标记免疫技术进展与临床实践分论坛

近年来，随着分子生物学、细胞生物学、基础免疫学和免疫化学等学科的快速发展，以及现代高新技术的仪器分析广泛应用，免疫标记技术得到不断完善与发展。在第二届全国临床检验装备技术与应用学术大会标记免疫技术进展与临床实践分论坛上，四位专家分别做了相关专题的精彩报告。

在报告中王自正教授结合核医学介绍了标记免疫技术的最新进展。标记免疫医学的发展方向是核医学的基础，同时也是现代标记免疫医学的所有技术进展的基础。分子标志与分子识别是医学研究的重点，针对特定的分子靶点，研制具有靶特异性的小分子载体，不管是对体外还是体内都将能在诊断治疗上取得更高的疗效价值。

标记免疫学，是一门综合性学科，是集基础医学、实验技术和临床应用于一体的学科；标记免疫分析可以按照示踪标记物及标记技术分为放射性核素标记、酶标记免疫分析、荧光标记免疫分析、化学发光免疫分析；还可按照反应体系物理状分为均相标记免疫分析、非均相标记免疫分析。

标记免疫技术的现状和发展，以及标记免疫技术与核医学展望。标记免疫学利用标记示踪技术,  在分子水平、蛋白水平、细胞水平上的测定方法进展迅速，对临床医学发展具有重要意义。标记免疫分析具有良好的发展前景，其灵敏度高、特异性强、重复性好，易于商品化和自动化。因此要全面正确的评价标记免疫分析的结果和方法，努力按照国家标准建立实验室管理体系。标记免疫分析自身具有如下特点：1，高度复杂的检测方法，多方面影响因素，包括标准品、抗体亲和力﹑滴度和特异性，标记物比活性、免疫活性，分离方法等；2，测定靶物质多是10-9克级以下，甚至10-15克级水平，生理影响因素较多；3，可接受CV范围在mg级水平10%左右，μg级水平20%左右，随着技术发展实际使用中CV值可维持在可接受的范围。从标记免疫技术的发展回顾，放射免疫技术是基础，从放射免疫、酶联免疫、荧光免疫发展到化学发光，在化学发光方面从光激化学发光、酶促化学发光、直接化学发光发展到电化学发光，在发展的过程中标记免疫技术特异性更强、灵敏度更高、重复性更好。化学发光免疫分析目前更是灵敏度可达10-18mol，快速（每秒可达数千光量子信号）成为非放射性标记免疫分析中最有前途的方法之一。其中磁珠分离技术发展迅速，目前国产化自主知识产权的磁分离技术层出不穷，如创新FITC-抗FITC连接的磁微粒分离技术和创新AP-APLS化学发光技术等。另外，标记免疫分析的延伸技术有DNA核酸杂交基因扩增技术--聚合酶链式反应（PCR）、DNA测序；细胞水平的荧光标记技术--流式细胞术；组织细胞水平的分子病理技术--免疫组织化学方法、核酸原位杂交技术。

在大量新技术、新材料基础上、呈现高灵敏、高通量、自动化趋势；单克隆抗体，其优化结构如嵌合，小分子抗体，噬菌体抗体；国产设备、新型材料、纳米微粒、分离技术、特异抗体、发光底物等的创新研究，在国家发展战略支持下标记免疫的核心技术正在取得积极进展。 

王自正教授

仲人前教授在报告中主要介绍了免疫标记技术概要和免疫标记技术应用两个方面。免疫标记技术得益于很多杰出科学家的相关发现，1890年Behring发现白喉抗毒素，是第一次发现真正的抗体原型。 1958年Edelman GM和Porter RR研究发现了免疫球蛋白的晶体结构，标记免疫学方法开始出现，知道结构和成分就可以用不同的方法标记了。1974年Tonegawa S发现免疫球蛋白基因。这几项发现在标记免疫技术的发展中具有重要意义。经典免疫学技术是非标记的，包括凝集反应、沉淀反应、溶血反应和免疫电泳；现代免疫学技术有些是从经典免疫学技术中发展而来，现代免疫学技术包括免疫比浊技术、免疫细胞技术、免疫标记技术。

