血源性病原体核酸检测临床应用与面临的难题
秦晓松，教授、医学博士、博士/博士后导师。现任中国医科大学附属盛京医院检验科主任，辽宁省医学检验临床医学研究中心主任。曾于日本德岛大学医学部留学、美国哈佛大学医学院、意大利圣·乔万尼医院（San Giovanni di Dio Hospital）进修学习。主要从事生化与分子生物学及抗感染免疫、疾病诊断标志物筛选、实验室质量管理等领域的研究。沈阳市高级人才，主持和参与了多项国家及省部级课题，获经费近500余万元。获辽宁省自然科学学术成果奖二等奖1项，发表论文60余篇,其中SCI收录22篇。主要学术兼职：中华医学会检验分会委员，辽宁省医学会检验分会副主任委员，辽宁省医师协会检验医师分会副会长，中国中华检验医学教育学院辽宁分院秘书长，中华医学会检验专业委员会临床免疫学组委员，中国医师协会检验医师分会甲状腺疾病专委会副主任委员，中国中西医结合学会检验医学专业委员会常务委员，中国医促会风湿免疫病学分会常务委员，中国分析测试协会标记免疫分析专业委员会常务委员，中国老年医学学会检验分会委员，中国微生物学会临床微生物学专业委员会委员，辽宁省免疫学会临床病原生物与免疫分会候任主任委员，辽宁省中西医结合学会检验医学专业委员会副主任委员，临床化学（中文版）编委。
血源性病原体指可以通过血液及血液之外的体液传播疾病的一些病原体，包括精液、阴道分泌物、羊水、关节腔积液等组织液可以进行疾病传播。污染病原体的血液输入或者种入患者体内会引起相应的感染或者疾病。众所周知，现在输血前要检测很多病原体，包括HBV、HCV、HIV、梅毒等，试剂审批的过程当中，筛查血源性病原体的试剂是按照药品管理的。血源性病原体感染疾病的传播途径主要是性接触、母婴垂直传播、血液传播等途径，易感人群主要包括吸毒人群、透析患者、护理，还有同性恋人群和免疫力低下人群，感染分类分为：一过性感染、隐匿性感染、显性感染，还有病原体携带状态、潜伏期感染等，潜伏性感染就是窗口期。
一、血源性病原体感染检测的概述
1. 血源性病原体感染的基本现状：从全球来讲，慢性乙肝感染者约2.4亿人，慢性丙型感染者超过了7,100万，艾滋感染者约3,800万。数据统计，2015年有88.7万人死于乙型肝炎，仅有10.5%的乙肝患者知道自己感染了乙肝病毒，2016年有近40万人死于丙型肝炎，仅有19%的丙肝患者知道自己感染，截止到2017年底，仅有500万人接受了丙肝药物治疗。2018年有77万人死于艾滋相关疾病，16%的艾滋患者不知道自己感染了艾滋病毒。我国血源性传染病的感染现状也不乐观，我国乙型肝炎的感染者约8,600万，诊断率不足20%，丙型肝炎感染者约1,000万，诊断率只有17.7%，治疗率1.3%，HIV感染也有将近71万的感染者。WHO制定了2030年消灭肝炎危害的目标，到2030年新发慢乙肝和丙肝减少90%，乙肝和丙肝的死亡率降到65%，慢乙肝和丙肝的治疗要覆盖80%的患者，所以距离目标还相距很远，所以如何开展临床传染病的机会检查，使更多的感染者知道自己感染了血源性传染病，是实现目标的关键的第一步。近年来院内感染的事件频发，经常见诸于各种媒体，大多数最终都是由医院承担了相应的责任和赔偿。
2. 采供血机构血液筛查的发展历程：2010年前，采供血机构一般进行乙肝表面抗原（HBsAg）、丙肝抗体（抗HCV）和艾滋抗体（抗HIV）的ELISA联合检测，2010-2015年，国家全面开始推进血站核酸扩增检测技术（NAT）工作实施，到2015年，基本实现了核酸检测技术在采供血系统的全覆盖。现在献血者已经实现了三重筛查，采血点进行初筛+两遍ELISA检查+一遍核酸检测，可以追踪到每一袋血液都可以溯源到献血者，每一袋血液也可以购买保险，在受血者一端也进行了血源性病原体的ELISA或者化学发光法的筛查。所以在血液的供应链条中，一旦发生用血安全的纠纷，采供血机构可以做到溯源，而且采用多重的筛查方法使用血安全能够得到有效的保障。临床中受血者现在大多数用免疫学的方法进行筛查，所以输血后一旦出现血源性传染病的问题，可能比较难追溯到底是什么原因，会出现一些举证困难的情况。
