临床微生物检测和抗微生物药物耐药性监测的创新模式趋势与面临的挑战
【摘要】微生物检测和抗微生物药物耐药性（AMR）监测是公共卫生工作的重要组成部分，旨在对抗传染病和保持抗微生物药物的功效。虽然传统培养方法是微生物鉴定的基础，但通常费力、耗时，并且检测AMR标志物的能力有限。为了应对这些挑战，利用分子生物学、基因组学、蛋白质组学、纳米技术和生物信息学的进步，出现了创新模式。这篇全面的综述概述了除传统培养方法外的微生物检测和AMR监测的创新方法。聚合酶链式反应（PCR）和下一代测序（NGS）等基于分子的技术具有更高的灵敏度和特异性，能够快速鉴定微生物病原体和AMR决定因素。基于质谱的方法可快速准确地检测微生物生物标志物，包括基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）和生物传感器技术。纳米技术方法，如基于纳米颗粒的检测和纳米孔测序，为病原体和AMR标志物的灵敏和无标记检测提供了新的平台。采纳这些创新模式有望改善疾病诊断、抗生素管理和AMR控制工作，然而，要实现这些技术的全部潜力，必须解决成本、标准化和与现有医疗系统的集成等挑战。通过促进跨学科合作和创新，我们可以加强检测、监测和对抗AMR的能力，为人类的公共健康提供保障。
【关键词】纳米技术、质谱、分子技术、抗微生物药物耐药性（AMR）、微生物检测
微生物检测在临床诊断、食品安全、环境监测、生物防御等多个领域发挥着关键的作用。准确、快速地鉴定和表征对于有效的疾病管理、感染控制和公共卫生监测至关重要。然而，抗微生物药物耐药性（AMR）的出现和传播对传统的微生物检测方法提出了重大挑战。抗生素的滥用和过度使用加剧了AMR，威胁着抗微生物药物的有效性，导致全球发病率、死亡率和医疗费用增加。传统的培养方法，如基于培养的技术和生化检测，长期以来一直是微生物检测的基石，虽然这些方法为了解微生物病原体提供了宝贵的见解，但既费时又费力，通常需要更高的灵敏度和特异性，特别是在AMR监测中。此外，传统方法可能无法检测到存活但不可培养（VBNC）病原体和混合微生物感染，从而导致诊断延迟和治疗决策不准确。针对传统培养方法的局限性，人们越来越认识到迫切需要在微生物检测和AMR监测方面采用创新模式。分子生物学、基因组学、蛋白质组学、纳米技术和生物信息学的进展为开发新技术铺平了道路，这些技术在微生物鉴定和表征方面提供了更高的灵敏度、特异性和快速性，这些创新方法在改善疾病诊断、抗生素管理和AMR控制方面具有巨大的前景。
本文旨在全面概述微生物检测和AMR监测的创新模式，重点关注非传统培养的方法。通过对新兴技术的优势和局限性进行批判性评估，本文试图论述和阐明它们在各种环境（包括临床实验室、公共卫生机构和食品生产设施）中的潜在应用，此外，文章还强调了微生物检测和AMR监控的挑战、机遇和未来方向，强调了用创新以应对AMR全球威胁的重要性。
一、微生物检测的传统培养方法
1. 传统方法的概述：传统的微生物检测方法，如基于培养的技术和生化分析，长期以来一直是微生物学的基础。这些方法包括通过染色、培养和直接的生化分析对微生物进行表型鉴定。基于培养的方法通常包括采集样本、连续稀释、接种到选择性培养基上，并等待适当的培养（孵育）时间以观察可见的菌落，大多数食源性和水源性细菌病原体的培养时间通常为18-24小时（h）。对样本中细菌的定量通常依赖于在受控条件下对菌落形成单位（CFUs）的计数，包括特定参数，如培养温度、时间、培养基选择性和O2水平等。生化检测通过检测培养基中的特定酶系统或代谢副产物，在微生物鉴定中起着举足轻重的作用。微生物实验室常用测试包括，吲哚（I）试验、甲基红（M）试验、Voges-Proskauer（V-P，V）试验和柠檬酸盐利用（C）试验（IMViC），过氧化氢酶试验、氧化酶试验、脲酶试验以及硝酸盐和亚硝酸盐还原试验。这些检测方法可根据目标微生物独特的生化特征为确定目标微生物提供有价值的信息。
