标准化分析前阶段在蛋白质定量质谱分析中的重要意义
【摘要】目的 血液蛋白质定量质谱分析（QPMS）依赖于蛋白质的胰蛋白酶消化和特征性肽段的测量。血清和血浆样本是否可以互换使用，以及体外抗凝剂是否会影响回收率尚不明确。一般实验室中，多种载脂蛋白QPMS测量首选样本为血清。在本研究中，探讨了不同基质对载脂蛋白质谱法进行定量分析的影响。方法 从44名健康献血者中同时采集血清（有/无凝胶）和血浆（抗凝剂为：肝素、柠檬酸盐或EDTA）样本。根据标准操作程序，使用赋值的血清校准品校准检测系统并定量测定9种载脂蛋白。通过跟踪每个载脂蛋白的多肽形成时间，在不同的基质中研究胰蛋白酶消化动力学，用时长达22小时。结果 在柠檬酸盐血浆中载脂蛋白的回收率显示出总体下降趋势，偏差为-14.6%。与血清相比，肝素血浆仅发现了−0.3%的偏差，而EDTA血浆的降低更为明显（−5.3%偏差），apoA-I、A-II和C-III多肽的降幅大于14%。消化动力学表明，特别是缓慢形成的多肽在EDTA血浆中生成量也减少。结论 血浆抗凝剂影响QPMS检测结果。肝素血浆显示与血清结果接近。柠檬酸盐血浆蛋白检测浓度的降低归因于抗凝剂对样本的稀释作用，而EDTA血浆回收率的降低则取决于蛋白水解消化效率的改变。结果突出地表明标准化的分析前阶段对于临床化学中准确的QPMS应用的重要性。
【关键词】抗凝剂；不同基质样本比较；预分析；定量蛋白质组学
在临床化学实践中，为患者提供准确的检测结果至关重要。因此，应开发适合临床需求的高质量检测方法，其中稳健的分析前阶段，对于通过定量蛋白质质谱（QPMS）测试实现的蛋白质多重测量而言，这一点尤其重要。在QPMS中，蛋白质的绝对定量取决于所谓的自下而上的蛋白质组学方法，其关键的前处理为蛋白质经蛋白水解酶降解产生可定量的蛋白质特异性多肽。只有通过胰蛋白酶对血清或血浆蛋白的消化形成稳定的特征性多肽，才能获得准确的蛋白定量结果。而在血清和血浆样本中，体外凝血过程又可能会干扰蛋白质消化，并最终影响蛋白质的定量。
QPMS将越来越多地用于临床化学常规实验中的多重蛋白定量和个性化医疗之中。本实验室开发了内部检测血清、血浆（载脂蛋白和抗凝血酶）和尿液中蛋白质生物标志物的检测。医学实验室中，有各种各样的血样采集管常常用于多种临床诊断参数的测试，在生物样本库建设和临床研究也是如此。到目前为止，临床实验室一直把血清用作血中载脂蛋白或与其类似蛋白质的参考基质。血浆基质也是诊断研究材料的重要来源，但目前尚不确定在QPMS背景下，不同（血液）基质的结果是否以及在多大程度上是可互换的。
基于血液生物标志物的消化动力学可能受到样品制备条件变化的影响。同样，血清和血浆基质之间的差异已经在开发定性的蛋白质组学研究中得到报道，并且人类蛋白质组计划（HUPO）已经提出了标准化血液采集程序的倡议。已知血清中凝血过程或血浆基质中EDTA和柠檬酸盐等络合剂的影响会导致血液成分的变化。这些基质差异可能会影响QPMS中的蛋白水解消化，并产生不准确的检测结果，但到目前为止，这一点还没有得到研究证明。
蛋白质生物标志物可以在血清或血浆样本的不同基质中进行测量。对于血浆样本，柠檬酸钠、肝素锂或K2EDTA被用作抗凝剂。血清和血浆基质存在差异，因为血清样本中发生凝血过程（试管壁上的二氧化硅颗粒启动凝血反应），而血浆中凝血反应被阻止。在肝素锂血浆中，抗凝血酶通过与肝素相互作用而活化，导致凝血级联反应受到抑制，进而阻止纤维蛋白的形成。在K2EDTA血浆中，通过螯合金属离子（如钙）来防止凝血。柠檬酸钠也可与金属离子钙形成络合物，但与K2EDTA相比，其抗凝血作用是可逆的。由于它们的特殊性质，这三种类型基质血浆分别用于不同的检测实验（肝素血浆临床化学、EDTA血浆血液学和柠檬酸血浆凝血试验）。