3. 医疗机构血源性传染病的筛查发展历程：2000年，《临床输血技术规范》规定，准备输血的术前患者应该进行传染病检测，2005年到2009年，逐渐有更多的法律法规用于医疗机构，包括《中华人民共和国传染病的防治法》、《卫生部关于印发8个病种临床路径的通知》，指出医疗机构应该开展传染病的病原体检测，2015年采供血机构全面应用核酸检测。核酸筛查技术在近年来尤其是采供血机构全面采用了核酸检测之后，在医疗机构对于核酸筛查血源性病原体得到了越来越多的专家推荐，《中华人民共和国传染病防治法实施办法》、卫健委颁布《医疗机构传染病预检分诊管理办法》均对医院内感染性病原体检测提出明确要求，要防止传染病的医源性感染和医院感染，《医疗机构传染病预检分诊管理办法》提到，医疗机构应实行传染病预检、分诊制度，对传染病病人、疑似传染病病人，应当引导至相对隔离的分诊点进行初诊，医疗机构不具备相应救治能力的，应该将患者及其病历记录复印件一并转至具有相应救治能力的医疗机构。《临床用血技术规范（2000版）》、《临床用血技术规范（2020版）征求意见稿》都提到术前/输血前患者必须进行感染性疾病筛查，但没有规定方法学，医院大多采用酶免和发光进行筛查，核酸检测现在越来越普遍，这是检测方法大的趋势。对术前和输血患者进行病原体检测，不仅是对感染性疾病预检、分诊制度的要求，还可以有效的避免患者的交叉感染、降低医生职业感染风险、尽早发现并治疗感染者以提供更早的治疗，控制感染传播。
二、血源性病原体感染疾病检测面临的难题
1. 乙型肝炎检测面临的难题：乙肝常规检测方法为免疫学的方法，免疫学检测受窗口期、隐匿性HBV感染（病毒载量比较低）、抗原抗体复合物的形成等因素导致HBsAg无法检出，来自斯洛文尼亚的研究，发现有三名乙肝抗原阴性的患者，通过病毒核酸检测HBV DNA阴性的献血者，感染了9名输血者，所以需要更加敏感、更加低剂量的检出限，推测HBV最低感染剂量从之前预测的20IU/ml降低至3IU/ml。隐匿性乙肝感染（OBI）的定义是在现有检测条件下，血液中不可检测出HBsAg，但肝组织中存在有复制能力的HBV DNA，对应血液当中的HBV DNA阳性（通常小于200IU/ml）。参考卫健委临检中心王露楠老师的课件，在998份献血者样本中，70%的HBV DNA载量低于20IU/ml，90%的载量低于50IU/ml，这些隐匿性乙肝感染的人群的HPV DNA载量非常低，如果这些人去献血，会带来很高的风险。还有研究发现，尽管现在婴儿普遍接种乙肝疫苗，显著降低了儿童新发的HBV感染，但大多数已经感染了HBV的成年人中感染率仍保持稳定。
HBV DNA筛查的必要性，在《慢性乙型肝炎防治指南（2019版）》提到很重要的一点，这就是切断传播途径。大力推广安全注射（包括取血针和针灸针等针具），并严格遵循医院感染管理中的标准预防（slandard procaution）原则。服务行业所用的理发、刮脸、修脚、穿刺和纹身等器具应严格消毒，若性伴侣为HBsAg阳性者，应接种乙型肝炎疫苗或采用安全套。还提到乙肝感染者的传染性高低主要取决于HBV DNA的水平，这与血清ALT、AST和胆红素的水平无关，所以更应该关注血液当中HBV DNA的水平。在临床上检测当中，HBV DNA试剂检测下限为10-20IU/ml，由于HBV DNA通常以低浓度形式存在，且只能在OBI患者中被间断检测到,所以建议在多个时间点采集血液样本进行检测。为防止HBV通过输血传播,应采用高灵度核酸扩增技术（NAT）。从指南中归纳出几点：（1）发现传染源、控制传染源，才能真正切断传播途径；（2）HBV感染者的传染性高低取决于血液中HBV DNA水平；（3）为防止HBV通过输血传播，应采用高灵敏度核酸扩增技术。
