CRISPR-Cas12a系统生物传感技术在临床检验中的应用前景与研究方向
洪国粦，教授、博士研究生导师、博士后研究生导师。现任厦门大学附属第一医院检验科主任，厦门大学公共卫生学院实验医学系副主任，厦门大学教授，博士生/博士后导师。长期从事临床检验诊断学、临床实验室管理学等临床、教学和科研工作，主要研究领域为检验新技术及其应用研究，近年先后主持国家自然科学基金面上项目3项，国家重大专项子课题4项，福建省自然科学基金项目4项等各类科研课题共15项，以第一或通讯作者发表SCI论文近50篇。获福建省医学科技奖二等奖一项，福建省科学技术进步奖三等奖二项，厦门市科学技术进步奖三等奖一项，福州市自然科学优秀论文一等奖一项，福建省自然科学优秀论文三等奖一项，获“人卫杯”医学检验教育教学优秀论文一等奖。
王玉凤，研究生。研究方向：生物传感的临床检验新技术。
【摘要】体外诊断在疾病的确诊及治疗过程中发挥着越来越重要的作用，因此，无论在资源匮乏还是资源丰富的环境中，都迫切需要快速、灵敏、特异且负担得起的即时诊断。近年来，新兴的生物传感技术基于规律间隔成簇短回文重复序列及其相关蛋白系统（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated nuclease，CRISPR-Cas）展示了其信号放大的强大检测能力，受到越来越多的关注。本文论述和介绍了CRISPR-Cas12a系统信号放大的原理，回顾了近几年基于CRISPR-Cas12a技术的生物传感器在单核苷酸多态性，细菌，病毒，小分子方面的检测的研究进展，并讨论了CRISPR-Cas12a在即时检测（point-of-care testing，POCT）方面面临的挑战及未来的研究前景。
【关键词】CRISPR-Cas12a；快速检测；生物传感技术
现代分析科学和生命科学对生物检测的终极目标是实现超高灵敏度与超高特异性。准确检测病原体可以为疾病的即时诊断提供准确的信息，从而为疾病管理和治疗提供宝贵的意见。为了实现这个目标，核酸扩增技术提供了更大的可能性，正在彻底改变着生物检测领域[1]。其中，以CRISPR-Cas12a为基础的体外诊断新技术正异军突起，它不仅可以像许多其他CRISPR-Cas系统一样切割目标DNA，还可以不加选择地切割目标DNA附近的任何非目标ssDNA[2-3]。这种非靶向ssDNA的反式切割可以在许多应用中显著提高DNA检测的灵敏度。CRISPR-Cas12a作为新兴检测技术，正在发挥着越来越重要的作用[4-5]。本文将分别讨论CRISPR-Cas12a在不同类型目标中的检测原理和最新进展，揭示其在实现快速准确的生物检测方面的优势和面临的挑战。
一、CRISPR-Cas12a系统
CRISPR及其相关基因Cas利用RNA引导的核酸酶靶向和降解外来核酸，被广泛认为是细菌针对入侵性基因的自适应防御系统[6-8]。到目前为止，所有已识别的CRISPR-Cas系统被分为两大类，根据其位点和特征蛋白的组织结构进一步细分为不同的类型和亚型。I类CRISPR-Cas系统包括I型、III型和IV型，它们采用多亚基效应复合物。II类CRISPR-Cas系统使用单一RNA引导、多域Cas蛋白来识别和切割目标序列。II类CRISPR-Cas系统包含多种类型，包括II类系统，如Cas9，V型，Cas12和Cas14亚型（现在称为Cas12f），以及VI型，包括Cas13系统[9-11]。CRISPR-Cas识别目标序列后，由RNA引导（sgRNA），切割目标DNA，形成位点特异性DNA双链断裂，在对特异性靶点识别和切割之后，Cas12a、Cas13和Cas14对ssDNA或ssRNA表现出非特异性活性[12-15]，这些活性可用于核酸的检测应用。