本文系统地评估了样本基质和分析前处理步骤对九种载脂蛋白定量测定的影响。收集了44名健康献血者的血液样本，并对血清（有和无分离凝胶）和四种不同的血浆基质（肝素锂，K2EDTA无和含蛋白酶抑制剂（PIC）和枸橼酸钠）中的蛋白质进行了定量。我们的标准校准程序采用选定的天然血清校准品应用于含有各种基质的样本，并评估了不同分析前条件下结果的差异。此外，作为样本基质变化的潜在原因，研究了血浆抗凝剂对载脂蛋白消化的影响。
一、对象和方法
1. 对象：对44名匿名健康献血者的血清和血浆样本通过莱顿大学志愿捐赠服务（LuVDS）获得，该服务得到莱顿大学医学中心的生物样本库的协作。志愿者（14名男性，30名女性，年龄从25岁到68岁不等）在采集设备上抽血后血液存储在6个不同的Beckton Dickinson（BD）血管中（图1和附表ST1）。
图1. 血清和血浆基质比较的总工作流程
所有样本管按照临床生化科的操作规范进行处理。血清管在室温下保存60分钟，以便充分凝固。离心前，血浆样本颠倒混匀6次。接下来，血清和血浆管在2350g（Hettich Rotanta 460-RS）下同时离心10分钟。每个基质样本都制备了多个等量分装样本，以防止在未来的批处理中额外的反复冻融。全部样本随后在-80℃下保存以备使用（通过QPMS定量的9种载脂蛋白最长保存期3个月）。所有健康捐赠者都给予积极的支持。通过LuVDS收集的44名捐赠者的生物材料和相关临床数据在获得IRB批准后，仅用于研究目的。
2. 载脂蛋白定量（QPMS）：根据血清载脂蛋白的样本制备和胰蛋白酶消化的标准操作程序，载脂蛋白的测量进行了双份实验，实验过程与先前发布的6种载脂蛋白apoA-I、A-II、A-IV、（a）、B、C-I、C-II、和C-III和E相同。所有载脂蛋白的LC-MS测量的具体结果汇总在附表ST2中。样品在96通道安捷伦BRAVO自动液体处理平台上处理，并用安捷伦6495三重四极质谱仪进行测量。6种基质样本中的所有44名健康供者ApoE表型分型按照最初描述的4种方法进行。
3. 免疫比浊法（ITA）测定apoA-I和B：为了与QPMS进行比较，在5种基质中（血清4A和5B以及血浆6B，7B和PIC），通过Cobas C502系统（Roche Diagnostics）对apoA-I和B进行了单次ITA测量。
4. 胰蛋白酶消化动力学：对6名选定的健康供者（编号7，12，24，33，35和36）血液样本研究了9种载脂蛋白的胰蛋白酶消化动力学和所有22种肽链的形成过程。在0，0.5，1，2，3，6和22h时间点终止消化反应，所有这些都从0时开始，通过添加胰蛋白酶启动，并用5%（v/v）甲醇和0.6%（v/v）甲酸的MQ水溶液进行终止。在消化动力学研究中样本的最大储存时间为6个月。
5. 血清添加抗凝剂：为了模拟血浆状态，实验设计选取了上述同一组6位献血者的SST、5B管血清，并向其中分别添加了K2EDTA、肝素锂以及柠檬酸钠。所用的肝素锂和K2EDTA产品分别来源于Sigma公司，其产品编号分别为H0878和03660；而柠檬酸钠缓冲液则是从BD3B管中提取得到的。在BD7B管中，K2EDTA的浓度为1.8mg/mL，而在BD6B管中，每毫升血液中含有17个单位的肝素锂。K2EDTA配制浓度为18mg/L,每10μL在N2（g）下蒸发至干燥。加入100μL血清可得到1×K2EDTA样本（1.8mg/mL血清）。肝素锂的浓度为170Units/mlMQ水，每10μL（1.7Units）在N2（g）下蒸发至干燥。加入100μL血清可得到1×肝素锂样本。同时对K2EDTA和肝素锂进行了10倍的浓度测试。柠檬酸钠缓冲液（来自3B管）以1:9的标准比例加入血清，与在3B管中制备柠檬酸钠血浆时相同。模拟血浆实验标本的最大储存时间为12个月。