2. 丙型肝炎检测面临的难题：尽管我国HCV流行率不高，但由于人口基数大，仍占HCV感染病例的首位，所以关键点是怎样将感染丙肝的人及时诊断出来。WHO提出2030年消灭丙肝全球战略目标，到2030年，90%的丙肝感染者得到诊断，80%符合治疗的患者能够得到治疗，新发丙肝感染率降低90%，感染相关死亡减少65%，根据WHO资料显示的HCV感染管理情况，现阶段丙型肝炎病毒感染人群中仅有20%得到确诊，治疗比例不足2%，距离2030年的目标有很大的差距，未来怎么提高丙肝患者的知晓率，我们需要提高筛查率、提高诊断率、提高治疗率。
根据我国疾控中心（CDC）数据，每年上报的丙肝患者数量在20万左右，即使这些患者全部得到DAA治疗并治愈，也仅占总数的2%，还有大量的丙肝感染者没有得到诊断。一项研究显示，467,008名非肝病相关科室病人，总体抗HCV阳性率0.88%抗体阳性患者中，90.14%为40及40岁以上，研究强调了对住院患者常规检查丙型肝炎病毒的重要作用，进一步针对40岁及以上住院病人重点筛查的策略，将有助于找到缺失的数以百万计的病人，加快中国消除丙肝病毒的步伐。在检测的过程中，核酸检测的窗口期平均为12天，抗体检测的窗口期平均为70天（现阶段时间有一定的缩短），丙肝号称“沉默的杀手”，大部分人没有明显症状，发现时已经出现肝硬化与肝癌，只有大规模筛查出潜在丙肝患者，才能消除丙肝危害。丙肝检测面临的难题还有，对干细胞移植、肿瘤化疗、HIV感染者等患者，存在不同程度的免疫缺陷，感染不容易产生HCV抗体，这些特殊人群，即使抗体“弱阳性”，也不能忽略，后续应该进一步采用核酸检测的手段进行检查。另外丙肝的抗病毒治疗越来越多，导致了血清学的弱阳性样本也越来越多，对于血清学低值的阳性样本如何判读？这都是我们面临的问题，还有免疫缺陷或者使用免疫制剂的人群，血清学方法筛查作用较小，所以提出了HCV RNA筛查的必要性。
3. HCV RNA筛查的必要性：《消除丙型肝炎公共卫生危害行动工作方案（2021-2023年）》提出行动目标，二级及以上综合医院、传染病专科医院、各级疾控机构100%具备丙肝抗体和核酸检测能力，全市临床用血丙肝病毒核酸检测率达100%，医疗机构安全注射比例达100%，注射吸毒人群干预措施覆盖比例达80%以上。到2030年，新报告抗体阳性者的核酸检测率达95%，符合治疗条件的慢性丙肝患者的抗病毒治疗率达80%以上，专业人员接受丙肝相关内容培训比例达100%。治疗终点定义为抗病毒治疗结束后12或24周，采用敏感检测方法（检测下限≤15IU/ml）检测血清或血浆HCV RNA检测不到（SVR12或24）。
4. 艾滋检测面临的难题：艾滋的检测同样也面临着常规的免疫学方法窗口期比较长的问题。检测艾滋试剂从一代、二代、三代到现在四代，窗口期逐渐的缩短，已经取得了长足的发展。从病毒感染人体的规律，RNA出现先于后续的抗原或抗体，仍然是首先能够被检测到的一个证据。在感染早期，艾滋急性期往往会出现血清学的假阴性，对于初筛实验室大部分采用的免疫印记法进行确认，在实际的工作中，“HIV抗体不确定”报告达4-20%，后续还需要一些动态观察或者核酸的进一步补充试验。在感染流行病学当中发现HIV-2型的感染病例已经在我国存在，因此必须引起医学界对我国HIV-2型的流行状况诊治和防控措施足够的重视，并对此进行深入的研究。
