两种血红蛋白参考方法性能评价与比较研究

【摘要】目的 研究血红蛋白（Hb）测定参考方法，为Hb产品量值溯源提供保障。方法 按照JCTLM列表推荐的汉诺威医学院（RfB）参考方法和国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐参考方法的要求，建立Hb参考方法，通过测定有证标准物质验证测量系统的准确性，通过测定高中低样本，进行Hb测定精密度研究，通过能力验证实验进行正确度和一致性研究，通过方法比对进行量值传递研究。结果 ICSH参考方法变异系数变化范围0.0%～0.5％，RfB参考方法变异系数变化范围0.2%～0.3％，参考物质测定结果|En|≤1，能力验证活动，两种参考方法测定结果都在等效限（±1.5%）范围内，常规检测系统溯源到参考方法后，参考系统和常规系统同时测定多例新鲜临床样本的线性相关系数r≥0.999，斜率在1.00±0.02范围内。结论 RfB参考方法更容易控制精密度和准确度，操作更稳定，常规检测系统溯源到参考方法后，进一步证明与参考方法测定结果一致。

【关键词】血红蛋白；参考方法；量值溯源

血红蛋白（Hb）是临床血常规检测的常用指标[1]，为了保证检测结果的准确性，需要将血红蛋白检测结果溯源到相应的标准，目前血红蛋白可溯源的标准有推荐参考方法，比如国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐的参考方法[2]和JCTLM列表推荐的汉诺威医学院（RfB）参考方法[3]，ICSH推荐的参考方法已转化为我国卫生行业标准WS/T 341-2011《血红蛋白测定参考方法》[4]，前处理方式为体积定容，放置5min后用0.22µm滤膜过滤，操作过程需要较高的体积准确度以及过滤膜质量，对人员操作要求较高。RfB推荐的参考方法，前处理过程为称重，放置90min-24h后离心，可减少因人员操作和处理过程的影响。本实验室建立了ICSH和RfB血红蛋白测定的两种参考方法，比较了两种参考方法的优缺点。为了验证参考方法用于产品溯源的可行性，对血红蛋白测定参考方法的性能进行了评价，并应用到产品的量值溯源。

一、材料与方法

1. 仪器与试剂：（1）UV-3900H分光光度计和原装比色杯（日本日立公司）；（2）A级棕色硼硅酸盐容量瓶（25ml，BRAND公司）；（3）外置活塞式移液器（100μl，Gilson）；（4）血液分析仪（迈克生物股份有限公司）；（5）氰化高铁血红蛋白试剂（即文-齐氏浓缩液）购自天津现代高科技研究院中山研究所，使用前根据说明书按比例稀释；（6）Hb参考物质购自欧洲参考物质与测量研究所（Institute of Reference Materials and Measurement，IRMM），标准号、Hb浓度和扩展不确定度（k=2）：BCR-522[（800.3±1.3）mg/L]。新鲜血液样本；（7）一次性无菌滤膜（孔径0.22μm）为亚速旺公司产品；（8）一次性无菌注射器（2ml，1ml）购自成都事丰医疗器械有限公司；（9）生理盐水购自科伦药业；（10）低纤维干纸巾为金佰利产品；（11）避光锡箔纸为屋田科技产品。

2. 方法：按照ICSH和RfB推荐的参考方法进行相关实验。两种参考方法差异见表1。

表1. 参考方法差异比较

3. 重复性精密度实验：因新鲜全血样本须在短时间内测完，故本研究设计了重复性精密度实验，取高中低3个样本，ICSH参考方法，每个样本分别制备2份251倍稀释待测样本，每份待测样本在UV-3900H分光光度计上测定3次，计算6次稀释样本测定结果均值（x）、标准差（s）和变异系数（coefficient of variation，CV），结果应符合参考方法规定的CV≤0.5%的要求。RfB参考方法，每个样本制备4个稀释待测样本，保证每个稀释待测样本的吸光度在0.9±0.5范围内，每个稀释待测样本在UV-3900H分光光度计上测定3次，计算12次测定结果的均值（x）、标准差（s）和变异系数（CV），结果应符合参考方法规定的CV≤0.5%的要求[5]。

（1）正确度实验：测定有证参考物质BCR-522，测量值和参考物质证书上标示的靶值进行比较，要求|En|≤1[6]。

（2）能力验证实验：参加国际临床化学联合会（IFCC）组织的能力验证实验（RELA）和国内参考测量实验室能力验证活动，测定结果与其他实验室结果进行比较，结果应在规定的等效限范围内（等效限：±1.5%[7]）。国内能力验证活动主要由国家卫健委临床检验中心（NCCL）和上海临床检验中心（SCCL）组织。

（3）产品溯源应用：用参考方法给新鲜全血样本定值，用定值的样本校准常规血液分析仪，然后用参考方法和常规血液分析仪测试多例新鲜全血样本，进行回归分析，检验常规系统溯源到参考方法后，在临床样本检测时与参考方法测量结果是否一致。

二、研究结果

1. 重复性精密度实验：3个样本的精密度实验结果，ICSH参考方法CV为0.0～0.5%，RfB参考方法CV为0.2～0.3%，均符合Hb参考方法规定的≤0.5%的要求。结果见表2。

表2. 精密度实验结果

2. 正确度实验结果：测定有证标准物质BCR-522，测定结果满足|En|≤1的要求，结果见表3。

表3. 有证标准物质测定结果

3. 能力验证结果：参加IFCC组织的能力验证实验（RELA）和国内参考测量实验室能力验证活动，结果在等效限范围内（等效限：±1.5%），符合要求。IFCC和SCCL组织的能力验证活动，靶值为：剔除在等效限外的结果，其他所有结果的均值为靶值。结果见表4。

表4. 能力验证结果

4. 产品溯源应用：常规血液分析仪测定系统溯源到参考方法后，与参考方法同时测定多例新鲜临床样本，经过线性回归分析，线性相关系数r≥0.999，斜率在1.00±0.02范围内，结果一致性很好，符合《全国临床检验操作规程》第4版上规定的Hb正确度偏倚≤±2.7%的要求[8]，达到了溯源目的，结果见图1.