6. 统计学分析：以统计软件（版本4.0.3）对44个样本双份测量结果进行了基质比较分析，数据使用ggplot2软件包（版本3.3.3）绘制图表。通过Deming回归法对替代基质4A、6B、7B、PIC和3B与凝胶血清（5B）基质进行了比较，以获得9种载脂蛋白和22种肽段的线性回归方程的斜率和截距。理想的TEa值分别设定为ApoA-I、B和（a）已知值的9.1%、11.6%和24.1%，而对于其他载脂蛋白则设定为20%。根据公式，偏差和不精确度不应超过TEa；即偏差+1.65×不精确度＜TEa。
GraphPadPrism 9.0软件被用于基质配对比较的一元方差分析（one-wayANOVA），获得了9种载脂蛋白的22个肽段数据均值及百分位分布箱线图（附信息）。
7. 重新校准柠檬酸钠和K2EDTA基质的结果：针对七个独立批次的样本进行了基质特定的再校准。每个批次中的一份分离胶（5B）血清样本被赋予定值，通过它对该批次内的其他样本重新进行单点校准。因此，对批次中所有样本在柠檬酸钠（3B）管和K2EDTA（7B和PIC）管中的apoA-I（对于AKPAL和VQPYL两种肽段）的值进行了重新计算。
二、结果
1. 血清和血浆基质中QPMS获得的浓度变化：通过LC-MRM-MS/MS方法利用QPMS获取的血清和血浆样本中的载脂蛋白浓度进行比较，以评估预分析阶段对定量结果的影响。使用线性回归分析比较分离胶血清（5B）和普通血清（4A）、肝素锂血浆（6B）、K2EDTA血浆（7B和PIC）和柠檬酸钠血浆（3B）测试结果，获得的斜率和偏差见表1（其中显著偏离1的斜率值，对应的偏差结果高亮显示）。载脂蛋白（和多肽）测试的总误差（TE）不应超过TEa，根据Westgard数据库在2022年2月15日提供的理想分析质量规范，apo（a）、A-I和B TEa值分别定义为24.1%、9.8%和11.6%。基于当前最先进的技术水平，apoA-II、A-IV、Cs和E的TEa值设置为20%。
通过Deming回归分析比较分离胶血清（5B）与普通血清（4A）、肝素锂（6B）、K2EDTA（7B）、含蛋白C抑制剂的K2EDTA（PIC）以及柠檬酸钠（3B）44个血浆样本（双份检测）之间的数据，相关系数r、斜率和偏差，9种载脂蛋白的定量肽（黑色粗体）和特征性或其他的肽段数据列表如上。ApoE表型肽则没有包括在内。偏差在5%至10%之间（淡棕色）和大于10%（深棕色）的部分已突出显示。表内列出所有9种载脂蛋白（21个肽段）的平均百分比偏差，或除外apoC-II后的a8种载脂蛋白和20个肽段的平均百分比偏差。计算R时，由于apo（a）b在检测限附近偏差较大，因此Apo（a）小于5nmol/L以及ApoC-II小于5mg/L的值未做计算；而对于apoC-IIc0值是通过校准误差（由于截距较高导致）获得的。9种载脂蛋白的定量肽用黑色粗体表示。
两种血清基质以及肝素锂血浆基质（5B、4A和6B）在载脂蛋白定量上是可互换的，尽管观察到肝素锂血浆基质6B的斜率和偏差稍大但并不显著（其中，5B与4A的斜率范围为0.930至1.045，而5B与6B则为0.888至1.042；偏差方面，5B与4A在-0.3%至3.1%之间，而5B与6B则在-3.3%至3.6%之间，分别见表1）。相反地，在两种K2EDTA基质（7B和PIC）中，我们发现来自apoA-I、apoA-II和apoC-III的肽段具有显著的低斜率（≤0.797）和更大的负偏差。具体表现为：VQPYL（apoA-I）的偏差≤-13.7%，EQLTP和SPELQ（apoA-II）这两个肽段的偏差均≤-18.8%，GWVTD（apoC-III）的偏差≤-14.6%。此外，对于apoB FPEVD、apoC-I EFGNT和TPDVS、apoE SELEE，这两个K2EDTA基质的载脂蛋白定量偏差在5.0和8.4%之间，各自的斜率较小（0.855-0.964），这表明这两种基质与天然血清基质不可互换。同样，柠檬酸盐血浆基质（3B）的斜率始终较低（平均0.82）和负偏差（平均-13.9%）。重要的是，在柠檬酸盐血浆基质中，两个apoC-II肽的斜率和偏差甚至更低；这可能是由于高截距导致的校准误差。