在免疫标记技术应用方面，首先要了解各种方法学的鉴定要素，免疫标记技术的基本要素包括：抗原抗体亲和力；抗原抗体平衡常数；精密度（EP5）；正确度；检测线性范围（EP6）；灵敏度；特异性；结果可报告范围；生物参考区间（C28）；试剂稳定性。其次，不同检测方法灵敏度不一样，采用检测方法时要考虑物质在正常范围中的大致浓度，以便选择适当的方法检测，并不一定是灵敏度越高的方法检测效果越好。另外，在所有免疫学中几个环节的影响因素非常重要，包括非标记免疫和标记免疫都需要注意。免疫标记技术的影响因素包括：Cross-reaction（交叉反应），要考虑对于抗原采用的抗体是不是针对相应抗原表位的，不要与细菌、病毒发生交叉反应；Hook effect（钩状效应），要考虑由于抗原抗体等量情况下产生的免疫反应，考虑抗原抗体比例不合适而出现的不稳定现象；Carry-over（携带污染），注意仪器是否携带污染；HAMA（异嗜性抗体），考虑针对动物的抗体；Matrix effect（基质效应），注意由RF、溶血、脂血、黄疸、类风湿因子、药物等引起产生的基质效应，尤其注意类风湿因子。

免疫标记技术的临床应用，大致可分为八个方面，分别是：筛查、检测、诊断、分期、危险性分层、预后（Prognosis）、监测、复发。加上疫苗（vaccine）、药物（抗体药物）。现在对预测疾病也越来越关注。仲教授以胃癌、直结肠癌筛查、肝纤维化监测、肿瘤诊断、自身抗体危险性分层等以上方面的临床应用案例与大家分享交流。

目前，免疫标记技术也还面临一些挑战，比如：抗体异质性、抗原异质性、方法异质性；缺乏标准化（标准物质或参考物）、缺乏可比性（厂商标准之间）、缺乏统一性；不能正确认识疾病、不能正确解释结果、不能正确规范管理等。

仲人前教授

目前我国第一位的疾病死因是脑卒中。说到脑卒中人们首先想到的是高血压，从11项国际抗高血压RCT临床试验结果中显示高血压药物在中西方人群疗效中存在差异，在同样的治疗方案下使用降压药后中国高血压人群的脑卒中与心肌梗死发生比值远大于西方人群。免疫标记技术的应用可以在相当程度解释这种差异，这样的结果是中西方人种的差异、生活方式的差异，以及饮食营养的差异。降血压只能解决一部分中国人的脑卒中问题。

在同型半胱氨酸（Hcy）代谢通路中重要的一个环节是叶酸。Hcy会受到基因和叶酸的影响。MTHFR是Hcy通路中一种重要代谢酶，该酶活性的改变能显著性影响体内Hcy水平，特别在叶酸缺乏时，呈现异常高的Hcy水平。叶酸下降Hcy升高的基因突变就是MTHFR。同型半胱氨酸（Hcy）升高带来的危害有骨质疏松、静脉栓塞 、低体重儿、早产儿、心脏病、反复流产、老年性痴呆、新生儿缺陷、神经管缺陷等。我国高血压人群达75%，叶酸缺乏人口占20-60%，人均叶酸水平远低于美国人均水平，MTHFR TT基因型频率占25%，要有效控制H型高血压（即伴同型半胱氨酸（Hcy）升高/低叶酸水平的高血压）。

胡大一教授和徐希平教授共同发表的H型高血压 1.0版中提出对高危人群多重危险因素干预 。伴血浆同型半胱氨酸水平升高的H型高血压，脑卒中发生风险高于单纯高血压，同时降压降同型半胱氨酸预防脑卒中措施较单纯降压获益更大。75% 的中国高血压人群是H型高血压，需要结合中国国情制定我国脑卒中防治新策略。 2007年徐希平教授等在柳叶刀杂志第一次阐述了叶酸的补充能够降低脑卒中的风险。确认叶酸预防脑卒中有效，对心血管事件高危人群强化叶酸治疗，可使脑卒中事件显著获益。

经过对多地MTHFR基因C677T多态性与血浆同型半胱氨酸关联的研究发现，TT基因型高血压患者的同型半胱氨酸水平较CC/CT基因型高出近1倍。MTHFR基因C677T多态性对于ACEI降压疗效的影响，按降压疗效三等分后，分析基因型对舒张压降压疗效组间效应相对比值比，与舒张压降压效果最低组比，在TT基因型中疗效差异显著 ，疗效中间组相对比值比是2.6，疗效最高组相对比值比是2.6。

国家十二五新药创制专项重大项目中国脑卒中一级预防研究（CSPPT），在随机实验设计和结果分析方面为全世界脑卒中预防带来很多启示，包括基线叶酸水平和基因型 、选择卒中为研究主要终点和一级预防方面。CSPPT研究结论表明治疗141万高血压患者，可以比单纯降压治疗额外多减少1万脑卒中新发患者；H型高血压人群，“依叶”预防脑卒中的NNT=56，即如果用“依叶”治疗56万H型高血压患者，可以比单纯降压治疗额外多减少1万脑卒中新发患者。