2. 培养方法的优势与局限性：传统的微生物培养方法的优势在于其良好的结构和常规、有效的信息传递、明确的学习目标以及师生之间直接的面对面互动，这些方法提供了一个结构化的框架，在课堂上保持常规一致，提供了一个可预测的学习环境。以授课为基础的教学可以有效地传递信息，尤其是在基础知识至关重要的学科，此外，传统教学通常具有明确的学习目标，帮助学生理解期望，并帮助教师在规定的时间内系统地涵盖主题。然而，传统培养方法也有一些局限性，培养过程可能漫长而乏味，既费时又费力，这些方法也容易受到污染，并且需要受控条件，例如，特定的培养时间、温度、选择性培养基和O2供应。与下一代测序（NGS）和全基因组测序（WGS）等更先进的技术相比，传统方法的精确度和效率较低。NGS和WGS为微生物检测和AMR提供了更准确、更快速的方法，提供了传统方法无法比拟的全面分析。
3. 使用传统技术检测AMR的挑战：传统的药敏试验（AST），例如纸片琼脂扩散法、微量肉汤稀释法通常需要18-24 h或更长时间才能产生结果，对于及时的临床决策而言，时间太长，因为快速干预至关重要。此外，这些方法需要大量样本，对某些难以获得足够样本量的临床样本带来了挑战。另一个重大局限是传统的培养技术无法检测不可培养的细菌，这些方法只能识别在选择培养基上生长的，从而漏掉了可能携带AMR基因的不可培养或生长缓慢的微生物。此外，尽管传统的表型方法可以揭示耐药性的存在，但它们往往无法识别特定的耐药机制或导致耐药的具体基因。食品样本带来了进一步的复杂因素，因为它们可能含有抑制物质，会干扰传统PCR的AMR基因检测。此外，传统的PCR技术无法区分活细胞和非活细胞，无法检测两者中的抗性基因，这一局限性使得确定样本的真实耐药性情况变得十分困难。使用传统技术检测AMR所面临的挑战如图1所示。
图1. 使用传统技术检测AMR的挑战
二、微生物检测的创新模式
1.基于分子的技术：（1）PCR：以分子为基础的技术，特别是聚合酶链式反应(PCR)，通过快速和精确地扩增特定的DNA序列，彻底改变了分子生物学。PCR使用引物（短DNA片段）靶向和扩增基因组的特定片段，然后重复DNA合成周期来扩增该片段。PCR技术由美国生物化学家Kary Mullis于1983年开发，现已成为分子生物学和生物技术领域不可或缺的工具。PCR过程包括三个主要的循环反应：变性、退火和延伸。在变性过程中，将反应混合物加热至94℃，0.5-2min，破坏DNA链之间的氢键以产生单链DNA，然后将温度降至54-60℃，20-40s，使引物与模板DNA上的互补序列结合，在延伸步骤中，Taq聚合酶将碱基添加到引物的3’端，从而沿5’到3’方向延长DNA。PCR具有广泛的应用，包括检测基因突变、监测基因表达、识别致病基因和基因指纹图谱，在基因定位、系统发育分析和基因表达研究中也是必不可少的。该技术的高灵敏度使其能够扩增极少量的DNA样本，使其成为法医学和医学诊断的有力工具。此外，PCR还促进了各种基于PCR的技术的发展，例如实时PCR、数字PCR和反向PCR，每种技术都有其特定的优势，扩展了PCR在DNA序列分析中的能力，使其具有更高的精度和效率。（2）NGS：NGS是一项突破性的技术，它能够快速、精确地对DNA和RNA进行测序，从而彻底改变遗传分析。NGS可以快速对数百至数千个基因甚至整个基因组进行测序，与传统的Sanger测序方法相比具有显著优势。该过程涉及几个关键步骤，包括DNA片段化、文库制备、大规模平行测序、生物信息学分析以及注释和解释变异和突变。NGS具有广泛的临床应用，从疾病诊断和预后到指导治疗决策和患者随访，使其成为个性化精准医疗的重要工具。该技术的可扩展性、速度和检测低变异等位基因频率的能力为遗传分析带来了革命性的变化，使其能够在基因组和临床研究、生殖健康和其他科学领域实现了新的应用。二代测序数据分析包括初级、二级和三级分析，生物信息学专家在解释结果和从数据中提取有意义的信息方面发挥着至关重要的作用。