免疫学检查进展与应用分论坛

医学的发展要求免疫学检验技术能够特定部位取得微量样本进行精确的分析，随着分子生物学、微纳电子学等方面取得的进展，在此趋势下，更多新的、更敏感的分析方法将不断被应用，免疫学检验技术正朝着更高、更新的方向发展。为此，在第二届全国临床检验装备技术与应用学术大会免疫学检查进展与应用分论坛上，四位专家分别进行了详细的专题报告。

李教授从HIV检测的现状、HIV初筛与确证检测、HIV检测的未来展望三方面围绕主题进行报告。

中国HIV在国际上的流行率还是比较低的，截止2015年国内有75.2万人感染，死亡17.7万人。HIV病毒分离培养的方法是将病人的淋巴细胞与正常人的淋巴细胞共同培养，适当周期培养后测定培养液HIVp24抗原/RT，进而判断病人的淋巴细胞是否受到HIV感染。HIV的核酸检测方法包括核算序列扩增试验（NASBA）、分支DNA杂交试验（bDNA）以及聚合酶链式反应（PCR），核酸检测的意义是早期诊断、疑难样本的辅助诊断、遗传变异检测、耐药性检测、病程监控及预测以及指导抗病毒治疗及疗效判定。免疫学检测方法包括抗原、抗体初筛检测、抗体确证检测、流式细胞仪分析。

HIV初筛的免疫学检测方法有免疫层析、ELISA、化学发光。免疫层析的方法可作为初筛方法，但灵敏度、特异性存在问题；ELISA和化学发光检测均已发展到第四代，且灵敏度、特异性有差异。早期检测漏检是实验室漏检的最重要原因，其中窗口期的原因占到93.7%，其他原因如非典型血清学转换、病毒变异、实验室误差的比例较低。而化学发光比ELISA的窗口期进一步缩短。初筛试验的标本类型可以是血清、血浆、唾液、口腔粘膜渗出液、尿液。HIV抗体确证检测方法包括免疫印记（WB）、免疫荧光（IFA）、免疫条带（LIA）、放射免疫沉淀（RIPA）。从302医院2013~2015年确证实验总体数据分析，其中阳性51%，阴性18%，不确定31%。HIV各类试剂的窗口期及特点：①金标法：窗口期35天，敏感性低、易漏检；②ELISA（国产三代）：窗口期20~25天，较普及、稳定性较差；③ELISA（进口三代）：窗口期18~22天，较成熟、稳定性较好；④ELISA（进口四代）：窗口期16~17天，假阳性率偏高；⑤发光法：窗口期14~15天，灵敏度高、稳定性好、现较普及；⑥核酸检测：窗口期10~12天，实验要求高、成本高、不常用。

HIV自我居家检测是检测者居家自行采集样本（血液、尿液），将其邮/送至专业实验室检测，通过电话或网络获取结果，并由专业人员提供咨询和转介服务的情形，是个人行为与专业服务相结合的系统活动。美国的FDA批准唾液快速可用于居家自检实体药店，线上销售，目前没有血液自检试剂；欧洲没有居家检测产品批准，但在线可以买到产品，也没有血液自检试剂；而我国无审批的专门用于自检的试剂，在有资格的网上药店、不跟网站和个别实体药店可以买到血液及唾液快速试剂。

HIV检测新的技术：1、结合手机APP的CD4快速检测；2、生物传感器检测病毒载量；3、数字PCR技术用于HIV核酸检测。

李伯安教授

世界范围内胃癌发病率排名第五，死亡率排名第三，发病率呈明显地区分布差异。日本、韩国、中国高发，欧美发病率比较少见。世界上大多数国家没有开展胃癌筛查，只有日本进行早期检测（韩国也有部分地区开展），中国在2014年发布指南，建议对高危人群进行筛查。

胃癌与消化道肿瘤标志物几乎一致，包括CEA、CA19-9、CA72-4、CA125等。胃癌高位筛查在日本的筛查人群是年龄大于40岁，筛查策略采用PG法（PG检测+胃镜）、ABC法（PG检测+幽门螺杆菌检测+胃镜）；而中国《健康体检基本项目专家共识（2014）》将肿瘤标志物CA72-4、CEA也纳入了胃癌筛查套餐中。