徐希平教授

胃癌在相当长一段时间内仍是危害人类的主要恶性肿瘤，《中国早期胃癌筛查及内镜诊治共识意见》（2014年）指出我国40岁以上人群胃癌发生率显著上升，因此建议以40岁为胃癌筛查的起始年龄。筛查方法为血清胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)检测、胃泌素17(gastrin-17，G-17)、幽门螺旋杆菌抗体（H.Pylori  IgG）、内镜筛查。

胃癌的早期诊断，无疑是提高胃癌生存率的关键。临床研究发现，始发阶段的小胃癌、微小胃癌10年存活率可达100%；早期胃癌术后5年生存率为90%；进展期胃癌术后5年生存率低于30%（Ⅱ期为66%，III期为51%）；晚期胃癌仅为14%，末期胃癌患者术后5年生存率不足5%。

胃癌实验室的诊断指标分别是：胃蛋白酶原I/II--胃癌癌前病变、慢性萎缩性胃炎的标志物；胃泌素-17--胃癌标志物，慢性萎缩性胃窦炎的标志物；幽门螺旋杆菌IgG抗体--胃癌高风险的独立因子；糖类抗原CA724、CA50、CA199--消化道系统肿瘤标志物。报告中详细介绍了以下几项胃癌实验室的诊断指标：

胃蛋白酶原PG。根据胃蛋白酶原的生化和免疫化学特性分为：胃蛋白酶原I（PG I），由胃底腺的主细胞和颈粘液细胞所分泌；胃蛋白酶原II（PG II），由胃底腺，贲门腺，幽门腺，十二指肠腺所分泌，虽然PG II的浓度相对较低，但其分泌区域比PG I大。PGI/PGII的变化，胃蛋白酶原通常存在于消化道內，但是有1%会渗入血液中，胃蛋白酶原在pH﹤5.0时活化为胃蛋白酶（pepsin），发挥消化食物的生理作用。PGI是检测胃底腺细胞（分泌胃酸）功能的指针，胃酸分泌增多PGI升高；胃酸分泌减少或胃粘膜腺体萎缩PGI降低。PGII与胃底粘膜病变的相关性较大（相对于胃窦粘膜），其升高与胃底腺管萎缩、肠上皮化生或假幽门腺化生、异型增生有关。PGI/II比值进行性降低与胃粘膜萎缩进展相关。PG I浓度和PG I/II比值下降对于萎缩性胃炎具有提示作用。PG I/ II比值用于胃癌的风险分级。血清PG浓度可作为胃癌术后复发的灵敏指标。

胃泌素-17。胃泌素（Gastrin）主要由胃窦黏膜的G细胞分泌，直接进入血液循环。人体中有生物活性的胃泌素95％以上是α一酰胺化胃泌素，其中80％～90％是胃泌素17（G-17），5％～10％是胃泌素34（G-34）。胃泌素17与萎缩性胃炎的临床意义：（1）G-17 水平升高：老年萎缩性胃炎、胃癌、萎缩性胃体胃炎 、老年功能性消化不良、十二指肠球部溃疡；（2）G-17 水平下降：萎缩性胃窦胃炎、全胃多灶性萎缩；（3）G-17浓度变化可用于鉴别不同类型的萎缩性胃炎。G-17水平与萎缩部位相关，与对照组比较：在胃窦萎缩组，胃泌素17浓度明显降低；在胃体萎缩组，胃泌素17浓度明显增加；在合并胃窦和胃体的全胃多灶萎缩组中，胃泌素17浓度仍然会降低。血清G-17检测近年也应用于早期胃癌的筛查，胃泌素17在胃癌患者中显著升高。

幽门螺旋杆菌IgG抗体。幽门螺旋杆菌（ helicobacter pylori，HP）是一种革兰阴性杆菌，在胃上皮细胞定居繁殖，在健康人中有较高的感染率（35.5%-59.4%）。HP感染与多种消化道疾病相关，可引起胃炎、消化道溃疡、黏膜相关的淋巴细胞瘤，甚至导致胃癌。胃癌中幽门螺杆菌的阳性率高达90%。 

张小红博士

各指标联合检查。HP抗体作为胃癌筛查的重要指标，通常与PGI，PGII联合使用，可以大大提高胃癌检出的敏感度。胃癌患者单项检测中，HP抗体的敏感度最好，但特异性较差，PG特异性较好，但敏感性较低，三者联合检测敏感度81.6%，特异性75.8%。PG和HP的联合检测可对胃癌进行危险分级：越高危人群，需尽早期干预。胃泌素17和胃蛋白酶原联合检测，综合研发发现，虽然胃癌和萎缩性胃炎患者的PG水平均有不同程度的降低，但胃癌患者的水平更低，而两者的G-17的水平表现正好相反，《中国早期胃癌筛查及内镜诊治共同意见（2014）》建议联合检测血清G-17、PG I、PG I／PG II比值及HP抗体，以提高胃癌的早诊率 。