ICU患者侵袭性肺曲霉病的非培养诊断方法
【摘要】重症监护病房(ICU)患者侵袭性肺曲霉病（IPA）的诊断至关重要，因为大多数临床症状并非侵袭性真菌感染的特有症状。检测IPA应考虑不同的标准，除宿主因素和放射学征象外，还应符合微生物学标准。有不同微生物诊断方法，与传统的基于培养的方法（如染色和培养）相比，非基于培养的方法可以提高灵敏度并缩短获得结果的时间。除了真菌生物标志物，如半乳甘露聚糖和（1,3）-β-D-葡聚糖作为非特异性工具外，基于分子的方法也可以检测耐药决定因素，新型生物标志物或靶点的检测前景广阔。在这篇综述中，我们评估并讨论了非培养微生物学方法(半乳甘露聚糖、(1,3)-β-D-葡聚糖、曲霉PCR、新型生物标志物/靶点)对ICU患者IPA诊断的价值。
【关键词】曲霉菌；曲霉病；真菌感染；ICU；半乳甘露聚糖；（1,3）-β-D-葡聚糖
侵袭性肺曲霉病（IPA）最常见于血液系统恶性肿瘤患者，如急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病（AML，ALL）。但其他免疫抑制性疾病或特殊情况，如肺部病毒感染或长期住在重症监护病房（ICU）也是诱发IPA的危险因素。在一项多中心研究中，进行了多变量分析以确定死亡风险，在152例侵袭性真菌感染患者中有92例患者（60.5%）死亡。IPA的诊断至关重要，因为有各种非真菌特异性的标准。欧洲癌症研究和治疗组织及真菌研究组（EORTC/MSG）根据是否符合共识标准将IPA定义为三个等级（确诊、可能和很可能）。这些标准包括患者的宿主因素（例如既往疾病或免疫抑制治疗）、临床特征（放射学征象、典型解剖侧异常）和真菌学证据（培养或显微镜检测呼吸道样本中的真菌结构以及生物标志物检测，如半乳甘露聚糖（GM）抗原或（1,3）-β-D-葡聚糖（BDG）和DNA检测）。
正如Bassetti所提到的，ICU患者通常没有像血液肿瘤患者那样的危险因素，在这些患者中，曲霉病的危险因素包括大剂量皮质类固醇治疗、糖尿病、慢性肝病或慢性阻塞性肺疾病（COPD）或营养不良，此外，流感和其他病毒感染（如COVID-19）也是危险因素。ICU患者通常不会出现典型的曲霉病放射学征象，为了诊断重症患者的侵袭性真菌病（IFD），Blot等人定义了区分呼吸道曲霉菌定植和IPA的标准。这里只定义了两种分类，即确诊的IPA（与EORTC/MSG标准相同）和推测的IPA。此外，Schauwvlieghe等人还定义了一种临床算法来诊断危重患者的IPA，Koehler等人则定义了一种临床算法来诊断COVID-19患者。最后，Bassetti等人将高危患者（使用≥20mg/d泼尼松进行糖皮质激素治疗或中性粒细胞≤500/mm3或COPD或使用免疫抑制剂治疗或血液肿瘤或器官移植或HIV感染或流感或COVID-19）结合下呼吸道样本中显微镜或培养检出曲霉和/或血清GM指数＞0.5和/或支气管肺泡灌洗（BAL）中GM指数＞0.8，定义为可能患有侵袭性曲霉病。
目前市场上有多种用于诊断IPA的实验室检测方法，如真菌染色法、培养法、生物标志法和分子方法，对于任何一种检测方法，不同的厂商使用不同的技术，这些方法在诊断IPA的统计/分析值方面有所不同。在过去几年中，新型生物标志物以及新靶点用于检测重症或高危患者的侵袭性曲霉病（IA），为IPA的诊断提供了更可靠的依据。有几项研究调查了在血液病患者队列中检测IPA的临床和诊断试验。此外，较少的研究调查了ICU患者队列的临床体征和诊断方法。为了获得适当的治疗，从而获得积极的患者结果，即使在早期阶段也必须对IPA进行可靠的诊断。本综述总结了用于检测ICU患者不同（呼吸道）样本（图1）中IPAs的微生物非培养诊断工具，也包括COVID-19相关肺曲霉病（CAPA）。