（3）微阵列技术：微阵列技术是一种基于分子的复杂技术，能够对各种生物进行全面的遗传分析，从而在属和种水平上诊断细菌、病毒、真菌和寄生虫病。微阵列技术涉及将已知的核酸片段附着到固体表面，形成一个“芯片”，该芯片与样本中的 DNA或RNA相互作用，通过互补碱基配对产生可检测的荧光。这项技术对于测量基因表达、检测单核苷酸多态性（SNPs）等特定DNA序列以及开展全基因组关联研究（GWASs）至关重要。微阵列可有效检测染色体异常、拷贝数变异（CNVs）和SNPs，使其在基因表达谱分析、癌症诊断、孟德尔疾病研究和生殖健康评估方面具有重要价值。尽管微阵列依赖于特定探针进行检测，但由于其能够同时检测大量基因并具有高分辨率的能力，因此仍是临床实验室的重要诊断工具。在中短期内，由于微阵列能高效地同时分析多个基因组区域，预计其在基因检测中的应用将继续扩大。
2. 基于质谱（MS）的方法：（1）基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）：基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是一种非常先进的分析技术，可将样本电离为带电分子，从而便于测量其质荷比（m/z），MALDI是离子源，TOF是质量分析器。该技术在分析肽、脂类、糖类和其他有机大分子等生物分子时具有优势，不会造成碎裂或分解，适用于在传统方法下可能会降解的生物大分子。MALDI-TOF MS对于快速检测寡核苷酸片段、确保合成完整性和序列准确性至关重要，以简单、快速、准确和灵敏地确定寡核苷酸序列而闻名。此外，MALDI-TOF MS可用于MALDI成像质谱（MALDI-IMS），该质谱可以直接分析和成像组织切片中的蛋白质，可以提供有关组织内肽和蛋白质的分子组成、丰度和空间分布的详细信息。该技术用途广泛，能够以低内能离子分析多种生物大分子，从而最大限度地减少碎片化，并且易于维护、数据采集速度快。选择合适的基质物质是MALDI-TOF MS取得成功的关键，要确保分析物和基质在特定溶剂中的溶解度，以获得最佳结果。（2）电喷雾电离质谱（ESI-MS）：基于质谱的方法，尤其是ESI-MS，为分析分子种类及其结合/解离提供了强有力的工具，从而改变了分析化学。ESI-MS是一种气相方法，它使用“软”电离过程电离大分子，从而保留了分子的完整性，从而可以检测完整的分子种类。该技术特别适用于分析蛋白质、肽和寡糖等生物大分子，因为它克服了这些分子在电离时碎裂的趋势。ESI-MS能够检测极低水平的分析物（飞摩尔和阿托摩尔水平），并能灵活地与各种质量分析器和色谱技术相结合，因此是一种用途广泛的工具。ESI-MS的优势包括能够研究原生状态下的生物大分子，在气相中保留溶液相信息，以及分析膜蛋白等生物大分子。2002年，John Bennett Fenn和Koichi Tanaka因开发出用于分析生物大分子的ESI技术而荣获诺贝尔化学奖，从而肯定了该技术在分析生物大分子方面的重要意义。ESI-MS 已被应用于众多领域，包括蛋白质折叠研究、脂质分析和非共价气相相互作用研究。此外，该技术还促进了基于MS的脂质分析的新策略，包括鸟枪法脂质组学，该策略涉及将粗生物提取物直接注入质谱仪。这种直接从生物样品中分析脂质的能力已被证明是理解脂质代谢及其在疾病中的作用的有力工具。
3. 生物传感器技术：（1）生物传感器概述：生物传感器是一种重要的分析设备，它将生物传感元件与物理传感器集成在一起，用于检测化学物质。它们在生物医学诊断、环境监测、食品安全和药物研发等各个领域都有重要应用。生物传感器中的生物元件与分析物相互作用，产生信号，传感器将该信号转换为可测量和可量化的输出。生物传感器的关键部件包括分析物（目标物质）、生物受体（识别分析物的分子）、换能器（转换能量形式）、电子元件（用于信号处理）和显示器（用于显示结果）。生物受体可以是酶、细胞、适配体、DNA 或抗体。