CRISPR-Cas12a使用单个RuvC催化结构域进行引导RNA定向的dsDNA切割识别富含T的原间隔邻近基序（PAM）的目标序列后，形成位点特异性的具有交错5’端的dsDNA双链断裂（DSB）（称为cis切割）。研究发现，Cas12a与crRNA以及靶标DNA形成三元复合体后，该复合物就会显示出很强的“乱切”活性，并将体系中任意单链DNA切成碎片（称为trans切割）。借助质谱分析，研究人员发现Cas12a将ssDNA切成2-4nt的片段。根据一系列点突变的实验结果，研究证明了Cas12a的cis和trans切割活性均和其RuvC口袋（‘RuvC pocket’）相关，并据此提出了Cas12a切割ssDNA的分子模型[16-18]。Cas12a对ssDNA或ssRNA表现出非特异性活性，切割ssDNA-FQ，导致荧光团和猝灭剂分离，最终产生明显的荧光信号。Doudna实验室利用该原理首先设计了一个等温DNA检测平台，称为DETECTR，DETECTR在临床标本的病毒检测方面显示出了强大的能力，具有较高的检测灵敏度[2]。由于Cas12a的反式切割活性的激活是基于沃森克里克的碱基互补配对原则，只有目标DNA存在时，与crRNA互补配对激活Cas12a，才可检测到靶标[19]。兼具碱基互补配对的高特异性与信号放大的高灵敏度，CRISPR-Cas12a在POCT方面展示出的优势使得近年来对于它的研究及拓展越来越丰富，从细菌到耐药，从病毒，SNP，到小分子的检测，不断的提升速度与灵敏度。
二、CRISPR-Cas12a系统的应用
1. SNP检测：单核苷酸多态性（SNPs）是单个核苷酸的改变所引起的DNA序列多态性，是人类基因组中最常见、最稳定的变异形式。人类基因组中存在着约30-1000万个SNPs位点，在编码区，SNP可以引起蛋白质结构和功能的改变，从而导致疾病的发展或对药物或环境毒素的反应发生变化。因此，SNP已被用作许多疾病遗传学和药物基因组学研究中的分子标记[20]。Wang等开发了一个HOLMES平台，在反应体系中存在目标DNA的情况下，Cas12a-crRNA二元复合物与目标DNA形成三元复合物，然后触发反式系统中非靶向ssDNA报告基因的裂解，产生HEX荧光，通过SNP位点的不同，设计相应的crRNA。当序列突变时，由于与crRNA不匹配从而不产生荧光信号。当与PCR相结合后，灵敏度可低至10aM，比单独PCR或SYBR Green法的定量PCR效果更好[21]。这篇文章探索了CRISPR-Cas12a识别单碱基突变的能力。在目标DNA序列的不同位置设计点突变，包括PAM区和引导RNA识别序列。当crRNA引导序列长度减少时，Cas12a具有更高的切割特异性，因此当使用16-nt和17-nt的crRNA，点突变导致的2倍以上信号差异能够在较大区域（1-16个碱基）内产生。由于SNP位点附近可能不存在合适的PAM序列，这篇文章还设计了PCR扩增引物来引入PAM序列，通过扩增，产生大量的带有PAM序列的目标分子。HOLMES可用于检测DNA病毒如伪狂犬病毒和RNA病毒如乙型脑炎病毒，两者的灵敏度可低至1-10aM。
此外，Jiang[22]等也设计了基于CRISPR-Cas12a的生物芯片用于SNP的检测。同样为了摆脱PAM的序列限制，通过PCR扩增将PAM序列插入预定位置来扩大应用范围。带有U碱基的uA-crRNA对应于野生型位点A，带有C碱基的uG-crRNA对应突变型位点G，只有当crRNA与相应的靶DNA互补时，Cas12a才可以快速切割ssDNA并产生显著的荧光信号，然而，当crRNA与靶DNA错配时，Cas12a活性会显著降低，几乎不产生荧光信号。对于PCR引物，如果PAM序列在靠近3’端的位置插入会显著降低扩增效率，因此该团队设计了6条PAM序列在不同位置的正向引物来比较扩增效率。这个方法是将PAM序列插入远离3’端，而等位基因特异性PCR是在引物的3’端引入错配，因此与等位基因特异性PCR相比，该方法显著提高了扩增效率和引物设计的成功率。由于Cas12a核酸酶的反式切割活性随着crRNA与靶DNA错配核苷酸数量的增加而降低，为了提高SNP基因型的两倍以上信号差异，额外的引入错配核苷酸可以提高检测的信噪比。因此该团队在突变位点附近设计了一个额外的单核苷酸错配，信号强度下降了近十倍。总体而言，该策略适用于任何SNP位点的检测。最后，为了提高自动化和减少干扰，该团队将CRISPR-Cas12a试剂预先加载到POCT微流控生物芯片中，检测了与多种癌症相关的基因，包括CYP1A1*2，CYP2C19*2，CYP2C9*3，CYP2C19*3，在17个人类全血样本的检测中，运用该策略得到的结果与焦磷酸测序一致。基于CRISPR-Cas12a的SNP基因分型方法具有普适、准确、灵敏等特点，在分子诊断和临床研究中具有广泛的应用前景。该方法也可用于各种应用，如家族谱系分析，农业，生物学/生物化学的基础研究，群体遗传学研究，生物起源，进化和迁移等等方面。
