占的比重也越来越大。配套检测系统投入到实验室使用前仅需验证基本性能即可。另一类是开放检测系统（ABB），比如以进口的生化分析仪搭配国产生化试剂和校准品，试剂生产厂家在进行产品注册时直接在该品牌同型号生化分析仪上进行了验证，可以看作是配套检测系统。如有溯源和全性能验证，投入使用前同样仅需验证基本性能。目前医学实验室使用最多、同时也是问题比较大的是开放检测系统（ABC），即一个厂家的仪器，另一个厂家的试剂，第三方的校准品。从理论上来讲，每种试剂应该在适用机型上充分验证，但生化分析仪品牌众多，试剂品牌数量更多，可能无法遍及所有的机型。此类生化检测系统在检测高浓度或特殊样本时难以保证结果的准确可靠，如果一旦操作人员没有及时发现，其后果是非常严重的。

生化检测系统中的测量程序对于检测结果的准确性至关重要。测量程序是经过反复验证、确认，最终固化到系统中的一系列精细化参数，是检测系统不可或缺的一部分。测量程序的精髓是算法，其可以不断提高检测系统解决临床问题的能力，提升达成目标的概率。测量程序的优势基于基本程序和进阶程序，基本程序要满足分析方法和校准方法、主副波长、空白时间和反应时间、样本量和试剂量，有了这些基本程序大部分的标本都能够得到准确的检测结果。进阶程序要求包括底物耗尽限和酶线性扩展、Trinder’s反应异常监测、前带检查、自动稀释参数、尿液参数、防交叉污染参数等。作为医学实验室要更加关注对特殊样本起到关键作用的参数设置，这才是评价一个检测系统检测性能的关键。作为进阶程序，一张说明书是没办法提供完全的，只有配套和固化的程序才能够帮助临床解决问题。测量程序的应用可以减少潜在的出错风险，提高患者和临床满意度，优化流程并缩短TAT，提供最大化的质量保证，尤其是对于异常样本的检测。临床检验实际工作中经常会遇到检测结果和临床表现不符、高值样本假性偏低、高浓度样本结果不准等难题，这些问题通过设置适当的测量程序可以得到很好的解决。如临床生化检验中与Trinder’s反应相关的结果不准确问题、HOOK效应以及酶显色反应-底物耗尽等问题。下面将分别介绍这些问题从测量程序角度的解决方案。

Trinder’s反应的原理为被测物质通过酶作用产生的过氧化氢（H2O2）在4-氨基替比林（4-AAP）、过氧化物酶（POD）的存在下，可生成红色醌亚胺化合物。临床生化检验中许多检测项目都应用了Trinder’s反应，如GLU、TG、TCHO、UA、HDL、LDL等。但是由于催化Trinder’s反应的过氧化物酶对底物的专一性差，受到多种物质干扰，如维生素C、尿酸、谷胱甘肽及胆红素等还原性物质会与色原性物质竞争H2O2，从而使氧化还原过程中产生的H2O2被消耗，导致测定结果假性偏低。由于该类反应需要溶液中的O2参与反应，当样本浓度过高，溶液中O2溶解量相对不足时，测定结果将出现较大偏差。以TG为例，在一个大气压下，当样本中TG浓度大于21.4mmol/L后，本身溶液中的溶解氧就不再满足反应需求。在这样的情况下，首先原量测试时候通过反应曲线监控能够发现异常，而且会在屏幕上提示并异常报警，报警后用户如果选择自动稀释，仪器会进行自动稀释重测，然后乘以稀释倍数得到准确的结果。这是甘油三酯（TG）过高导致的Trinder’s反应异常的监控程序。通过这个监控程序，检验科工作人员可以在仪器上面设置各种反应曲线吸光度的监测模式，可以完整覆盖所有的反应可能出现的异常问题。通过自动稀释（稀释倍数出厂前经过验证）、减量参数，把稀释方式固定，可以解决高值标本稀释准确性的问题，拓展了检测项目的临床可报告范围，一次测试即可出结果，节约了试剂和时间。