胃蛋白酶原（PG）是由胃部分泌的参与消化的胃蛋白酶的前体，通常约1%的PG可通过胃黏膜进入血液循环，可分为PGⅠ和PGⅡ两种亚型，可以较为准确地显示胃黏膜的状态和功能。PGⅠ是由胃底腺的主细胞分泌，PGⅡ由胃底腺、贲门腺、幽门腺所分泌，虽然PGⅡ的浓度相对比较低，但其分泌区域比PGⅠ的大。日本研究发现，在常规体检中大约有15%左右的人血清PG水平异常，进一步进行胃镜检查，其中90%以上的患者有不同程度的浅表性胃炎、糜烂性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、萎缩性胃炎、胃癌等胃部疾病，PGⅠ及PGⅠ/ PGⅡ比值明显降低的高危人群的胃癌发生率一般比正常人群高数十倍。所以定期检测PG并积极干预治疗是预防胃癌的有效手段。PG检测在日本应用非常普及，大部分早期胃癌在内镜下即可获得根治性治疗，5年生存率超过90%，而目前我国早期胃癌的诊治率低于10%，远远低于日本70%和韩国50%。

CA72-4对胃癌监测复发的阳性率优于其他TM，其水平与胃癌分期、肿瘤大小、淋巴结受累及浸润转移等生物学行为密切相关，联合CA72-4和CEA检测结直肠癌的敏感性高于单独检测CEA。胃癌伴浆膜层浸润或远处淋巴结转移的患者，CA72-4明显升高，提示CA72-4有分期、预后的价值。胃癌术前CA72-4、CA19-9高水平患者，存活期比低水平短；死亡风险比值CA72-4比CA19-9的稍高。CA72-4能很好地反应化疗的疗效，与WHO客观疗效评估标准相符。CA125及CA72-4对于胃癌患者腹腔播散的意义：CA125升高程度与胃癌患者腹水相关程度以及腹腔转移程度呈正相关。CA72-4假阳性受布洛芬、奥美拉唑、类固醇等药物的影响，接受布洛芬、奥美拉唑、类固醇药物治疗的胃癌患者中，32.6% CA72-4水平升高，其中2%的患者CA72-4水平超过80U/ml，甚至超过400U/ml。

约30%人类肿瘤均可发生K-ras突变，在胰腺癌、结直肠癌和肺癌中尤其常见；胃癌中也存在一定的K-ras突变，突变率为6%；多个Ⅱ-Ⅲ期胃癌临床研究中，总突变率为3.4~9.4%。肠型胃癌患者的K-ras突变频率显著高于弥漫型；具有K-ras突变的近端胃癌患者的生存时间短于未突变者。

齐军教授

2014年中国心血管病报告中指出全国有心血管病患者2.9亿，在死亡人数中，每死亡5个人中就有2人是心血管病，每天心血管病死亡9590人，每小时心血管病死亡400人。心血管病占总死亡人数的首位，它的危险因素包括吸烟、高血脂、糖尿病、超重/肥胖、运动不足、不合理膳食、代谢综合征等。

未来10年，谁发生冠心病的风险更高？谁更应该接受积极的冠心病预防干预？肌钙蛋白是心梗诊断的首选生物标志物，是心肌的结构性蛋白，有高度的心脏器官特异性和临床特异性，是心肌损伤的早期最敏感指标。cTnI在骨骼肌发育的各个阶段都不表达，具有高度心肌特异性，更优于cTnT。传统cTn检测方法的不足之处是：①无法测出循环中低水平的cTn；②无法达到在参考对照人群第99百分位值变异系数≤10%的精密度要求，影响特异性；③早期诊断的敏感性较低：在缺血症状不典型或心电图改变不典型时，可导致延迟诊断甚至误诊，不利于对患者风险和预后的判断；④影响检测因素多，不同cTn检测系统之间结果差异大。而高敏肌钙蛋白较传统检测方法的检测低限低10~100倍，能在表面健康人群中检出cTn，在参考对照人群第99百分位值变异系数≤10%的分析精密度要求，一次检测值对心肌梗死的阴性预测值达到95%以上，发病后3小时以内两次检测对诊断心肌梗死的敏感性可达到100%。IFCC新的共识在评价高敏肌钙蛋白的两大标准是：第99百分位值的总不精密度≤10%，健康参考人群的检出比例≥50%。

高敏肌钙蛋白在ACS的诊疗中，可根据hs-cTn两点变化率进行ACS排查，排查有两种方案：①0h/3h法：入院即查和3h后复查hs-cTn，根据两次结果相对变化率来排查，这是国内外指南主流推荐的方法；②0h/1h法：入院即查和1h后复查hs-cTn，根据两次结果绝对变化值来排查，这是2015年ESC（欧洲心脏病学会）首次推荐的方法，优点是大大提高了AMI的诊断窗口期，缺点是患者症状发作后入院非常及时（<1h）,则不适用该法。对于存在疑似急性冠脉综合征的患者，TnI检测运用0.05ng/ml作为截断值，可将心肌梗死的诊断率提升29%；TnI检测结果处于0.05~0.19ng/ml之间的患者被识别为高危组；患者被诊断为心肌梗死后，循证治疗率获得提高，并且由于心肌梗死所导致的死亡率及复发率共下降50%；将截断值从0.20降至0.05ng/ml对未来发现心肌梗死诊断的特异性下降。