一、检测IPA的非培养方法的诊断工具
1. （1,3）-β-D-葡聚糖：它与基于培养的方法相比，非基于培养的方法（例如GM和BDG）可减少鉴定IPA 所需的时间，尽管建议将血清和BAL样本中的GM作为早期检测IPA的可靠标志物，但EORTC/MSG对侵袭性真菌病（IFD）的共识定义将BDG列为真菌学证据，但不建议将其用于临床试验或定义IPA，因为BDG对任何侵袭性真菌疾病都没有特异性。对于BAL等其他样本，数据各不相同，也没有组织或联盟提出官方建议。BDG是大多数医学上重要真菌的主要细胞壁成分，在IFD期间，被释放到血液和组织中。隐球菌、接合菌（犁头霉、毛霉和根霉）和皮炎芽生菌除外，这些菌含量很少或不含BDG，因此，在感染这些真菌时检测不到葡聚糖。在2016年的一项荟萃分析中，Shi等人报告称，BAL BDG检测的灵敏度和特异性远低于血清BDG（分别为52%和58%），且具有高度异质性的局限性。研究队列包括接受和不接受免疫抑制的患者以及来自ICU和普通病房的患者，即使在排除异常研究并重新评估后，性能特征仍然很差（灵敏度为45%，特异性为62%）。
血清BDG在IFD诊断中具有很高的阴性预测值（NPV），但由于医源性污染、肝功能受损和诺卡菌感染等原因，可能会出现假阳性结果。Weinbergerova等人报道，中性粒细胞的绝对数量导致BDG对IPA的预测价值降低（p=0.099）。此外，BAL BDG对IPA的正确预测在BAL体积较大的病例中是降低的（p=0.085）。BAL细菌培养阳性对BAL BDG预测价值无明显影响，但念珠菌定植可能导致BAL BDG检测出现假性反应。此外，BDG检测方法在BAL中的重复性较差。因此，BAL采样的标准化至关重要，但难以实现。Boch等人在多中心前瞻性研究中纳入了患有血液学和非血液学基础疾病的ICU患者（n=44），同时对血清和BAL样本进行了一次常规培养、GM、BDG和曲霉菌特异性PCR分析。BDG的灵敏度为89%，但BAL的特异性较低，为31%，血清的特异性更低（26%）。然而，BAL BDG的NPV最高［91.7%（61.5-99.8）］，联合应用GM和BAL BDG的性能值相似［灵敏度88.9%（51.8-99.7），特异性31.4%（16.9-49.3），阳性预测值（PPV）25.0%（11.5-43.4）和NPV 91.7%（61.5-99.8）］。
不同制造商的BDG检测方法和临界值不同，不同检测方法之间的比较主要在Fungitell（USA）和Wako （Japan）检测之间进行，使用血清而不是BAL。此外，为了准确解读血清的Fungitell检测结果，制造商建议每周检测2-3次，而BAL采样不太可能采用这种方法。因此，单次BAL检查将是最有可能的操作方式，因此可能会影响灵敏度和PPV。如Prattes等人的研究，将BDG检测的临界值从80pg/mL修改为200pg/mL并没有显著提高特异性。尽管NPV良好，但BAL BDG的诊断价值似乎较低，而针对ICU环境的研究很少，因此，关于其作为独立测试或与其他检测相结合的诊断效用以及是否需要每周进行多次BAL BDG检测以准确解释等，存在许多歧义。目前，还没有临床研究探讨BAL BDG在儿童中的效用或用于治疗反应监测。
2. 半乳甘露聚糖：有大量的数据表明在BAL样本中使用不同的GM试验来鉴定IPA。目前有三种不同的检测方法，经典的GM检测方法有酶联免疫吸附试验（ELISA，EIA）、化学发光免疫测定（CLIA）和侧向层析测定（LFA）。
