罗伦隐球菌生物学特征与鉴定方法

【摘要】目的 探讨罗伦隐球菌的微生物学特征和鉴定，明确病原菌诊断。方法 通过培养等技术，观察罗伦隐球菌标准菌株ATCC18803菌株的生物学特征，并使用VITEK2-compact与VITEK MS仪器和表型特征（生长、菌体、尿素、酚氧化酶等）鉴定菌株。结果 使用上述两种仪器或者根据菌株37℃生长、菌体特征性形态、尿素阳性、酚氧化酶阴性等特征，可以准确鉴定罗伦隐球菌。结论 通过不同试验方法的互补，临床微生物学实验室可以准确鉴定罗伦隐球菌。若采用表型特征的试验鉴定菌株，可以不受仪器的限制，便于推广应用。

【关键词】罗伦隐球菌；生物学特征；鉴定方法

隐球菌广泛存在于自然界，鸽粪是最重要的传染源。人类因吸入了环境中的隐球菌细胞导致肺部原发性感染并播散至血流循环、中枢神经系统，免疫低下人群易感，偶有皮肤创伤感染，尚无人与人之间传播的报道；隐球菌也是中枢神经系统真菌感染的最常见菌，危及患者的生命[1-2]。该菌属包括17个种和8个变种[2]。其中，罗伦隐球菌（Cryptococcus laurentii）是除新型隐球菌（C.neoformans）和格特隐球菌（C.gattii）之外的多见菌种，患者的临床表型类似于新型隐球菌、格特隐球菌的感染[3]。国内已有较多罗伦隐球菌导致的中枢神经系统感染、血液系统感染、对HIV等患者形成感染的报道，并有多例患者死亡。送检样本包括脑脊液、血液、尿液、痰等[4-11]。因此，临床微生物学实验室掌握病原性隐球菌的生物学特征[1-3]，对于避免漏检或者鉴定错误很有必要。为此，本文通过对罗伦隐球菌标准菌株的培养、鉴定，描述其鉴别特征和鉴定方法，供同道们参考。

材料与方法

一、材料

1. 试验菌株：罗伦隐球菌标准菌株C.laurentii ATCC18803，购自广东省微生物菌种保藏中心；新型隐球菌和格特隐球菌为国家卫生健康委室间质评菌株；白念珠菌ATCC10231为本室收藏质控菌株。

2. 培养基：哥伦比亚血平板（血平板，批号20231010）、沙保弱平板（批号20230912）、科玛嘉念珠菌显色平板（念珠菌显色平板，批号20230914）购自上海科玛嘉微生物技术有限公司；尿素微量生化管（批号20230301）购自杭州滨和微生物试剂有限公司；均在有效期内使用。

3. 仪器设备：霉菌培养箱（MJ-250F-1）为上海一恒科学仪器有限公司制造；YST鉴定卡以及全自动微生物鉴定仪（VITEK2-compact）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（VITEK MS）购自法国生物梅里埃公司，YST鉴定卡在有效期内使用（批号2432243503）；荧光显微镜（CX43）为OLYMPUS公司生产；设备使用按说明书操作。

4. 染色液：革兰染色液、真菌免疫荧光显色剂（荧光染色液）、新型隐球菌染色液（墨汁负染色液）购自珠海贝索生物技术有限公司，在有效期内使用。

5. 酚氧化酶试纸[12]：自制。取咖啡酸1克（AR，98%，上海源叶生物科技有限公司）溶入1升去离子水中，加入适量柠檬酸铁（AR，Fe，w% 16-18.5），将裁好的试纸（滤纸条5mm×20mm）浸入该溶液内，浸透后取出干燥备用。成品试纸密封、避光、2℃-8℃冷藏保存1年。

二、方法

1. 在生物安全柜内取菌粉接种营养肉汤，放培养箱中37℃孵育24h-48h，转种血平板大气环境培养，并对生长物再次转种1代备用。

2. 血平板孵育48h见细小菌落，延长孵育时间菌落明显增大，菌落稍干燥，5天左右菌落显浅土黄色。无菌挑取血平板孵育48h单一菌落分别接种沙保弱平板、念珠菌显色平板，放37℃孵育，观察各种平板上生长的菌落特征。

3. 取血平板生长物涂片，做革兰染色、荧光染色、墨汁负染色，观察菌体特征。

4. 酚氧化酶试验：用酚氧化酶试纸粘取丰富的罗伦隐球菌血平板孵育72h生长物，放入无菌平皿中，滴加去离子水，在白色背景下30分钟后观察结果。无颜色变化为阴性，明显褐色反应为阳性，浅褐色则重复检测。阳性对照菌为新型隐球菌和格特隐球菌，阴性对照菌为白念珠菌ATCC10231。