5. HIV RNA筛查的必要性：《全国艾滋病检测技术规范（2020年修订版）》对上一版本检测技术做了一些更新，核酸检测的意义：修改为核酸检测可用于HIV感染诊断、血液筛查、病情病程评估及抗病毒治疗效果监测；感染诊断：调整补充完善为核酸检测作为一个补充试验，急性期诊断和HIV-1暴露婴儿感染的早期诊断，同时增加了血液筛查部分；HIV核酸检测实验室的要求：实验室人员和要求培训改为市级以上培训。HIV-1/2抗原/抗体联合筛查在常规实验室的筛查和确认的途径为，如果抗原抗体联合检测为阳性结果，要进一步用HIV-1/HIV-2抗体鉴别试验（快速试剂），有任何一个阳性，都需要报相应的抗体检出；如果在二步检测发现了不确定的结果，下一步就需要进行核酸检测，HIV-1的核酸检测，一旦核酸检测为阳性，就可以判定为急性的HIV感染。从检测路径上，包括美国CDC也推荐核酸检测试剂对于那些初始检测有反应，但是进行第二步检测没有反应或者不确定的标本，核酸检测是一个确证的手段。
三、血源性病原体核酸检测技术优势
首先窗口期短，研究数据显示，应用核酸检测技术能显著缩短病毒检测窗口期，HBV、HCV、HIV的检测“窗口期”分别缩短41%、83%和50%。虽然是10年前的研究，但也能看出，检出窗口期明显缩短，窗口期越短，便于越早发现病原体，越早控制传染源；另一个优势是可以区分既往感染和现状感染，以丙肝抗体和核酸检测为例，核酸检测为阳性，无论抗体阳性还是阴性，都可以诊断为现状感染或者早期感染，可以避免那些免疫功能低下患者或者感染早期单独抗体检测的漏检。所以血清HCV RNA阳性是实验室诊断HCV感染的金标准；对于灰区或者低值阳性样本的复测，免疫学方法会存在“灰区”及低值阳性样本，核酸检测可以更好地给临床医生提示与指导，有效减少假阳性率和漏诊率；可以提高隐匿性肝炎的检出率，隐匿性乙肝感染可以促进HCV感染者肝硬化和肝癌的发展，这两种病毒可能相互作用，所以对于丙肝-乙肝、丙肝-艾滋合并感染，通过核酸检测便于提高低值的隐匿性感染的病人的检出。血源性病原体核酸检测的技术优势在于：（1）窗口期短，越早发现，越早控制传染源；（2）能区分既往感染与现状感染；（3）“灰值”及低值阳性样本的复测；（4）不受免疫静默、Hook效应、病毒株突变等因素影响；（5）提高隐匿性乙肝感染（OBI）检出率，发现合并感染。
四、血源性病原体核酸检测的临床应用
在研究文献《核酸扩增与化学发光技术在临床输血和手术前感染三项联合检测中的临床意义》得出结论，核酸检测和免疫检测联合应用可以降低漏检风险，提高用血的安全，免疫和核酸检查结合起来实现了技术互补的目的。根据临床应用目的的不同，核酸检测的定位也不同，有以下几种：（1）筛查试验：用于筛查的定性试验必须具有高敏感性以确保感染的病原体被检出，筛查试验可能产生更多的假阳性结果，通常筛查试验的低特异性可通过特异性较好的确认试验加以弥补；（2）诊断试验：用于临床某种特定疾病或状况是否存在的诊断，临床上要求对患者疾病进行及时合理的处理，诊断试验需具有良好的敏感性和特异性，如需进行确认试验，对诊断试验的特异性要求可以稍微降低；（3）确认试验：用于验证筛查试验或者诊断试验结果，如果确认试验证实了之前的检测结果，临床医生即可依其做出诊断；（4）治疗监测：标志物“有”或“无”，定量或半定量检测标志物的变化。所以临床应用目的不一样，选择试验的特点也不一样，对于筛查试验，要求一个高敏感性。
现在各种的团体标准对核酸检测有越来越多的推荐，例如，全国卫生产业企业管理协会2019年推出的团标《医疗机构中乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、I型人类免疫缺陷病毒核酸三联检测应用规范》中，推荐接受门诊处置、住院治疗的患者以及有感染HBV、HCV、HIV风险的人群应进行核酸检测，对于接受手术、血液透析的患者、准备输血或者使用血液制品的患者、肝功能异常、不明原因发热、HIV指征性疾病、免疫功能低下者、有感染HBV、HCV、HIV风险的高危人群，强烈推荐进行核酸检测。