（1）痰液样本检测：痰样本GM检测对囊性纤维化患者具有特殊的适应症。在这种情况下，GM检测与其他检测结果（如总IgE、抗烟曲霉IgG和IgE、PCR）一起用于对曲霉病（支气管炎、定植、致敏）进行分类。目前关于血液病患者痰样本中GM的研究仅有1项，当临界值为1.2时，灵敏度为100%，BAL样本灵敏度为66.7%，血清样本为83.3%。特异性为62.2%。在一些研究中，对非免疫功能低下患者的痰样本进行了GM检测。在慢性肺曲霉病患者中，与临床诊断相比，痰样本GM的灵敏度为77%，特异性为71%。与标准培养和IgG阳性相比，当痰样本GM的临界值为0.71时，灵敏度和特异性分别为77%和78%。
在COPD患者中，支气管扩张患者的痰液中GM OD指数（为3.7）高于无支气管扩张患者（0.7）。痰液GM的检测结果与曲霉菌培养和PCR阳性结果相关。在另一项研究中，用培养、PCR和GM方法检测了过敏性支气管肺曲霉病（ABPA）（n=33）和慢性肺曲霉病（n=126）患者的痰液样本。培养阳性率为13%，以1.0、4.5、6.5为临界值，GM检测的灵敏度分别为87%、67%、69%，特异性分别为31%、65%、80%。在一项研究中使用了38例确诊/很可能曲霉病的免疫正常患者（74%的COPD或支气管扩张症）和89例非曲霉菌病患者的诱导痰样本，研究了PCR，培养，GM和LFA的诊断效用。痰液样本GM（OD指数＞2）和BAL GM（＞1.0）的灵敏度相似（分别为84%和86%），但痰样本中GM的特异度低于BAL（87% vs. 94%），LFA的特异性为91%，但灵敏度（63%）低于BAL GM。综上所述，在无法进行BAL采样的非免疫力低下患者中，痰液样本GM检测分析可能有助于曲霉菌病的诊断。到目前为止，还没有研究对不同公司的痰样本检测方法进行比较。
（2）BAL样本检测：GM检测在血液肿瘤患者BAL中的作用已被广泛研究。在一项荟萃分析中，当临界值为1.0时，灵敏度为85%，特异性为86%。更新后的 EORTC/MSG共识定义建议BAL样本中GM EIA（Platelia）的临界值为1.0，灵敏度为75-86%，特异性为94-95%。无论血液系统恶性肿瘤是否为基础疾病，灵敏度和特异性相似（灵敏度为85%/87%，特异性为91%/89%）。如果血清/血浆显示OD≥0.7，则BAL结果为≥0.8也应解释为相关结果。在包括188例患者（COPD 35例，免疫抑制153例）的大型研究中，当使用≥1.0的临界值时，灵敏度为77.4%，特异性为96.2%。COPD患者的灵敏度（66.7%）低于免疫抑制患者（87.8%），但两组患者的特异性几乎相同（94%-96%）。在COPD队列中，当使用≥0.5的临界值时，灵敏度提高至88.9%，但特异性降低至88.4%。在另一项研究中，1.25是最佳临界值，在COPD患者中灵敏度为90.9%，特异性为96.3%。建议临界值为0.8。
在流感相关曲霉病中，一项关于病例定义的提案自2020年起建议BAL临界值为1.0。在COVID-19患者中，在大流行开始时仅建议限制使用支气管镜检查，以保护BAL采样人员免受因气溶胶产生而导致的潜在感染风险，在这种情况下，这些患者首选其他样本，例如气管分泌物。对于这种样本，使用了≥1.0的临界值。此外，在机械通气患者中，微量误吸含GM的肠内营养可能是一个破坏因素。最后，气管分泌物的缺点是这种物质通常是黏液样的，通常需要试验前稀释。总体而言，机械通气患者的最佳临界值尚不明确。在一项针对32例使用机械通气的ICU患者的小型研究中，BAL和气管分泌物均表现出几乎相同的灵敏度和特异性，临界值≥1.0。2020年ECMM/ISHAM CAPA管理共识标准将GM-EIA定义为BALs单一临界值＞1.5，非支气管镜下BALs单一临界值＞4.5。如果存在多种物质，则临界值>1.2被归类为阳性。对于痰液，使用的值＞4.5。对241例COVID患者呼吸道样本的结果显示，当使用Koehler等人描述的临界值时，曲霉菌PCR和GM-EIA的灵敏度均为90%，特异性为77%。在一项气管分泌物与BAL进行比较的研究中，BAL使用≥1的临界值，气管分泌物使用≥2的临界值，结果灵敏度为75%，特异性为81.2%。在之前的一项研究中，同一研究小组定义的临界值为2.0,GM-EIA的灵敏度为57.1%，特异性为81.5%，GM侧向层析检测的灵敏度为60%，特异性为72.6%。