在附表ST3中，计算所得TE证实了几乎所有柠檬酸钠血浆肽段的结果均超过了TEa值。对于K2EDTA和PIC基质，apoA-I（VQPYL）、A-II（SPELQ和EQLTP）和C-III（GWVTD）的异常肽段也是如此。对于定量肽段apoA-I，AKPAL在基质7B和PIC以及肝素锂（6B）的（低）TEa都超过了9.1%。不同基质标本结果通过单因素方差分析比较（附表ST4A和B）得到了进一步的确认。图2A和B展示了apo（a）、A-I和B的斜率变化以及偏差百分比，表明apo（a）和B的偏差仅发生在柠檬酸钠血浆中。对于apoA-I肽VQPYL，在K2EDTA（7B和PIC）以及柠檬酸盐基质血浆中均观察到了此类斜率变异和系统误差。所有基质标本对比（与5B相比）和肽段对比均可在附加材料中查看（附图S1A和B）。此外，在附加材料（附图S2A和B）中还可以看到展示的所有44个样本在6种基质标本中分布情况的箱线图。所有6个基质中的44个样本的ApoE表型相同，其中29个显示为E3/E3表型，12个为E3/E4，2个为E2/E3和1个为E4/E4（数据未在此处显示）。
QPMS的一项优点是具备内在质量控制的能力。我们设计的方法是针对每种蛋白质至少定量测试两个肽段，从而使测试的蛋白质既具有量化又具有定性的肽段。后者又在一致性定量中发挥着作用。有趣的是，各基质血浆不一致的结果首先来自肽段间的比较。表2显示了9种载脂蛋白11个肽段间的相关性（r）、斜率和偏差。在大多数情况下，对于血清（5B,4A）、柠檬酸盐和肝素基质血浆（6B，3B），在10/11个肽段比较中观察到相关性r＞0.95，斜率接近1，偏差＜6%。只有对于apoC-I，EFGNT和TPDVS肽段在所有6个基质中显示了较差的肽段一致性（相关性和斜率降低，偏差%升高）。在最初的多种载脂蛋白检测中也观察到apoC-I多肽的低相关性。图2C显示了apo（a）、A-I和C-III多肽的一致性。对于apo（a），肝素血浆基质（6B）的LFLEP和GISST两种多肽的最大偏差为3.7%（表2）。然而，两个K2EDTA基质血浆，apoA-I（AKPAL和VQPYL）和apoC-III（GWVTD和DALSS）的多肽分别显示出显著的负偏差≤-14%和正偏差≥20%（图2C，表2）。尽管柠檬酸钠样品（3B）的浓度较低，但该基质中的多肽间一致性与5B、4A和6B相当，总体平均偏差为-0.4%±3.7%SD（表2）。由于apoA-II多肽SPELQ和EQLTP在K2EDTA血浆（7B和PIC）与凝胶血清（5B）的基质比较中偏差相近，这些apoA-II多肽显示出相对较好的多肽一致性（偏差≥-3.0%）（表1和2）。
对于apoA-I和GWVTD，7B和PIC（K2EDTA基质）显示出超过14%的偏差。在所有六种基质中，对于肽TPDVS，apoC-I显示出大约10%的负偏差。在相关性R统计时，排除了Apo（a）＜5nmol/L以及ApoC-II＜5mg/L的值，由于apo（a）a在接近检测限时偏差受到强烈影响；而apoC-IIb，由于校准误差（高截距导致）；偏差结果为零。
2. 血清和血浆基质中胰蛋白酶消化动力学的评估：如前所述，通过自下而上的蛋白质组学进行QPMS的技术依赖于被测物质从完整蛋白质到多肽的转化。这个酶促过程由胰蛋白酶催化。然而，众所周知胰蛋白酶并不是在所有位点上都以相同的效率进行切割。在K2EDTA与血清基质之间表现出最显著差异的肽段，根据经验得知它们的肽段形成较慢，表明在K2EDTA基质中的消化效率受到损害。这一点通过观察到的PIC（蛋白酶抑制剂混合物）基质相比于未添加PIC的常规K2EDTA基质具有更高的偏倚得到了进一步证实（图7B）（表1）。