2. 细菌鉴定：细菌对抗生素的耐药性的增加对公共卫生构成了巨大挑战，在临床中，细菌鉴定及表型抗生素敏感性试验耗时较长，一定程度上延误了患者的抗感染治疗。而且细菌及其耐药一般涉及多重检验，当用多重PCR对细菌进行基因分型，对扩增产物的后续检测通常使用琼脂糖凝胶电泳，较为耗时耗力，限制了该方法的检测效率。另外，在PCR中引入TaqMan探针，多重实时荧光定量PCR大大提高了多重检测能力，但由于现有荧光团的荧光光谱重叠，不能同时检测4个以上的基因。由于Cas12a的反式切割活性的激活是基于沃森克里克的碱基互补配对原则，只有目标DNA存在时，这与crRNA互补配对激活Cas12a，才可检测到靶标。基于这一机制，理论上多个检测目标之间完全不受彼此干扰，因此CRISPR-Cas12a具有高特异性及多重性。
基于此，Xie等[19]联合多重PCR和CRISPR-Cas12a开发了快速检测多重耐药鲍曼不动杆菌的方法。通过多重PCR对鲍曼不动杆菌的管家基因以及4个β-内酰胺类耐药基因同时扩增，利用CRISPR-Cas12a不加区分的单链DNA酶活性对多重PCR产物进行单一荧光信号输出，此外，通过设计DNA模板和一系列不同互补长度的引物对来模拟产生引物二聚体，证明了CRISPR-Cas12a系统对引物二聚体的特异性。该体系可在2小时内完成鲍曼不动杆菌的基因型抗生素敏感性试验，并且检测限达到50 CFU/ml。在细菌浓度为102-105 CFU/ml的范围内，荧光信号与细菌浓度呈对数相关（R2＞0.98）。有报道称可以在单管中可以进行多达数千重PCR，由于CRISPR-Cas12a系统的激活是基于crRNA识别目标DNA时碱基的互补配对，信号输出模式是基于单一荧光色，而且该团队证明，crRNA对于引物二聚体具有精准的识别能力，不易出现假阳性结果。因此只要对crRNA的特异性进行评估，就可以同时检测到无限种类的耐药基因。crRNA条形码与微流控芯片的结合将进一步提高CRISPR-Cas12a检测新方法的适用性。这种生物传感器构建策略将促进基于CRISPR-Cas12a的生物检测技术在细菌感染诊断中的应用，并在不久的将来为在资源有限的地区开展POCT检测提供新思路。
3. 小分子检测：CRISPR-Cas12a传感器不仅可用于核酸检测，还能用于非核酸靶标的检测。Lu等[23]设计了一个探针系统，该系统包括fDNA和DNA激活器，以及一个由预先组装的crRNA和两端标记有荧光团和猝灭团的单链荧光DNA组成的Cas12a效应器。在没有非核酸靶标的情况下，fDNA以高于环境温度的熔融温度与DNA激活剂结合，阻止其与Cas12a-crRNA复合物结合，使得Cas12a的反式切割活性不能被激活，因此ssDNA-FQ报告基因保持完整，无法产生荧光信号。而在非核酸靶标存在的情况下，靶标与fDNA结合可以释放DNA激活剂从而激活Cas12a。这样，附近的ssDNA报告基团就可以被切割，导致荧光团从猝灭剂中分离出来，从而使得荧光信号的显著增加。该体系选择了在许多生物中起重要作用的细胞能量载体ATP的作为靶标，使用了两个ATP适配体来锁定激活DNA，在ATP存在的情况下，ATP适配体与ATP的结合导致DNA激活剂的释放，从而触发Cas12a-crRNA的反式切割活性。利用此适配体调控的CRISPR-Cas12a传感器检测了含有许多干扰基质的人体血浆中的ATP含量，在1.56μm~100μm范围内，荧光信号与ATP浓度成正比，LOD为0.44μm。此外，该团队还将钠离子特异的DNAzyme与DNA激活链结合以用于钠离子检测，线性范围为0.049mm~50mm，LOD为0.10mm，远低于人血清中的正常的Na离子浓度。由于fDNA可以从一个大的DNA文库中获得，以识别广泛的靶标，包括金属离子和有机小分子以及蛋白质甚至病毒和细胞，因此该方法可以将这个强大的CRISPR-Cas12a传感器系统扩展到许多其他靶标，从而为拓宽CRISPR-Cas系统的生物分析和生物医学应用提供一个新的工具箱。