在一项CAPA研究中，对BAL样本的GM-EIA和GM-LFA进行了分析。所有研究样本均归类为疑似CAPA。BAL中的GM-LFA显示出与经典GM检测相似的诊断能力，但诊断CAPA的速度更快。与BAL培养相比，GM-LFA的灵敏度为60.6%、特异性为88.9%、PPV为71.4%，NPV为83.1%。GM-EIA对BAL样本的灵敏度为54.5%、特异性为91.7%、PPV为75%，NPV为81.5%。结果表明，在没有GM-EIA检测的情况下，GM-LFA可用作替代方法。在一项多中心研究中，比较了BAL GM和GM-LFA对IPA诊断的作用，共纳入296例患有各种疾病的患者（65%没有潜在的血液系统恶性肿瘤）。病例分为确诊（2例）、很可能（56例）、推测（30例）、可能（45例）和无IA（162例）。BAL样本的LFA检测显示出对IPA的可靠诊断性能，作者建议，无法快速进行GM检测的情况下，LFA可作为一种快速检测方法。LFA可以区分可能/推定或确诊的IA与无IA，曲线下面积（AUC）为0.865（95%CI 0.815-0.916），其中88例有IPA患者，162例无IPA患者。当ODI临界值为1.5时，灵敏度和特异性分别为74%和83%，当ODI临界值为1.0时，灵敏度为82%，但特异性较低，为73%。
Scharmann等人在一项研究中比较了两种LFA方法（Olm和IMMY）的诊断能力。纳入200例BAL样本，包括24例血液系统恶性肿瘤患者（12%）、22例实体肿瘤患者（11%）、34例实体器官移植患者（17%）、18例自身免疫性疾病患者（9%）、41例肺病患者（20.5%）、18例心脏病患者（9%）、39例其他疾病患者（19.5%）和4例无资料患者（2%）。检测后，所有样本均不能确定为IPA。两种检测方法的总体一致性为84%，其中IMMY的灵敏度和特异性分别为88.9%和55.1%，Olm的灵敏度和特异性分别为93.3%和46.1%。作者得出结论，在以印记标准为特征的异质性ICU患者中，LFA结果阴性可用于排除IPA。在2008年的一项研究中，Meersseman等人研究了GM在BAL和血清中的作用。共纳入110例ICU患者（恶性血液病、恶性肿瘤、实体器官移植、激素使用、免疫抑制治疗、Child C级肝硬化和HIV感染）。BAL液GM检测的灵敏度和特异性分别为88%和87%，而血清GM检测的灵敏度仅为47%。26例确诊病例中11例BAL培养和血清GM均为阴性，而BAL-GM均为阳性，作者讨论了BAL-GM检测在排除ICU内IA中的作用。
不同研究计算出的灵敏度/特异性之间存在明显差异。这是因为有些作者使用了经过调整的临界值，而有些作者则没有使用。从上述研究中可以得出一些结论： 首先，在GM检测中，BAL样本似乎比血清或血液更可靠。其次，BAL-GM检测法似乎具有最高的特异性/灵敏度，但目前还缺乏临床标准。因此，目前正在对 LFA等检测方法的效率进行研究，一些研究已经证明了其良好的诊断性能。