其次是抗原抗体反应—HOOK效应，这也是临床检验中的一个难点。众所周知，抗原抗体反应会存在钩状效应（HOOK效应）。当抗原浓度过高的时候会出现抗原抗体结合物的再溶解，导致假性的低值。检测物中过高的抗原量，再加上检测抗体浓度不够，反而会报出低值，这就是钩状效应。适当的测量程序设置可以有效识别钩状效应。通过不同浓度反应曲线特征识别，在配套系统中，内置经过验证的高阶监测参数，能够保证出现抗原过剩的时候及时发现。如某医院RF项目因HOOK效应，两套系统之间检测结果差异达25倍，A系统原倍检测结果为53.57IU/ml，查看A系统反应曲线出现问题，随即触发内置监测参数-智能关联选择稀释合适倍数进行验证后变成直线型的反应曲线。经过自动稀释20倍再次检测结果为1758.27IU/ml。B系统原倍检测结果为67.41IU/ml，与A系统检测数值相比存在明显差异，而B系统没有设置自动稀释，也未设置报警程序，采用手动稀释，再次检测结果为1919.61IU/ml。如果不与A系统做比对，仅仅采纳B系统的检测结果，而B系统操作人员又没发现错误就发出报告，无疑将造成严重的后果。

下面介绍酶显色反应中底物耗尽造成的检验结果不准确的识别。如反应底物耗尽而酶因为浓度过高还没有反应完全，这样就会得到错误的结果。基于这种情况采用底物耗尽功能，针对异常值给出结果标记，并启动酶线性扩展计算，又称为读点前移，这样有助于确保检测结果的准确。以本实验室一例样本AST检测结果为例，未设置底物耗尽参数时检测结果为29.5U/L，未报警提示；设置报警参数后，自动稀释重测，结果为6132U/L。通过检测系统中设置的读点前移或者酶线性扩展功能，可提高可报告范围，一次测试出结果。异常结果标记为“BOE、NLN、EXP、ENC”，提示用户处理或自动重测，自动稀释重测所用倍数为项目参数界面自己设置的增、减量参数，即把稀释方式固定下来，解决了高值标本稀释准确性的问题。

携带污染也是临床生化检验中常见的问题，主要类型为试剂携带污染以及反应杯携带污染。试剂携带污染的原因之一是污染物中含有Mg2+离子。以某三甲医院检验科生化室为例，检验科工作人员反映在A检测系统上使用配套试剂，Mg2+检测结果正常；而在B检测系统上使用A品牌ALP和GGT试剂之后，Mg2+结果出现偏高，怀疑试剂交叉污染所致。查看B检测系统近日Mg2+结果情况，发现均值在0.920mmol/L以上，超出之前均值水平；观察当日高值样本情况，其中异常高值（与历史结果不符合）11例，其中6例为病人原因导致Mg2+结果偏高，剩下5例高值样本组合均为全套项目。制定交叉污染试验并且复查该5例高值样本，复查结果中有2例结果明显降低，由于样本均为生化全套项目测试，而通过仪器试剂加样顺序发现，Mg2+与ALP、GGT中间间隔12个项目，因此不考虑试剂交叉污染导致。分别测定ALP、GGT对Mg2+的试剂交叉污染，结果显示：在该仪器设置情况下，A品牌试剂对Mg2+没有试剂的交叉污染。在交叉污染实验中，发现模块2精密度差，根据工作人员反馈TBA也会出偏高现象，进行TBA和Mg2+精密度实验。结果显示2单元模块中多项目精密度结果较差，出现偏高现象，与检验科工作人员反馈现象符合，考虑仪器原因导致。检验科工作人员要求B品牌仪器工程师进行了仪器维护保养，包括反应杯、管路以及清洗结构的维护保养，完成后进行结果追踪。再次复测结果显示Mg2+样本均值明显降低，至0.90mmol/L以下，并且未再出现复查与原始结果不符合情况。综上所述，交叉污染解决方案可以将测试顺序调整，将污染对项目间隔开，设置交叉污染对，仪器遇到交叉污染对项目时进行强化清洗；同时对于试剂厂家来说也可以进行配方改进以消除污染源，如去除TC中的胆酸钠，可根除TC对TBA的交叉污染。优化方案也可采用优化的碱性清洗液和新增的酸性清洗液，提升仪器维护清洗的效果。

总而言之，生化测量程序是封闭检测系统中的关键一环，是经过反复验证、确认，最终固化到检测系统中的一系列参数。在临床检验工作中，应尽量保持检测系统的完整性，改变系统后必须进行性能验证和确认。充分理解、验证、使用检测系统配套测量程序，一切以保证患者标本检验质量为前提，才能确保检验结果准确无误。