换能器通常将生物识别事件转换为与分析物-生物受体相互作用成比例的光学或电信号。然后，电子元件对这些信号进行处理和量化，以方便显示。随着纳米技术的发展，生物传感器已经发展成为高度敏感和小型化的设备，在疾病诊断、医学和环境监测中，对快速、低成本的分析至关重要。生物传感器技术的不断进步包括整合各种类型的生物传感器和传导技术，以增强检测能力和应对新出现的挑战。（2）微生物检测和AMR监测中的应用：生物传感器，尤其是微生物生物传感器，通过将微生物固定在传感器上检测目标分析物。这些设备有助于实时监测微生物活动和抗生素反应，从而实现及时干预和个性化治疗策略。在AMR监测中，生物传感器可用于耐药机制的表型和基因型检测。表型技术评估耐药性状的表达，而基因型工具确定与耐药相关的特定遗传标记。生物传感器提供了一种快速、经济高效和灵敏的方法，用于检测耐药基因和评估细菌对抗生素的敏感性，指导适当的治疗决策，并对抗耐药菌株的传播。将生物传感器技术与表面增强拉曼光谱（SERS）和人工智能等先进方法相结合，可以提高微生物检测和AMR监测的准确性和效率。这些方法可实现高通量筛选、多重分析和实时数据收集，彻底改变了传染病管理和抗生素监管领域。（3）纳米技术方法：基于纳米颗粒的检测方法是利用纳米颗粒的独特性质进行各种应用的尖端工具，包括生物亲和性检测、免疫检测和POCT检测。这些检测采用纳米颗粒标记进行检测、信号生成和放大，在识别靶分子时具有更高的灵敏度和特异性。在生物亲和力测定中，纳米颗粒已显示出取代免疫检测中使用的传统酶或分子标记的巨大潜力。值得注意的是，它们已成功运用到商业检测中，例如，侧向层析检测，其中SARS-CoV-2的快速抗原检测就是通过胶体金纳米颗粒形成的红色线条进行目视检测的典型例子。这些检测已迅速从最初的实验室研究过渡到广泛的市场应用，凸显了基于纳米颗粒的检测在快速有效诊断方面的功效。使用数字方法对基于纳米颗粒的免疫生化传感器和检测方法进行了评估，通过计算单个分子或纳米颗粒的相互作用实现了单分子分析，这种数字评估方法大大提高了免疫检测的灵敏度和准确性，提供了一种更精确、更可靠的检测方法。此外，还开发了金纳米颗粒介导的用于检测宿主抗体和COVID-19蛋白的侧向流动检测法，这些检测利用金纳米颗粒作为信号报器，纳米颗粒的大小和形状会影响检测的灵敏度和检测限。银增强、电化学置换反应和金增强等技术已被用于提高这些检测的灵敏度，这表明基于纳米颗粒的检测系统具有多功能性和适应性。
三、创新模式的优势
1. 提高灵敏度和特异性：PCR-ESI-MS与高效的裂解方法和自动化DNA纯化系统相结合，大大提高了血液样本中细菌检测的灵敏度，与传统的培养方法相比，这一进步带来了更高的检测率。噬菌体修饰的磁等离子体纳米颗粒在检测特定细菌菌株（如，金黄色葡萄球菌）方面表现出显著的特异性，即使在存在其他细菌物种的情况下也是如此，这项技术展示了其应用所实现的高度特异性。SERS是一种强大的细菌检测技术，具有快速、灵敏和无损的特点，能提供分子指纹信息，便于对多组分样本进行在线定性分析，从而提高了细菌检测的灵敏度和特异性。基于铁纳米颗粒的纳米生物传感器的开发提高了检测金黄色葡萄球菌的灵敏度和效率，这一创新通过提高细菌检测的灵敏度和特异性解决了传统方法的局限性。
2. 微生物的快速检测和鉴定：它与传统的培养板技术相比，快速微生物学方法（RMMs），也称为替代微生物学方法，可提供更快的微生物学检测结果。可在数小时内得出结果，而传统方法则需要数天或数周，可分为定性、定量和鉴定方法。技术的进步推动了微生物快速检测方法的发展，核酸扩增方法，如PCR和基于荧光的检测方法，已被发现适用于工业微生物快速检测，这些技术可扩增和检测微生物细胞内的核酸或利用荧光检测细菌细胞，需要进行短暂的生长预富集，以达到可接受的检测限。固相和流式细胞术等新兴方法代表了非基于生长的方法，与早期的快速方法相比，具有更高的灵敏度潜力，尽管存在某些缺点，但这些技术在微生物检测和鉴定方面仍表现出良好的前景。微生物快速检测和鉴定方法的应用遍及各个领域，包括医疗保健和食品安全。在医疗机构中，快速方法正被用于快速检测和鉴定血培养物中的微生物，这是一种比传统方法（包括对血培养物进行革兰染色）更有效的替代方法。这种快速检测能力极大地影响了对病人的护理，能够及时采取有针对性的治疗措施。在食品行业，快速检测和识别微生物对确保食品安全至关重要。目前正在开展一些项目，以评估利用直接荧光显微镜对细菌进行特定计数的分子探针。这项技术可以提供快速、精确的结果，在发生污染时便于及时干预，从而彻底改变食品安全监控。