3. BAL中曲霉的PCR检测：PCR检测是临床最常用的检测方法之一。过去几年中，有多篇论文讨论了PCR检测不同患者群体BAL作为IPA诊断工具的性能。在对市售PCR检测的回顾中，发现不同患者组的灵敏度为68-94%，特异性为80-98%。Scharmann等人评估了三种PCR检测法在免疫功能低下患者中检测IPA，在这项研究中，不同制造商之间的差异明显。统计分析显示，灵敏度在60.0%-80.0%之间不等，特异性在73.2%- 96.7%，PPV在26.7%-70.0%，NPV在95.4%-96.8%。
4. 诊断方法的组合：随着CAPA的出现及其高死亡率，对IPA诊断的需求日益明显。一些研究公布了 GM和PCR检测法在非血液病患者中的联合诊断能力，与仅使用其中一种方法相比其诊断能力有了显著提高。一项针对63例CAPA患者进行BAL样本分析的研究评估了曲霉菌对通气患者的重要性，本研究采用了BAL-GM/血清-GM或BAL-PCR等检测方法。17%的患者被诊断出很可能患有CAPA，但并非所有患者都有IPA的EORTC/MSG宿主因素。PCR、BAL GM和血清GM的灵敏度(范围)分别为44%（13.7-78.8）、55.6%（21.2-86.3）和33.3%（7.5-70.1），特异性（范围）分别为94.3%（80.8-99.3）、94.3%（80.8-99.3）和97.1%（85.1-99.9）。对于15例筛查结果呈阳性（20%）但BAL GM结果呈阴性的患者中，有3例患者可以停止治疗。他们的结论是，曲霉菌培养、分子检测或抗原检测结果呈阳性并不一定表明患者感染了曲霉菌。一项针对101例ICU患者（大多为COVID-19或免疫力低下的非COVID-19患者）的BAL液的研究表明，BAL中的曲霉菌-PCR可提高BAL GM的诊断准确性。在ICU COVID-19组中，59例患者中15例被确诊为CAPA，在ICU非COVID-19组中，3例患者有推定的IPA，24例患者无推定的IPA。在免疫功能低下组中，13例患者被诊断为确诊/很可能的IA，而12名患者无IA。曲霉菌PCR灵敏度为64%（95%CI 47-79），特异性为99%（95%CI 93-100）。曲霉菌PCR灵敏度在ICU COVID-19患者中为40%（95%CI 19-64），在非COVID-19 ICU患者中为67%（95%CI 21-93），在免疫功能低下患者中为92% （95%CI 67-98）。
5. 新型生物标志物/靶点：近年来，已经发表了多项研究，探讨在危重病或高危患者中检测IA的新生物标志物或新靶点。对IPA发病机制的认识确定了纤毛上皮和先天免疫系统（包括常驻肺泡巨噬细胞和树突状细胞以及募集的炎症细胞）之间的相互作用，这是抵御吸入真菌孢子的第一道防线。这些细胞表达大量免疫受体，感知病原体基序并驱动控制先天和适应性免疫反应的细胞因子和趋化因子的分泌。问题是，细胞因子和趋化因子的特定炎症特征是否是IA所特有的。在一项研究中，将IPA患者BAL样本中的细胞因子谱与匹配的对照患者进行了比较，结果表明，一组肺泡细胞因子可以显著区分曲霉菌病例感染与未感染者之间的差异，此外，据报道，两组高度相关的细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A、IL-23和TNFα）在IPA病例和对照组之间存在差异表达。IL-8是效果最好的细胞因子，肺泡水平≥904pg/mL可预测IPA，其灵敏度（90%）、特异性（73%）和NPV（88%）均有所提高。这是首个包括BAL样本的同类研究。据报道，高水平的血清IL-8是IPA可靠的血液生物标志物。细胞因子在ICU的COVID-19患者中也发挥着重要作用，并且是发展为CAPA的风险因素。COVID-19中发生的细胞因子风暴非但没有激活针对可能的机会性感染的有效免疫反应，反而会导致免疫系统失调。在重症COVID-19中表达的细胞因子模式与重症IPA有一些相似之处（即TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10水平高，IFN-γ水平低）。到目前为止，尚不存在评估COVID-19患者细胞因子作为IPA诊断标志物的研究。