此外，Zhang等[24]结合CRISPR-Cas12a的单链DNA反式切割活性和细菌变构转录因子（aTFs）对小分子以及双链DNA的竞争性结合活性，设计了一个称为CaT-SMelor的平台用于aTFs的检测。首先，包含PAM序列的功能dsDNA和相应的aTF特异性结合在aTF的DNA结合域。在目标小分子存在的情况下，aTF的构象发生改变，导致dsDNA与aTF结合域解离。然后游离的dsDNA结合到Cas12a-crRNA复合物，激活非特异性的ssDNA的反式切割活性（活化的Cas12a），开始切割荧光团和猝灭剂分别标记在两端的ssDNA探针，通过测量荧光信号的变化，从而对目标小分子进行定性或定量分析。当该方法用于小分子尿酸的检测时，结果表明，对尿酸的检出限为10nM（终浓度），在25~500nm范围内，随着尿酸浓度的升高，荧光信号逐渐增强，斜率呈线性关系（R2＞0.99）。对血清样品中的尿酸进行检测时，CaT-SMelor和生化分析仪获得的每个样品的结果几乎相同。细菌aTF是广泛存在的转录调节蛋白，大部分可以感知各种小分子，包括代谢物、化学物质、重金属等，因此CRISPR-Cas12a和aTFs的结合在未来开发用于小分子检测或疾病诊断方面具有巨大的潜在效用。
三、CRISPR-Cas12a系统的总结与展望
及时的检测和评估病原体感染是有效进行疾病控制和根除的关键。因此，高效的现场诊断技术的产生将大大改善传染病的检测、监测和控制。目前的现场诊断存在一些主要缺陷，包括灵敏度、成本以及对设备和熟练技术人员的需求。新近出现的基于CRISPR-Cas12a的诊断技术有可能克服这些缺点，可以提供一种快速、现场、灵敏、特异的定量检测方法。但CRISPR-Cas12a在传感领域尚不成熟，仍有许多挑战需要克服。
首先是目标浓度较低，现有的技术大多需要第一步的扩增，包括PCR，LAMP，RPA等，难以实现扩增和CRISPR-Cas12a信号输出两个体系的混合，因为反应温度及各种离子缓冲液均不一致。这些都需要开盖再反应，由于CRISPR-Cas12a系统的高敏感性，可能带入的污染就会非特异性激活CRISPR-Cas12a导致结果的假阳性同时也会降低生物传感的灵敏度。有团队将RPA试剂，crRNA和ssDNA-FQ先置于管中，待扩增反应后再加入CRISPR-Cas12a，在不到50分钟的时间内对细菌的检测限为1 CFU/ml[25]，但RPA试剂较贵，体外诊断成本较高。后续研究方向可对CRISPR-Cas12a体系包括crRNA序列的优化，缓冲液离子环境等再进行优化，进一步提升灵敏度，从而摆脱扩增的限制。其次是样品的预处理，样品预处理是核酸检测的瓶颈，特别是对于原始样品，如血清、尿液等。未来，非常需要开发耐受能力更好的Cas效应器或建立适应生物传感过程的样本预处理策略。还可以定制更方便、易于操作的仪器以适应基于CRISPR-Cas12a的生物传感，例如方便样品预处理等。将 CRISPR-Cas12a与其他平台如微流控、生物芯片、纳米技术、手机技术等集成也将是一种有效的解决方案[26]。
总之，基于CRISPR-Cas12a的生物传感代表了一种概念上新颖的检测范例。更重要的是，它正在快速扩展发展，并通过与现有的一些方法相结合，彻底改变体外诊断的方式，以满足多样化的需求。CRISPR-Cas12a系统在诊断方面具有巨大但尚未开发的潜力。我们相信，材料、工程、云计算和人工智能等多学科融合将使这些系统在未来的生物传感领域发挥前所未有的强大作用。
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