5. 尿素试验：取血平板48h生长物，接种尿素微量生化管，37℃孵育。

结 果

罗伦隐球菌与新型隐球菌和格特隐球菌的生化试验特征，见表1。

1. 菌落特征：罗伦隐球菌在血平板及沙保弱平板上生长良好，孵育48h的菌落细小，延长孵育时间的菌落明显增大，菌落大小不等、稍干燥，不如新型隐球菌、格特隐球菌菌落湿润。血平板菌落不溶血、陈旧培养物呈浅土黄色，见图1。但在相同培养条件下，罗伦隐球菌在念珠菌显色平板上生长不佳，且生长缓慢。

2. 菌体形态及特征：取血平板24h-48h生长物涂片革兰染色，菌体阴阳性不定、着色不均一、大小不等，菌体外形不规则；荧光染色为亮蓝色菌体；墨汁负染色无荚膜，胞体内显示脂质颗粒[2]；见图2。

3. 鉴定结果：取血平板48h孵育纯生长物，使用VITEK2-compact全自动微生物分析仪鉴定：C.laurentii，生物码：4356 7552 7537 3571，置信度95%，经查看其生化试验，显示尿素阴性（孵育时间18.25h），再补充手工尿素试验阳性（孵育时间48h，用于对照的新型隐球菌和格特隐球菌尿素均阳性）。VITEK MS鉴定：C.laurentii，置信度95%。

4. 罗伦隐球菌酚氧化酶试纸不变色，为阴性；用于对照的新型隐球菌和格特隐球菌酚氧化酶试纸变褐色，为阳性，见图3。此试验观察时间延长至2h，罗伦隐球菌试纸无颜色变化，阳性菌无假阴性，特异性好。

讨 论

病原性隐球菌在普通的真菌和细菌培养基上37℃孵育生长，为分离培养提供了生长条件[2]，并可以区别于其他不生长的隐球菌。罗伦隐球菌与新型隐球菌和格特隐球菌的鉴别特征明确，可以鉴定出菌种。

1. 生长特性：罗伦隐球菌在念珠菌显色平板上生长不良，而新型隐球菌和格特隐球菌生长良好，因此，不宜选择念珠菌显色平板培养罗伦隐球菌，避免漏检。

2. 菌落形态：罗伦隐球菌菌落干燥，而且明显大小不一。新型隐球菌与格特隐球菌菌落光滑湿润、黏液样。

3. 菌体形态：革兰染色性不定，阳性、阴性的菌体混合、着色不均、明显的大小不等、形态不规则；墨汁负染色见胞体内的脂质颗粒（注：新型隐球菌和格特隐球菌二者也有此特征）。另外，光镜下的罗伦隐球菌菌体的外周有不完整感。

4. 荚膜：隐球菌在人体组织中增殖形成肥厚的荚膜细胞[1]，荚膜的主要成分是荚膜多糖（葡萄糖醛酸-甘露糖，是隐球菌的多糖抗原），另有文献报道荚膜多糖的形成也与培养基有关，荚膜多糖使菌落呈黏液状[2]。这株罗伦隐球菌标准菌株菌落干燥，无荚膜，可能与荚膜多糖丢失有关（墨汁负染色不见荚膜）。据张晓蓉等报道[9]感染病例的罗伦隐球菌菌落湿润、荚膜肥厚，但多数报道的罗伦隐球菌临床菌株未提及荚膜特征[3-11]，因此，还需重视原始样本中菌株的荚膜观察，掌握荚膜特征。

5. 尿素试验：隐球菌属菌株产生尿素酶获得生长所需的氮[1]。使用VITEK 2-compact全自动微生物分析仪鉴定新型隐球菌、格特隐球菌的尿素试验均阳性，而罗伦隐球菌尿素为阴性。但采用尿素手工方法试验，这3株菌37℃孵育48h左右均阳性，可能罗伦隐球菌分解尿素的时间超过仪器的18.25h观察期，该试验需要延长时间观察，否则导致尿素试验假阴性。

6. 酚氧化酶试验：罗伦隐球菌酚氧化酶阴性，此试验可以简单、明确、快速（30分钟）鉴定罗伦隐球菌。此外，酚氧化酶阴性的白色隐球菌（C.albidus）在37℃不生长[2]，据文献报道在25℃生长[13]可以鉴别。

尿素阳性、酚氧化酶阴性是鉴定罗伦隐球菌的关键试验。此外，根据尿素、酚氧化酶以及荚膜特征亦可以用来区别念珠菌属等其他的酵母样菌。

综上，通过与新型隐球菌、格特隐球菌相比较，本研究探讨了罗伦隐球菌的特征和鉴定方法。结果表明，通过不同试验方法的互补，临床微生物学实验室可以准确鉴定罗伦隐球菌；而且采用表型特征鉴定菌株，可以不受仪器的限制，便于推广。本文的不足之处在于，菌株数量少，需要进一步积累数据。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明：马爽、宁永忠：酝酿和设计实验、实施研究、采集数据、分析/解释数据、起草文章、对文章的知识性内容做批评性审阅；刘艳霞、林铿：行政、技术或材料支持、指导、支持性贡献；马翔：起草文章、对文章的知识性内容做批评性审阅

致谢：感谢首都医科大学附属复兴医院检验科刘淑梅教授提供的文献资料！

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