另一个初步显示出诊断IPA前景的生物标志物是三乙酰基镰刀菌素C（TAFC），TAFC是一种真菌特异性分子，由数量有限的霉菌（其中包括烟曲霉）产生，TAFC是一种分泌型铁载体。在一项包括15例IPA患者和29例对照的44份样本的研究中，TAFC鉴别很可能/确诊与非IPA的AUC为0.601（0.425-0.777，n.s）。联合TAFC后，BAL-GM的灵敏度从53%提高到73%（ODI GM临界值1.0），从73%提高到87%（ODI GM临界值0.5）。最近的另一项研究评估了现有的和新型生物标志物检测，结果表明，在38例确诊/很可能的IPA患者中，只有3例能检测到TAFC，这表明TAFC对IPA的诊断没有益处。要了解BAL中的TAFC是否有助于诊断IPA，还需要进一步的研究。TAFC也可在尿液中发现，测定了高危患者的尿TAFC（以肌酐为标准）。每例患者TAFC/肌酐诊断IPA的灵敏度、特异性、阳性似然比和阴性似然比（临界值≥3）分别为0.86、0.88、6.86和0.16。该方法显示了非侵入性采样的优势，大多数研究采用质谱法测定TAFC铁载体。质谱并不是在任何地方都可以使用，它需要专业知识和经验。然而，也表明可以通过干涉增强拉曼光谱快速测量TAFC。在疑似真菌性肺炎患者中，呼气中的曲霉菌次级代谢物特征可以识别IPA患者。在对64例疑似真菌性肺炎患者呼吸中的挥发性曲霉代谢物进行的评估中，由α-反式香柠檬烯、β-反式香柠檬烯、β-vatirenene样倍半萜或反式香叶基丙酮组成的二级代谢物特征识别出IPA患者的灵敏度为94%，特异性为93%。这些结果看起来很有希望，但迄今为止尚未得到证实。作为诊断平台，我们采用了气相色谱与质谱法。
另一种检测呼吸道分泌物中真菌病原体，如曲霉菌的方法是蛋白质组分析。BAL蛋白质组分析揭示了小鼠和人在IPA期间高度表达的宿主和真菌蛋白质。总之，共鉴定了16种在感染过程中特异性检测到的真菌蛋白，这些蛋白可能是未来有价值的生物标志物，迫切需要新的诊断标志物。临床医生希望有快速、易于执行、高灵敏度和特异性以及低成本的诊断检测。所有讨论的新型标志物都不能满足这些标准，另一个局限性是所述方法在大多数情况下需要高度的专业知识。
二、结论
考虑到所有因素，在ICU患者中可靠地检测IPA至关重要。根据EORTC/MSG标准、Blot等人、Bassetti等人和Schauwvlieghe等人的建议，不仅应满足宿主因素和临床体征，而且微生物诊断是IPA诊断的重要里程碑。各种研究对诊断工具的调查结果不同，导致观察到的患者群体不均匀，由于观察到的队列不同，对不同研究进行比较至关重要。本文，我们指出了最可靠的微生物非培养方法来检测ICU患者中的IPA。不同方法的结合和不同样本（BAL和血清样本）的调查似乎带来了最可靠的结果。血清中的BDG显示出较高的NPV，而BAL样本中的GM EIA对ICU患者显示出最高的特异性。血液肿瘤患者的临界值（≥1.0）已经确定，但其他患者人群的临界值并不明确。未来，不同患者群体的临界值可能会有所不同。GM LFA法特异性低于EIA法，但同时具有快速、易于操作等优点。使用市售PCR检测曲霉菌（尤其是AsperGenius）已被证明是评估最好的方法，在所有患者组中都显示出高特异性和NPV。到目前为止，新型生物标志物或靶点（例如细胞因子、TAFC或次级代谢物）尚未得到充分的临床研究，因此未来有必要对这些生物标志物进行评估。
编译节选自：《Diagnostics (basel)》. 2023 Aug; 13(16): 2718.