1. HCV核酸检测对透析患者的意义：在一些医疗机构血液透析感染事件频发中也凸显了传染病核酸筛查的重要性。《血液净化标准操作规程》明确指出，首次开展血液透析的患者、由其它血液透析室（中心）转入或近期接受血液制品治疗的患者必须在透析治疗前进行乙肝、丙肝、梅毒和艾滋的标志物的检测，推荐同时核酸检测，抗原、核酸阳性，进入隔离治疗区进行透析，如果指标都为阴性，就可以解除在隔离区进行血液透析治疗。所以对于血液透析的高危人群，非常有必要进行高灵敏度的核酸筛查。国家卫生健康委员会办公厅发布的《关于印发丙型肝炎病毒（HCV-RNA）检测结果转阴患者血液透析管理方案的通知》提到，在抗病毒治疗结束后12周和24周，用高灵敏的试剂检测HCV-RNA低于下限值（＜15IU/ml），为持续病毒学应答，即达到治愈标准；自HCV-RNA检测结果首次转阴后起6个月，患者继续在隔离透析区透析；检测HCV-RNA阴性持续达到6个月以上，可安置于非隔离区透析；为监测再次感染丙肝病毒，由隔离区到非隔离区的患者应当每6个月检测一次HCV-RNA。
2. HBV/HIV核酸筛查在母婴阻断中的重要性：《国家卫生健康委办公厅关于印发预防艾滋病、梅毒和乙肝母婴传播工作规范（2020年版）的通知》针对于临产期孕妇、病毒感染高危风险孕妇及所生婴幼儿等人群，同时针对早期感染、急性感染早期、孕妇临产期疾病终末期出现抗HIV不确定性反应等情况，HBV/HIV核酸检测是目前最敏感、最可靠的检测手段。也提出到2025年底，孕产妇的艾滋病、梅毒、乙肝检测率应该达到95%以上，尤其强调在孕期和孕早期检测更为必要。
3. 移植/肿瘤/免疫力低下患者传染病核酸筛查的重要性：《人体器官移植技术临床应用管理暂行办法》提到，医疗机构对需要移植的器官应当进行必要的检查，防止患者因器官移植感染其它疾病，保证供移植的器官的有效利用，艾滋病病毒感染者或者艾滋病患者、肝炎病毒携带者、梅毒患者等患有经血液传播疾病者的器官不得用于器官移植。《2018年英国移植学会之型肝炎与实体器官移指南（第1版）》摘译中指出，任一抗-HBc阳性HBsAg阴性（既往感染）的潜在移受者必须进行HBV DNA和HDV血清学检查，以除外隐匿性HBV或HDV感染；任一抗-HBc阳性但HBsAg阴性（既往HBV暴露史）的器官捐献者必须检测HBV DNA，以除外隐匿性HBV感染的可能。一旦有隐匿性感染，患者经过了器官移植之后，由于要进行免疫抑制剂的治疗，容易引起隐匿感染的再激活，引起肝炎爆发，很容易死于肝衰竭。
所以，现在越来越多的专家共识推荐有条件的医疗机构开展传染病的核酸筛查，包括丙肝、乙肝、丙肝、艾滋的核酸检测。推荐的人群包括：输血前患者，尤其是频繁接受输血治疗的患者；术前患者和接受侵入性检查及治疗的患者；血液透析患者；器官移供、受者；不明原因发热者；免疫功能低下者；抗肿瘤治疗期间患者；有相关流行病学特征的高危患者或其他有必要做病原体筛查的人群。
4. 开展血源性病原体核酸筛查的意义：（1）可有效避免患者的交叉感染，能够及时发现感染患者；（2）降低医务工作者职业暴露风险；（3）避免医疗纠纷的产生，明确患者的感染状态；（4）能够及早发现感染者，同时可及时治疗并控制感染传播。
5. 血源性病原体核酸筛查可行性分析：在新冠疫情期间，我国二级以上的机构已经建起了PCR实验室，分子诊断技术得到了长足的发展，核酸检测技术越来越普及，自动化程度越来越高，而且核酸检测成本日益降低，所以，从目前来看，各级医疗机构开展核酸检测的时机越来越成熟。