安贞医院做了一个高敏肌钙蛋白对急性冠脉综合征的早期诊断研究，该研究共收集急诊以胸痛、胸闷为首发症状疑似ACS的368例患者血清，0h和3h血清248例患者中确诊为ACS的107例，0h和6h血清120例患者中确诊为ACS的53例，0、3h组和0、6h组两个时间点测定值、变化量及变化率经多组轶和检验均有显著性差异（P<0.01）。0、3h组hs-cTnI检测分析：入院3h曲线下面积（AUC）为0.916，高于入院0h、3h变化量、3h变化率的曲线下面积，诊断的价值最高，根据Youden指数判断最佳诊断值为87.6pg/ml，以此值为诊断值的敏感度为74.5%，特异度为91.0%；0、6h组hs-cTnI检测分析：入院6h曲线下面积（AUC）为0.914，高于入院0h、6h变化量、6h变化率的曲线下面积，诊断价值最高，根据Youden指数判断最佳诊断值为87.45pg/ml，以此值为诊断值时敏感度为83.3%，特异度为84.6%。结论：入院3h和入院6h检测hs-cTnI值诊断ACS的效率相当，但为了更早期诊断ACS，故以入院3h hs-cTnI值为诊断ACS最佳时间点，该时间点最佳诊断值为87.6pg/ml。

总结：1、高敏肌钙蛋白应使用第99百分位数作为截断值；2、应用肌钙蛋白第99百分位值可早期诊断/排除心梗、识别出更多的心梗，提高NETEMI诊断率（帮助临床积极采取治疗措施，改善预后）；3、降低截断值后，肌钙蛋白由心肌梗死标志物成为心肌损伤标志物；4、高敏肌钙蛋白连续监测，是截断值降低后提高特异性的最佳方式；5、实验室要有一个标准的操作流程，对检测试剂的方法进行必要的评估。

袁慧教授

高经理从主流免疫分析技术解读、免疫标志物检测的趋势、迈瑞公司的创新突破三方面围绕主题进行报告。

免疫分析具有高度的特异性与灵敏度，化学发光免疫分析的核心技术就是抗原抗体反应。按化学反应类型可分为酶促化学发光、直接化学发光、电化学发光。分离技术传统的方法是通过交联抗体的沉淀作用离心去除上清，而现在大部分厂家采用磁性颗粒。这些发光检测技术的灵敏度及线性范围都已经接近了免疫反应的极限，片面宣扬检测技术灵敏度和线性范围的强弱已经毫无意义，灵敏度的瓶颈在于抗体亲和力和抗干扰反应的因素，不是检测技术，这其中抗体筛选、屏蔽干扰、生产工艺、管理水平和技术服务是试剂生产的关键。

化学发光检测的项目一般包括甲状腺激素，性激素、内分泌激素，心肌标志物，肿瘤标志物，传染、感染病毒，骨代谢类等等，那么临床关注的是什么？是速度、时间还是重复性、批间差、特异性、灵敏度。在重复性方面，所有的厂家不断精益求精才能够满足临床的需求。提高试剂的林敏度。特异性上:①特异性抗体：高特异性标志物的寻找，新标志物的发现；②抗体的特异性：抗体的不断纯化；③抗干扰能力：抗自身抗体、HAMA等物质干扰。

在精准医疗时代，我们努力的方向在哪里？检测系统的稳定性上，需要加样系统、磁分离系统、混匀系统、孵育系统、底物注入系统、测光系统各方面的保障。磁性均质的保障是选用超顺磁性微珠，这样可以保证抗原抗体反应充分、灵敏度高、分散均匀、取样准确、重复性高。迈瑞发明了一个瓶内涡旋发生器的专利技术，可以让试剂在机器内智能定时混匀；在磁分离系统上，采用四阶磁分离清洗、永磁铁阵列模式、漩涡式磁微粒重悬浮技术以及高低速吸排液技术；使游离酶残留率由1ppm降低到0.1ppm，仪器基础精密度由5%降到1%。试剂的批间差是国内厂家的一个传统“诟病”，最主要的原因是平台标准化工作的不足。在这方面，迈瑞有一个酶标记方法及其稳定性配方的专利。在抗体原料的选择上，也有很严格的要求，配方的优化可以提升试剂的抗干扰能力。内源性抗体干扰的解决方案包括使用蛋白阻断剂、切除Fc片段、使用嵌合单抗手段，采用这些手段降低干扰程度。为了增强酶促化学发光，迈瑞采用特有的AmpEr体系。

高雅薇经理