D-二聚体量子点荧光免疫层析检测法的方法学评价
许予馨，主管技师。现任职于中国医学科学院阜外医院深圳医院检验科。兼任深圳市医院协会检验医学分会临床化学与质谱学组委员；白求恩精神研究会检验医学分会特区检验专业学组委员；深圳市医学会宏基因组测序应用专家联盟特聘专家。专业研究方向有质谱检验、分子诊断和检验新技术新方法。
D-二聚体（D-dimer，DD）来源于纤溶酶溶解的交联纤维蛋白的降解产物, D-二聚体水平升高说明体内存在高凝状态和继发性的纤维蛋白溶解亢进，其血浆中的水平反应了凝血和纤溶系统的激活情况, 可以作为体内血栓形成的指标之一[1]。D-二聚体水平的检测方法有多种, 乳胶凝集法、酶联免疫吸附试验、荧光抗体检测法、免疫金标法。近来,金准生物公司提供了可以自动化检测的生物量子点荧光免疫。本研究应用生物量子点荧光免疫KF-Q001-A检测系统, 评价量子点免疫荧光层析法检测D-二聚体水平的精密度、正确度、线性范围、参考区间，对实验系统的检测性能进行验证，以评价实验系统的临床应用性能及有效性。
一、材料与方法
1. 检测对象：标本均来自2019年5月-2020年5月本院的门诊和住院患者。
2. 仪器与试剂：Sysmex CS 5100检测系统（参比系统），深圳金准生物量子点荧光免疫KF-Q001-A检测系统（实验系统）以及相对应配套的D-二聚体试剂盒、校准品、质控品。
3. 检测方法：试验方法均严格参照EP15-A2医学实验室精密度和准确度的确认、WS/T 409-2013临床检测方法总分析误差的确定、WS/T 406-2012临床血液学检验常规项目分析质量要求、WS/T 408-2012临床化学设备线性评价指南[2-5]。
批内精密度是使用医学决定水平附近的2个临床样本，使用同一个检测系统（包括实验室、检测仪器、检测方法、试剂、操作人员）在尽可能短的时间内重复测定该样本20次。批间精密度的评价是使用医学决定水平附近和异常值的2个样本，使用同一个检测系统在不同的时间内分批次测定同一个样本，要求每天每个样本测4次，连续测定5天，共40次。正确度验证是选择40个临床病人的血清样本，按实验室的编号顺序编号，每天测定8个临床样本，连续测定5天。线性范围验证是选取2个临床样本，浓度应为（或接近）被评价方法的下限以及上限，低、高值样本分别标记为L、H，以此为母本作稀释：按5L、4L＋1H、3L＋2H、2L＋3H、1L＋4H、5H的体积比混合成6个不同浓度的样品，每个浓度的样品重复检测2次取其均值。参考区间的验证是任意取20个体检样本，测试是否超出试剂参考范围，未超出参考范围比例≥95%为可接受。
4. 统计学处理：实验数据收集完成后录入excel表格，采用SPSS 25.0进行统计分析。精密度计算均值x、标准差s、变异系数CV；正确度的计算需先剔除方法间离群值，然后进行回归分析： 医学决定水平处的最大系统误差（SE）小于1/2允许误差时，认为两方法间的结果具有可比性。线性范围的验证先以预期值为X，测定均值为Y，依据回归方程Y＝bx+a计算两组数据间的相关性，若相关系数r2≥0.95，a在0.97～1.03范围内，a与0无统计学差异，则结果判断为可接受；参考区间的验证是所测量值未超出参考范围比例为95%，则认为满足标准，参考范围验证通过。
二、研究结果
1. 精密度评价：在0.362mg/L浓度水平时，批内精密度s为0.027mg/L，CV为7.48%；在8.17mg/L浓度水平时，批内精密度s为0.2857mg/L，CV为3.50%；在0.235mg/l浓度水平时，批间精密度s为0.0196，CV为8.34%；在6.226mg/l浓度水平时，批间精密度s为0.3489，CV为5.60%，见表1。