在4种不同基质（血清凝胶（5B）、肝素锂（6B）、柠檬酸钠（3B）和K2EDTA（7B）血浆）中，对6个样本的9种载脂蛋白多肽的消化动力学进行了研究。对于VQPYL-apoA-I、GWVTD-apoC-III和SPELQ-apoA-II多肽，观察到明显的生成受到抑制。而EQLTP-apoA-II多肽的形成通常较慢，但在各个基质之间似乎没有偏差（图3）。所有多肽的消化时间见附图S4。21种多肽中有10种在消化前2小时内快速形成（ApoA-I，AKPAL；A-IV，LEPYA，LTPYA；（a）LFLEP，B，TGISP，TEVIP；C-II，ESLSS，TYLPA；C-III，DALSS和E，LGPLV）。由于多重检测的孵育时间为3h，相对于22h时间点（即完全消化的基准时间点），3h形成的多肽信号的百分比进一步证实了肽段的延迟形成。见附表ST6。
3. 血清样本中加入抗凝剂：为了评估各种基质样本产生的结果偏差是否仅仅是由于添加了抗凝剂，（分离胶）血清样本（5B）添加相同的浓度（或稀释）肝素锂、K2EDTA和柠檬酸钠作为BD管6B、7B和3B。与柠檬酸钠（3B）基质本身相比，只有（稀释的）柠檬酸钠引起了相近的平均降低幅度，即11.9±4.0%，而肝素锂或K2EDTA则未见显著降低（对于6B和7B分别为1.7±2.6%和2.2±2.2%）。然而，apoA-I肽段VQPYL相比于AKPAL多降低了17.6±4.8%，而apoC-III肽段GWVTD相比于DALSS多降低了22.6±4.3%。两个apoA-II肽段，SPELQ和EQLTP，在与对照5B血清样本相比，分别降低了19.9±5.7%和21.9±4.7%。
胰蛋白酶对六名健康供体血清（5B）和血浆（3B、6B和7B）中的apoA-I（VQPYL）、C-III（GWVTD）和A-II（SPELQ、EQLTP）多肽消化动力学研究。所有数据均对22h时间点的100%相对响应值（RR）进行了校准。
4. 免疫比浊法（ITA）测量ApoA-I和B：免疫比浊法测量不受蛋白酶降解和基质的影响，在一定程度上各基质样本可以互换。罗氏ITA法针对载脂蛋白A-I和B在血清、肝素锂血浆以及K2EDTA血浆中的测量均获得了CE认证。通过测量采集5B、4A、6B、7B和PIC的44个样本，这些基质的互换性得到了证实（附图S3）。K2EDTA（PIC）样本显示出apoA-I和B与平均值的最大差异分别为0.044g/L和0.029g/L，两者斜率均为0.97（附表ST5）。
5. QPMS要求基质特异性的校准品：在QPMS测试开发和应用过程中，基于基质的校准品是理想的选择，因为它们的酶解过程与临床样本相近。由于载脂蛋白定量QPMS测试的校准品是基于血清的，因此血清样本显示出最小的偏差，而血浆样本则显示出较大的偏差。为了评估基于基质的校准是否确实减少了定量中的变异，我们利用其中一个样本作为校准品，根据血清凝胶基质（5B）的结果为其赋值，以此重新校正QPMS测量的apoA-I浓度。在柠檬酸钠血浆中观察到因基质特异性校正产生的显著效果（见图4，表3）。此外，在含有和不含有PIC的K2EDTA基质中，AKPAL和VQPYL两种肽段均得到了相同的结果，研究表明基于基质的校准品的必要性。
三、讨论与分析
分析前阶段对获得准确的检测结果非常重要，分析前处理不当是造成错误结果的重要来源。因此，选择正确的采血管对获得准确的临床检验结果至关重要。许多常规临床化学分析物、细胞因子和各种代谢物的各种基质（有和没有抗凝剂）之间的结果差异已有报道。
定量蛋白质质谱法（QPMS）相对于传统的免疫分析具有诸多优势。它可以在分子水平上对蛋白质精确测量，并结合多重检测和抗体非依赖性的定量方法，利于促进实验室内部检测方法的开发应用。但是，为了确保检测结果的准确性，应评估整个分析过程，包括基于样本基质的变异。在以往的分析和蛋白质组学研究中，这种变异已经被认识到，它可能是由血小板、红细胞或凝血因子污染的血清或血浆引起的，并且改变了蛋白水解进程，从而影响了多肽的产生。