图1. 常规血液分析仪与参考方法测定结果比较

三、讨论与分析

血红蛋白是血常规检测中很重要的一项，其检测结果的准确性直接关系到患者病情的诊断[9]，国际上目前推荐血红蛋白参考方法的机构有两家（RfB和ICSH），都是基于紫外可见分光光度法，两个机构推荐的Hb参考方法只是前处理方式不同，RfB参考方法是称重法，ICSH参考方法是体积法，各有优缺点。

本研究显示，U3900-H分光光度计测定国际参考物质BCR-522，测定偏差比较小，参加国际国内能力验证活动，两种参考方法检测结果都在±1.5%的控制限范围内，这说明用HiCN分光光度法进行Hb参考方法实验研究的准确度符合要求；测定高中低全血样本，两种参考方法的重复性精密度≤0.5%，但实验过程中发现ICSH参考方法对人员操作要求比较高，取样的一致性直接影响平行样本间的精密度，但RfB参考方法基本不存在取样一致性方面的影响；对于溯源体系的建立，血红蛋白两种参考方法建立所需的材料，在实验室都是比较容易实现的，对于ICSH参考方法，主要控制的关键点为移液的体积，只要保证移液器体积准确，且移液时吸头外表面擦拭干净，不残留样本，多次重复移液时一致性很好，就能获得很好的精准度，RfB参考方法控制的关键点为每次取样加入瓶中时，保证样本和稀释液能完全充分的反应，且样本的密度也要准确对应，才能得到准确的结果。本研究中发现两种参考方法都有各自比较难控制的关键点，ICSH参考方法关键点为取样体积，RfB参考方法关键点为样本密度，但目前市面上也有测定密度的仪器，比较容易解决这个问题。从经验分析，应用称重法的RfB参考方法更好实施，过程更容易控制质量。

由于血红蛋白检测的样本为新鲜全血，新鲜血只能稳定数小时[10]，样本的新鲜程度、人员操作、环境温湿度控制、样本的采集和保存、样本采集后多长时间内测完、仪器设备的控制等都会影响检测结果的准确性，故要实现血红蛋白检测的量值溯源，是一项比较复杂的工作[10]，需要有一定经验的人员才能完成。本实验室已建立血红蛋白检测的溯源体系，可以使血红蛋白检测项目可以溯源到参考方法，对实现该项目检测结果的一致化和结果互认具有重要意义。

本实验室的量值溯源工作主要依据ISO17511：2020标准文件[11]实施，量值溯源质量控制是一项需要持续维持和不断提升的工作，对于本研究中的一些问题，还在进一步探索中，比如加样体积准确度的深入研究、密度测试研究、参加国际国内能力验证活动等，期待通过与同行业专家的交流和不断的经验积累，把血常规的标准化工作做得更好[5]。

参考文献

彭明婷, 谷小林, 陆红, 等. 我国血细胞分析参考系统的建立[J]. 中华检验医学杂志, 2006, 29(3): 196-198.

ZWART A, VAN ASSENDELFT O W, BULL BS, et al. Recommendations for reference method for haemoglobinometry in human blood (ICSH standard 1995) and specifications for international haemiglobinocyanide standard(4th edition) [J]. J Clin Pathol, 1996, 49(4): 271-274.

Denis Grote-Koska, Rainer Klauke, Patricia Kaiser, et al. Total haemoglobin-a reference measuring system for improvement of standardization[J]. Clin Chem Lab Med 2020; aop.

WS/T 341: 2011 血红蛋白测定参考方法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2011.

许 蕾, 王 青, 诸佩超, 等. 血红蛋白测定参考方法实验初探[J]. 检验医学, 2017, 32(8): 709-712

中国合格评定国家认可委员会. CNAS-GL002: 2018 能力验证结果的统计处理和能力评价指南[S]. 北京: 中国合格评定国家认可委员会, 2018.

The International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine(IFCC). RELA-IFCC External Quality assessment scheme for Reference Laboratories in Laboratory Medicine. http://dgkl-rfb.de:81/4Daction/g_search_RELA/RELA2022，2024-02-23.

尚红, 王毓三, 申子瑜. 全国临床检验操作规程[M]. 4版. 北京: 人民卫生出版社, 2015: 1015

彭明婷, 申子瑜. 血细胞分析溯源体系的建立及有关问题的探讨[J]. 中华检验医学, 2004, 27(3): 132-133

康 娟, 王会如, 孙京昇, 等. 以血细胞分析为例浅谈医学参考测量实验室的建立[J]. 检验医学, 2018, 33(2): 177-181

ISO 17511: 2020. In vitro diagnostic medical devices-Requirements for establishing metrological traceability of values assigned to calibrators, trueness control materials and human samples. Geneva: ISO, 2020.