2. 正确度评价：对试验系统KF-Q001-A检测系统与对比系统Sysmex CS 5100检测系统进行40例样本对比研究。以金准KF-Q001-A检测结果为Y轴，对比系统Sysmex CS 5100检测结果为X轴，进行回归分析（金准KF-Q001-A试剂检测范围为0.01-10mg/L，剔除超过此范围的标本后进行分析），通过线性回归分析后斜率a=1.0413，截距b=-0.025，线性相关系数r=0.9877，结果如图1；对其cut off值处的预期偏倚进行计算，由于该项目在对比上具有1个医学决定水平，为0.5mg/L。故在参考值处进行偏倚分析，在医学决定水平预期值偏倚为0.94%。偏倚分析结果为：参考值0.5，预期值为0.4953，偏倚0.94%。
图1. 回归分析结果
3. 线性范围验证：分别将2个样本用生理盐水混合成6个不同浓度的样品，每个浓度的样品重复检测2次取其均值，以预期值为X，测定均值为Y，依据回归方程Y＝bx+a计算两组数据间的相关性，直线方程为y=1.0024x-0.134，R2=0.999，结果如表2，图2。
图2. 线性分析结果
4. 参考区间验证：任意取的20份健康体检者的血清样本检测结果均在参考范围之内。
三、分析与讨论
D-二聚体（D-dimer）是凝血过程中纤溶系统产生的交联纤维蛋白的特异性降解产物，D-二聚体可以作为体内高凝状态和纤维蛋白溶解亢进的标志物[6]。它是继发性纤溶特有的代谢物，是目前鉴别原发性和继发性纤溶酶溶解以及监测纤溶酶溶解治疗等方面的重要指标[7]。D-二聚体检测以实时、便捷、敏感、特异为特点，具有高度的敏感性和阴性预示能力，对静脉血栓栓塞症（VTE) 和 弥散性血管内凝血（DIC）的诊断及溶栓治疗监测有重要的意义。因此对D-二聚体的检测结果准确度和灵敏度要求较高[8]。
量子点（Quantum dots，QDs），属于半导体纳米微晶粒，具有优良的光谱特征和光化学稳定性。与生物荧光染料相比，其激发谱为连续谱带，用高于带隙能量的光均可以激发，且发射谱较窄，光稳定高，发射荧光可调,十分适合作为荧光标记物。 其作为一种新型的免疫标记手段，其简单方便，兼具较高的灵敏度、特异度、反应时间短、检测设备小以及可床旁检测等优势，但仍存在无法溯源等不足，随着技术的不断成熟这种技术将有着良好的发展前景[9-11]。
本研究精密度评价结果在0.362mg/L浓度水平时，批内精密度s为0.0271mg/L，CV为7.48%；在8.17mg/L浓度水平时，批内精密度s为0.2857mg/L，CV为3.50%；在0.235mg/l浓度水平时，批间精密度s为0.0196，CV为8.34%；在6.226mg/l浓度水平时，批间精密度s为0.3489，CV为5.60%，厂家声明中批间和批内变异系数（CV）小于15%，验证结果符合厂家说明，同时精密度也符合临床检验中心室间比对允许总误差为30%，重复性CV小于1/4允许总误差，期间精密度小于1/3允许总误差的要求。正确度验证参照《全国对比检验操作规程》（第4版），排除溶血、黄疸、脂血及污染标本后实验系统与参比系统的检测结果具有统计学上相关性，在参考值处进行偏倚分析，在医学决定水平预期值偏倚低于15%，认为两方法间的结果具有可比性。分析测量范围评价结果在厂家声明的整个线性范围内结果呈线性且理论值与测量值偏差都小于可接受标准。选取的20例健康个体的血清标本其D-二聚体检测结果均未超出参考范围比例为95%，满足标准，参考范围验证通过。
综上所述，对D-二聚体试剂盒进行临床诊断性能比较研究，两者诊断一致性良好，相关度高，能满足临床诊断的需要。
参考文献
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WS/T 409-2013 临床检测方法总分析误差的确定[S]. CLSI, 2013.
WS/T 406-2012 临床血液学检验常规项目分析质量要求[S]. CLSI, 2012.
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