3. 直接检测AMR标记的能力：NGS是检测微生物基因组变化的有效工具，尤其是与AMR相关的基因组变化。该技术提供了高通量能力，有助于识别与AMR相关的低频变异和基因组排列。核磁共振（NMR）和傅立叶变换红外光谱（FTIR）等光谱技术为在原子水平仔细研究分子提供了途径，从而为AMR机制提供了宝贵的见解，这些方法允许对同一样本进行多项研究，直接检测AMR标志物。包括全基因组测序（WGS）和全宏基因组鸟枪法测序（WMS）在内的分子检测技术已成为直接识别AMR基因和机制的有效手段。这些检测方法提供了高分辨率的变异检测，而不需要特定的探针，从而提高了AMR标志物的检测能力。
4. POCT的潜力：POCT具有多项优势，对医疗服务产生了重大影响。首先，POCT的快速周转时间加快了诊断和治疗的速度，减少了病人在医院和急诊科的时间。其次，POCT可减少转诊次数，缩短住院时间，降低入院的可能性，从而提高医疗流程的效率。此外，POCT还能简化诊断流程和治疗决策，最终降低总体医疗成本，在优化资源配置的同时实现效率目标，从而提高成本效益。POCT能够根据检测结果立即采取行动，从而促进及时采取治疗干预措施，降低并发症风险，从而有助于改善临床决策。现代的POCT设备提供更多的检测菜单和连接，将各种检测整合到一个平台上，这种整合提高了效率，缩短了周转时间，此外，这些设备越来越多地与电子病历集成，促进了实时数据共享和全面的患者监测。最后，技术的进步进一步提升了POCT设备的能力，物联网、人工智能和生物传感器等先进技术的集成提高了POCT设备的准确性、有效性和可靠性。这些进步有助于改善患者治疗和治疗结果，巩固了POCT作为现代医疗服务的关键组成部分的作用。
5. 自动化和高吞吐量能力：自动化系统具有众多优势，可彻底改变微生物筛选和检测流程。首先，它们通过同时处理多个并行实验大大提高了效率，加快了筛选和测试过程。其次，通过高通量筛选（HTS）技术，自动化系统实现了实验的微型化，减少了样本和试剂用量，同时保持了准确性和可重复性。此外，与传统手工方法相比，这些系统还能节省大量时间。例如，市售的分子检测系统可在1-2h内得出结果，与基于培养的方法通常需要18-24h形成鲜明对比。自动化系统的设计考虑到用户方便，需要最少的操作培训，这一特点使更多的用户可以在各种环境下使用它们。还有，研究表明，ambr 15f等自动化微生物生物反应器系统具有扩大规模的潜力，这些系统有利于菌种和分子的选择以及快速放大，在生长和产品产量方面都具有1300倍规模可比性的巨大潜力。最后，自动化系统消除了人为误差和偏差，有助于提高准确性，从而提供更一致、更可靠的结果，尤其是在AST方面。
四、结论
本文论述和强调了在微生物检测和AMR监控中超越传统培养方法的迫切需要。我们指出了传统方法的不足，并强调了创新模式的变革潜力，通过利用分子技术、质谱、生物传感器和纳米技术，可以提高识别和鉴定微生物病原体的灵敏度、特异性和速度。采用这些创新方法对于应对不断升级的AMR威胁至关重要，因为它们可以实现有针对性的抗菌治疗、前瞻性监测和感染控制措施。展望未来，在人工智能、诊断平台微型化和跨学科合作的推动下，微生物检测和AMR监控有望取得更大进步，在我们应对不断变化的AMR时，采用创新的解决方案将是保障全球公共卫生和保持抗菌药物疗效的关键。
编译节选自：《Cureus》. 2024 Jun; 16(6): e61476.