上方，针对apoA-I肽段AKPAL（左）和VQPYL（右）使用单点校准法对7批次中的44个样本（红色）进行柠檬酸钠结果（蓝色）的重新计算。下方，针对K2EDTA（PIC）apoA-IAKPAL（左）和VQPYL（右）的结果进行重新校准，各自标注为蓝色和红色（同上）。黑色虚线代表血清凝胶（5B）结果。
3B与5B以及PIC与5B基质之间的最初斜率对比，其中差异最大的斜率（＜0.8）部分显示为黄色背景。对3B和PIC结果进行了重新计算，每批次使用单点校正（共7个批次/44个样本）。在右侧，展示了AKPAL和VQPYL（apoA-I）之间肽段的校正结果比较。
在本研究中，首次展示了血液采集管中不同基质对九种载脂蛋白（A-I、A-II、A-IV、（a）、B、C-I、C-II、C-III和E）准确定量的影响，通过采用基于天然血清的校准策略利用QPMS进行测定。对44名健康捐赠者采集的样本的QPMS测量结果进行比较，发现载脂蛋白浓度在含有和没有凝胶的血清管之间是可互换的（5B和4A）。而且与肝素锂血浆（6B）基质结果非常接近。相反地，实验测量得到的载脂蛋白浓度在柠檬酸钠血浆基质中总体较低（3B，平均偏低13.9%，见表1），这是由于柠檬酸钠缓冲液对血液样本的稀释作用导致的。最大偏差的实验结果来自于K2EDTA血浆基质（包括7B和PIC）。四种多肽（apoA-I VQPYL，apoA-II SPELQ，apoA-II EQLTP和apoC-III GWVTD）结果偏低非常明显（偏差≤-13.7%），而其他多肽在7B和含有蛋白酶抑制剂混合物的PIC管中降低幅度稍小些（在-5.0和-8.4%之间），这些肽段包括apoB FPEVD、apoC-I EFGNT和TPDVS以及apoE SELEE。与未添加PIC的K2EDTA基质相比，蛋白酶抑制剂混合物（PIC）导致几乎所有肽段的测量浓度降低。这些结果与早期的比对研究结果一致，即使经过更长（2h和6h）的样本处理时间，也没有观察到载脂蛋白受到充分的保护以阻止降解。
由于QPMS依赖于蛋白质降解消化以形成特征性多肽，所以我们推测K2EDTA基质中观察到的差异是由蛋白消化动力学改变导致的。消化时间进程表明，那些形成较慢的肽段，特别是apoA-I VQPYL、apoC-III GWVTD和apoA-II SPELQ在K2EDTA基质7B中形成的速率相较于血清（5B）更慢，参见图3；而apoA-II肽段EQLTP在所有基质中的消化动力学都非常缓慢。为了评估这些影响是否仅仅源于抗凝剂造成的，在血清基质5B中加入K2EDTA，发现10倍量的添加剂确实降低了四种肽段形成的浓度，但这一现象并未在1倍量添加剂得到再现。因此，我们推测K2EDTA对胰蛋白酶的蛋白水解消化没有直接影响，而是间接的作用。
基质特定校准是一种广泛接受的策略，用于克服因基质差异带来的影响。同样地，对于QPMS系统，为了实现精确的定量分析，也需要进行基质特定的校准，这一点通过在柠檬酸盐和K2EDTA基质上采用临时单点重新校准得到了验证。
重要的是，在相同样本中，QPMS显示出基质特异性的变化，而对于apoA-I和B的ITA方法并未观察到此类差异（附图S3）。因此，在某些条件下，例如在样本采集时存在不一致的血液收集条件，LC-MRM-MS可能更倾向于采用IA而非QPMS。
总的来说，通过特定LC-MRM-MS/MS方法利用自下而上的蛋白质组学技术对不同基质中的蛋白质进行定量分析，实验结果显示，这种定量方法在不同的基质如血清和血浆中并非完全可互换，其准确度受到特定基质中蛋白质（特别是经过胰蛋白酶消化后）的消化动力学特性影响。因此，为了确保患者血液蛋白质鉴定的准确性和可靠性，有必要建立针对特定基质的校准品和参考区间。
本文编译自：Clin Chem Lab Med 2023; 61(1): 55-66
